来源：Ultrasensitive fluorescent biosensor for prostate specific antigen detection based on magnetic separation and dual signal amplification via cell-free transcription coupled with DSN cleavage cycling（Sensors and Actuators B: Chemical）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
前列腺特异性抗原（PSA）是临床前列腺癌筛查的重要血清标志物。本研究构建了一种整合无细胞转录系统、DSN介导的循环扩增及磁珠背景抑制的新型荧光生物传感器。该传感器利用适配体识别触发链置换反应释放转录模板，经磁分离纯化后启动T7无细胞转录产生RNA，进而激活DSN酶循环剪切TaqMan探针实现信号放大。传感器在100 fg/mL至100 ng/mL范围内呈良好线性，检出限达35 fg/mL，并成功应用于实际血清样本分析。
研究背景
无细胞表达系统通过重构细胞的转录和翻译机器，可在体外实现基因转录和翻译，近年来已成为生物传感领域的新兴技术平台。与活细胞传感器相比，无细胞系统有效规避了对细胞活力、膜屏障和复杂培养条件的依赖。相较于ELISA和化学发光免疫分析等传统免疫学方法，无细胞系统具有组装灵活、响应快速、稳定性好和可冻干保存等显著优势。目前，无细胞传感系统已与荧光、比色和电化学等多种信号读出模式成功整合，在重金属离子、有机污染物、病原体和核酸生物标志物分析中展现出广阔应用前景。
然而，仅靠无细胞转录系统单级转录级联实现的信号放大仍然有限，难以满足临床样本中超低丰度靶标的高灵敏检测需求。因此，有必要引入额外的信号放大模块以进一步提升整体检测增益。双链特异性核酸酶（DSN）能够特异性切割DNA-RNA杂交双链中的DNA链，同时释放完整的RNA链参与下一轮切割循环，这一特性使其成为理想的信号放大工具。本研究将无细胞转录与DSN循环剪切相结合，构建双重信号放大策略，以实现PSA的超灵敏检测。
研究方法
2.1 材料与试剂
本研究所用寡核苷酸序列列于表1：高效液相色谱（HPLC）纯化的寡核苷酸购自生工生物工程（上海）股份有限公司。T7 RNA聚合酶（50 U/μL）、10×T7 RNA聚合酶缓冲液、RNase抑制剂（40 U/μL）、NTP混合物（各25 mM，无核酸酶）、20×磷酸盐缓冲液（PBS）、二硫苏糖醇（DTT）、甲胎蛋白（AFP）和焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水均购自同一供应商。链霉亲和素磁珠购自Promega公司（美国麦迪逊）。PSA购自碧云天生物技术有限公司（上海）。KCl购自国药集团化学试剂有限公司（上海）。免疫球蛋白G（IgG）、癌胚抗原（CEA）和牛血清白蛋白（BSA）购自Sigma-Aldrich有限公司（美国圣路易斯）。人血清白蛋白（HSA）购自上海源叶生物科技有限公司（上海）。整个实验使用无RNase水作为溶剂。所有化学试剂均为分析纯。
【数据】T7 RNA聚合酶：50 U/μL；RNase抑制剂：40 U/μL；NTP混合物：各25 mM；寡核苷酸纯度：HPLC级；试剂等级：分析纯
2.2 磁珠-适配体复合物的构建及靶标触发的释放
首先，将链霉亲和素修饰的磁珠与生物素修饰的适配体链（1 μM）混合，在37℃下充分孵育2小时，使特异性结合发生，形成磁珠-适配体复合物。用1×PBS缓冲液洗涤以去除未结合的适配体后，加入转录模板链（2 μM），在37℃下再孵育2小时，使模板与适配体高效杂交，构建三元磁珠-适配体-模板复合物。通过额外洗涤去除未结合的模板。最后，加入不同浓度的靶标PSA，混合物在37℃下孵育2小时。这一过程特异性触发适配体-靶标识别，从而将转录模板链释放到上清液中。磁分离后，小心收集上清液用于后续无细胞转录反应。
【数据】适配体浓度：1 μM；孵育温度：37℃；孵育时间：2 h；模板浓度：2 μM；洗涤缓冲液：1×PBS；PSA孵育温度：37℃；PSA孵育时间：2 h
2.3 无细胞转录扩增反应
取2.2节收集的150 μL上清液，加入30 μL扩增反应混合物，其中含有10 μL 10×T7 RNA聚合酶缓冲液、NTPs（10 mM）、T7 RNA聚合酶（10 U/μL）和RNase抑制剂（10 U/μL）。反应体系在37℃下孵育3小时进行转录扩增，获得大量具有特定结构的RNA。
【数据】上清液体积：150 μL；反应总体积：30 μL；10×T7 RNA聚合酶缓冲液：10 μL；NTPs：10 mM；T7 RNA聚合酶：10 U/μL；RNase抑制剂：10 U/μL；反应温度：37℃；反应时间：3 h
2.4 荧光信号检测
