来源：Electrochemical biosensor for ultrasensitive thrombin detection based on aptamer-modulated transcriptional inhibition of cell-free synthetic biology（Talanta）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
将适配体门控的无细胞合成生物学与电化学分析相结合，研究者开发了一种新型凝血酶检测策略。DNA模板中的适配体作为"分子开关"，靶标结合引起构象变化，空间位阻抑制T7 RNA聚合酶转录，RNA产量变化通过电极表面MB标记探针转化为电化学信号。该方法线性范围0.06 nM–6 μM，检出限0.032 nM，在20倍稀释人血清中回收率95.35%–105.20%。
研究背景
基于无细胞合成生物学的检测技术在检测小分子、核酸和蛋白质方面展现出独特优势——通过靶标响应的合成基因回路和开关元件精确触发转录过程，最终产生RNA分子作为报告信号。然而，目前报道的大多数无细胞生物传感器采用光信号（比色法、荧光法）作为读数方式。比色法依赖显色底物的视觉变化，操作简便但信号定量能力差；荧光法可实现高灵敏检测，但易受环境光、样品背景荧光和光漂白效应干扰。电化学检测技术具有成本可控、灵敏度高、微型化能力突出等优点，与无细胞系统精确的生物调控能力相结合，已用于开发多种靶标的生物传感器。本研究将适配体门控的无细胞转录系统与电化学分析联用，以凝血酶为模型靶标，构建了一种新型检测平台。
研究方法
2.1 材料与仪器
三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）购自MedChemExpress（MCE，中国上海）。6-巯基己醇（MCH）和氯化钾（KCl）购自阿拉丁生化科技有限公司（中国上海）。T7 RNA聚合酶（50 U/μL）、RNase抑制剂（40 U/μL）、NTP混合物（各25 mM，无核酸酶）、焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水、20 × 磷酸盐缓冲液（PBS）、核糖核酸酶H（RNase H）和无机焦磷酸酶（YIPP）均购自生工生物工程股份有限公司（中国上海）。牛血浆凝血酶购自Sigma-Aldrich（中国上海）。所有实验操作均使用无RNase水作为溶剂。除非另有说明，所有化学试剂均为分析纯。
所用DNA序列如下：
AP-Thr-t：5′-GTTAATTAGTATGTGGATGTAGGGGATGAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTCATCCCTATAGTGAGTCGTATTAGAA-3′
突变适配体：5′-GTTAATTAGTATGTGGATGTAGGGGATGAGTCCATAGAAGGGCAGGATGGGGTGACTCATCCCTATAGTGAGTCGTATTAGAA-3′
Prom-nt：5′-TTCTAATACGACTCACTATAGGGATG-3′
Out-nt：5′-CATCCCCTACATCCACATACTAATTAAC-3′
MB-DNA：5′-/5HS-SH/GTTAATTAGTATGTGGATGTAGGGGATGAG/3MB/-3′
BHQ1-DNA：5′-GTTAATTAGTATGTGGATGTAG/3IAbRQSp/-3′
FAM-DNA：5′-/5HEX/CTACATCCACATACTA-3′
经高效液相色谱（HPLC）纯化的寡核苷酸购自生工生物工程股份有限公司（中国上海）。电化学信号使用CHI620B电化学工作站（上海辰华仪器有限公司，中国上海）采集。所有电化学测量均采用常规三电极体系，包括3 mm金工作电极、铂对电极和Ag/AgCl参比电极（饱和KCl）。荧光使用日立F-4500荧光分光光度计（东京，日本）定量，设置如下：激发波长490 nm，发射扫描500至550 nm，狭缝宽度均为5 nm。
2.2 修饰电极的制备
金电极表面首先依次用0.3 μm和0.05 μm氧化铝浆抛光。用超纯水冲洗去除研磨残留物后，电极分别在无水乙醇和超纯水中超声处理，各2 min。最后，在H2SO4（0.5 M）中通过电位循环30次（−0.2至+1.6 V，vs. Ag/AgCl，100 mV/s）进行电化学活化，直至获得稳定的可逆氧化还原峰（ΔEp ≤ 100 mV）。预处理后，金电极用氮气吹干。
将MB标记DNA探针溶液（100 μM）溶于含TCEP（0.4 mM）的1 × PBS缓冲液（pH 7.4）中。溶液在37 °C避光孵育1 h以还原二硫键，然后用相同1 × PBS缓冲液（pH 7.4）稀释至100 nM。取10 μL稀释液滴加至金电极表面，37 °C避光孵育1 h，通过Au–S键形成实现固定。孵育后，电极用超纯水冲洗三次以去除未结合的探针。随后，用10 μL 2 mM MCH溶液在37 °C避光处理1.5 h以封闭非特异性吸附位点。电极最后用超纯水冲洗三次，高纯氮气吹干，储存备用。这些修饰步骤可提前完成，使检测实验在样品制备后即可立即开始。
2.3 凝血酶调控的无细胞RNA转录系统反应
DNA模板通过将启动子非模板链（Prom-nt）、输出区非模板链（Out-nt）和含适配体的模板链（AP-Thr-t）混合组装，各链终浓度均为1 μM，总体积25 μL，溶剂为含100 mM KCl的1 × 转录缓冲液。退火时，混合物加热至90 °C保持5 min，然后在实验室环境条件下逐渐冷却至室温，形成三链DNA模板（AP-Thr-Triplex）。
建立100 μL反应体系，含DNA模板（10 nM）和凝血酶（特定浓度），溶剂为含100 mM KCl的1 × 转录缓冲液。反应组分包括2.5 U/μL T7 RNA聚合酶、0.5 × 10⁻³ U/μL RNase抑制剂和2 mM NTPs（ATP/UTP/CTP/GTP）。混合物在37 °C预孵育2 h以实现凝血酶-适配体结合。随后加入无机焦磷酸酶（YIPP，1.35 × 10⁻³ U/μL）和2.5 U/μL T7 RNA聚合酶，转录反应在37 °C继续1.5 h。所得溶液标记为转录反应溶液。
2.4 荧光检测流程
荧光素标记的单链DNA（5′-FAM）和部分互补的淬灭剂标记单链DNA（3′-BHQ1）分别在1 × 转录缓冲液中稀释至10 μM，总体积25 μL。混合物加热至90 °C保持5 min，然后在实验室环境条件下逐渐冷却至室温，制备报告探针。转录反应溶液补充报告探针（终浓度100 nM）和RNase H（2000 U/mL）。在37 °C连续反应100 min后，立即使用荧光分光光度计测量荧光强度。
2.5 电化学检测流程
取10 μL转录反应溶液滴加至修饰电极上，37 °C避光孵育1.5 h。反应后，采用方波伏安法（SWV）在−0.1至−0.4 V（vs. Ag/AgCl）范围内进行电化学测量，电位增量0.001 V，振幅10 mV，频率50 Hz。所有电化学测试均在1 × PBS缓冲溶液中于25 °C进行。
研究结果
3.1 基于无细胞表达的电化学凝血酶检测传感器原理
方案1展示了用于凝血酶检测的无细胞电化学生物传感器的原理。该传感器采用MB-DNA探针作为信号转换元件。该探针通过其3′-末端的硫醇基共价固定至金电极表面，MB标记位于5′-末端。此外，预构建的无细胞转录系统提供T7 RNA聚合酶和NTP底物，能够在活细胞之外实现高效的体外RNA合成。同时，DNA模板中整合了凝血酶特异性适配体序列，作为靶标响应的分子开关。DNA模板中的适配体序列充当"分子开关"——只有当凝血酶结合适配体时，转录活性才会被调控，从而在靶标识别与信号放大之间建立直接联系。这种整合使靶标（凝血酶）能够通过适配体结合直接调节转录活性，从而将生物分子识别事件转化为可放大的信号输出。
在无凝血酶条件下，含适配体序列的DNA模板启动正常转录，产生大量RNA输出。这些RNA链与固定的DNA探针发生特异性部分杂交，诱导DNA探针从柔性单链构象转变为刚性双链构象。这种构象变化增加了MB标记与电极表面之间的距离，从而阻碍电子传递，产生低电化学信号。在凝血酶存在时，凝血酶特异性结合DNA模板启动子近端区域内的适配体。这种结合诱导构象变化，在空间上阻碍T7 RNA聚合酶与启动子的结合，从而抑制转录。在此条件下，仅产生少量RNA链，MB标记DNA探针保持柔性单链构象。该构象使MB标记保持靠近电极表面，实现高效电子传递，从而产生高电化学信号。因此，可根据信号变化幅度定量凝血酶浓度。
3.2 可行性研究
首先采用电化学阻抗谱（EIS）表征电极修饰过程（图1A）。奈奎斯特图显示了以下条件的响应：（a）裸金电极（bare Au）、（b）MB-DNA探针修饰后（Au/MB-DNA）、（c）MCH进一步封闭后（Au/MB-DNA/MCH）。结果显示，随着修饰层逐步构建于电极表面，阻抗值依次增加，证实DNA探针和MCH在电极界面上成功逐步组装。曲线d和e分别代表在有和无凝血酶条件下与转录系统产物反应后的EIS响应。在无靶标条件下观察到显著更高的电子转移电阻。这种阻抗增加归因于RNA产物（在靶标缺失时产生）与表面固定DNA探针之间的杂交。刚性RNA-DNA双链体的形成增加了电极表面的空间位阻和静电屏障，从而阻碍电子转移动力学。
采用荧光标记DNA报告探针进一步验证转录输出。该报告探针设计为荧光链和淬灭链组成的复合体。输出RNA链通过toehold介导的链置换结合淬灭链的toehold区域，置换荧光素标记链并恢复荧光。如图1B所示，系统在四种条件下进行了评估。在无凝血酶条件下，520 nm处（FAM的发射峰）观察到强荧光信号，表明转录和后续链置换高效进行。相反，添加凝血酶导致荧光强度急剧下降，表明凝血酶结合抑制转录并减少RNA产生。重要的是，在不含T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）的对照实验中，荧光信号可忽略不计，证实信号产生严格依赖于转录过程。此外，当使用突变适配体序列时，即使在凝血酶存在下，荧光强度仍与无凝血酶系统相当，表明适配体-凝血酶识别的破坏消除了转录抑制效应。综上，这些结果表明荧光信号由适配体介导的凝血酶识别及随之而来的转录活性调节特异性调控。荧光数据证实凝血酶有效抑制转录过程。在无凝血酶条件下，转录正常进行并产生输出RNA。
为将该机制转化为电化学传感平台，我们在不同条件下进行了SWV测量（图1C）。首先，在约−0.29 V（vs. Ag/AgCl）处观察到显著峰，确认MB-DNA成功固定并验证了电化学转导方案的可行性。相应地，凝血酶存在时的SWV电流显著高于其缺失时。电化学与荧光测量之间的一致性有力验证了该生物传感器的设计和工作机制。
3.3 实验条件优化
为提高传感器的检测性能和稳定性，我们系统优化了关键实验参数。优化过程中，DNA模板浓度固定为100 nM，除非另有说明。信号响应以有无靶标样品之间的电流差（ΔI）量化，定义为ΔI = I靶标 – I对照，其中I靶标为含6.0 nM靶标的电流，I对照为无靶标的电流。值得注意的是，ΔI越高表示电化学信号越高，这源于转录抑制和电极表面RNA杂交减少。
首先优化了MB-DNA报告探针的浓度（图2A），这是关键信号转导元件。探针浓度直接影响电极表面信号分子密度，从而决定ΔI的动态范围。ΔI值随探针浓度增加先升后降，在100 nM处达到峰值，随后在更高浓度下降。该结果可能归因于过量探针的非特异性吸附和分子间聚集增加，抬高了背景信号并压缩了有靶标与无靶标条件下的信号差异。因此，100 nM被确定为MB-DNA探针的最佳浓度。
随后优化了MB-DNA探针的修饰时间（图2B）。ΔI值随孵育时间逐渐增加，在1.5 h达到平台期，表明探针吸附已达平衡。固定时间延长至1.5 h以上未使ΔI显著增加或信号稳定性改善。因此，选择1.5 h作为后续实验的最佳固定时间。
接着优化转录反应，首先考察T7 RNA聚合酶浓度（图2C）。信号响应（ΔI）随酶浓度从0.5升至2.5 U/μL显著增加，此后趋于平台。该饱和现象表明2.5 U/μL足以占据所有可用启动子位点，酶浓度进一步增加不会增强转录抑制效应带来的信号差异。
随后优化了转录时间（图2D）。ΔI值随转录时间延长至1.5 h而增加，之后趋于稳定。在最佳条件下，转录反应在37 °C进行1.5 h足以产生足够的RNA输出用于后续检测。接着考察了转录温度的影响（图2E）。ΔI值在37 °C时达到最大，偏离该温度导致信号降低，这归因于T7 RNA聚合酶在该温度下具有最佳活性。适配体结合时间也经过优化（图2F），ΔI在2 h内逐渐增加后趋于平台。因此，37 °C、1.5 h转录时间和2 h适配体结合时间被确定为最佳条件。
3.4 分析性能
在最佳实验条件下，评估了所开发的无细胞电化学生物传感器对不同浓度凝血酶的检测性能（图3A）。SWV电流随凝血酶浓度从0.06 nM增加至6 μM而逐渐增大。如图3B所示，电流响应与凝血酶浓度的对数在0.06 nM至6 μM范围内呈良好线性关系。线性回归方程为I（μA）= 0.0789 lg c凝血酶（nM）+ 0.3567，相关系数R² = 0.996。检出限（LOD）计算为0.032 nM（S/N = 3），表明该方法具有超灵敏检测能力。
3.5 重现性、特异性与干扰评估
在靶标浓度为6.0 μM和6.0 nM条件下评估了该方法的重现性（图4A）。两种浓度下均获得可接受的相对标准偏差（RSD），表明传感器具有良好的批间重现性。为评估检测特异性，在6.0 nM凝血酶存在下分别测试了60.0 nM牛血清白蛋白（BSA）、胶质纤维酸性蛋白（Gfap）和肝素结合蛋白（HBP）（图4B）。结果显示，干扰蛋白存在时的SWV电流响应与凝血酶单独存在时无显著差异，表明该方法对凝血酶具有优异的选择性。适配体的高亲和力和特异性确保了传感器在复杂生物基质中也能有效区分靶标蛋白与干扰蛋白。
3.6 加标回收实验
在20倍稀释的人血清中进行加标回收实验，以评估传感器在复杂生物基质中的抗干扰能力。向20倍稀释人血清中添加不同浓度凝血酶，测得回收率为95.35%–105.20%，RSD值为2.32%–4.90%。这些结果证实该传感器在复杂生物基质中具有良好的准确性和可靠性。
讨论与解读
本研究构建了一种将适配体门控无细胞转录系统与电化学检测相结合的新型凝血酶定量检测生物传感器。该设计赋予两大分析优势：（1）凝血酶结合适配体的超高亲和力和特异性确保了精确的分子识别，有效减少复杂基质中异源蛋白的干扰；（2）适配体-凝血酶结合作为开关门控无细胞转录机制，产生的RNA输出驱动信号放大级联，实现痕量凝血酶的高灵敏检测。
【编译者解读】该方法巧妙之处在于将无细胞转录的"信号放大"能力与电化学的"定量精准"优势合二为一——适配体识别事件被转化为转录抑制程度，再通过RNA杂交调控电极表面电子传递，形成"分子开关-信号放大-电化学读出"的完整链条。相比传统光学生物传感器，避免了光漂白和背景荧光干扰。不过，当前方案依赖凝血酶适配体结合后对T7 RNA聚合酶的空间位阻效应，并非所有蛋白靶标都能有效阻断转录，通用性仍受适配体-聚合酶相对位置设计制约。从合成生物学应用角度看，该平台通过替换适配体序列即有望拓展至其他蛋白靶标，为无细胞体系在临床诊断中的落地提供了可行范式。
参考来源
Wang J. Electrochemical biosensor for ultrasensitive thrombin detection based on aptamer-modulated transcriptional inhibition of cell-free synthetic biology. Talanta, 2026. DOI: 10.1016/j.talanta.2026.129898
DOI: 10.1016/j.talanta.2026.129898