转录反应结束后，将反应溶液在65℃下加热10分钟，自然冷却。加入KCl（20 mM）、二硫苏糖醇（10 mM）、DSN酶（0.02 U/μL）和荧光基团-淬灭基团标记的TaqMan探针（20 μM）。混合物在避光条件下于适宜温度孵育2小时。随后使用日立F-4500荧光分光光度计（日立，日本）测量反应产物的荧光强度，激发波长设为625 nm（狭缝宽度：5 nm），发射光谱记录范围为645–700 nm。
【数据】热灭活温度：65℃；热灭活时间：10 min；KCl：20 mM；DTT：10 mM；DSN酶：0.02 U/μL；TaqMan探针：20 μM；避光孵育时间：2 h；激发波长：625 nm；狭缝宽度：5 nm；发射光谱范围：645–700 nm
2.5 实际样本中PSA的检测
本工作分析的血清样本（包括健康人血清样本和患者血清样本）均来自莆田学院附属医院。研究依照适用法律和机构方案执行，并获得了莆田学院附属医院伦理委员会的批准（2025321–3）。在实际样本检测前，血清样本用1×PBS缓冲液稀释10倍。
【数据】血清稀释倍数：10倍；稀释缓冲液：1×PBS；伦理批准号：2025321–3
研究结果
3.1 荧光生物传感器检测PSA的原理
方案1描述了基于靶标识别触发链置换、磁纯化、双级信号放大和荧光读出的传感机制。转录模板的部分核酸序列与PSA适配体的末端结构域互补，因此生物素化适配体和转录模板可以自发杂交，并进一步锚定在链霉亲和素修饰的磁珠上，形成稳定的三元复合物。当PSA存在时，适配体在靶标结合后优先折叠成特定的空间结构，破坏预先形成的适配体-模板双链体，并将游离转录模板释放到液相中。随后的磁分离将磁珠结合的残留复合物彻底保留在磁铁上，仅留下释放的模板在上清液中，从根本上消除了未反应的模板以降低背景信号。
收集的游离模板启动T7无细胞转录，产生大量靶RNA，完成第一轮转录信号放大。合成的RNA与完整的TaqMan探针（5′-荧光基团，3′-淬灭基团）杂交形成DNA-RNA异源双链体。DSN特异性切割杂交探针的DNA链，使荧光基团与淬灭基团分离产生可检测的荧光信号，而完整的RNA被再次释放，反复与新的完整TaqMan探针结合，启动连续循环切割，实现第二轮酶促循环扩增。在没有PSA的情况下，适配体保持与磁珠上的模板杂交；磁分离后上清液中不存在游离转录模板，既不发生转录也不发生DSN介导的切割，探针保持淬灭状态，背景荧光可忽略不计。在测试浓度范围内，荧光增量与PSA浓度的对数呈正相关，支持PSA的准确定量检测。
3.2 所提出生物传感器的可行性验证
首先利用Zeta电位表征磁珠-适配体-模板三元复合物的逐步组装过程。如图1(A)所示，裸磁珠的Zeta电位为−13.2 mV。通过生物素-链霉亲和素亲和作用固定带负电荷的生物素化PSA适配体后，电位移至−18.8 mV；进一步与带负电荷的转录模板杂交后，电位变得更负，达到−24.2 mV。电位逐步负移证实了适配体-模板复合物在磁珠上的成功固定，支持后续PSA触发的链置换过程。
随后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）以确认整个反应过程。如图1(B)所示，泳道1和2分别对应PSA适配体链和转录模板链的对照条带。泳道3显示适配体和模板链共孵育后的产物，模板条带上方出现明显条带，表明通过互补碱基配对形成了更高分子量的复合物。尽管可能仍有少量未反应的游离模板残留，但主要杂交条带的强荧光信号远远超过残留模板的弱信号，使残留模板的条带与背景无法区分。泳道4显示复合物与靶标PSA孵育后的产物，在泳道2中转录模板链的相同位置观察到单一明显条带，证实靶标成功触发链置换反应，竞争性地从复合物中释放游离模板链。泳道5显示不存在PSA时的反应结果，仅观察到对应于TaqMan探针的明显条带，因为转录模板在磁分离过程中被去除，阻止了后续转录和探针切割。泳道6显示存在PSA时的反应结果，未观察到明显条带，因为TaqMan探针在转录产生的RNA存在下被DSN切割。这些结果验证了生物传感器设计的可行性。
随后，通过荧光分析进一步验证了生物传感器的响应性能。在荧光实验中，用荧光基团和淬灭基团标记的TaqMan探针只能与特定结构的RNA杂交形成双链体，从而激活DSN核酸酶切割探针，使荧光基团与淬灭基团分离并恢复荧光信号。在图1(C)中，红线代表存在靶标PSA时检测到的荧光光谱（实验组），黑线代表不存在靶标时的光谱（空白对照组）。与空白对照相比，实验组表现出显著增强的荧光信号。这是因为靶标的存在触发了无细胞转录系统产生大量特定结构的RNA，导致TaqMan探针上的荧光基团和淬灭基团分离。这一结果进一步证实了靶标分子可以调控传感系统的转录输出，从而验证了生物传感器的响应机制。
【数据】裸磁珠Zeta电位：−13.2 mV；适配体固定后Zeta电位：−18.8 mV；模板杂交后Zeta电位：−24.2 mV；PAGE验证：6个泳道
3.3 实验条件优化
为实现最佳检测性能，对几个关键参数进行了优化。首先，利用荧光分析研究了转录模板与适配体的摩尔比对生物传感器性能的影响。如图2(A)所示，随着摩尔比的增加，实验组与空白对照组之间的荧光信号差（ΔI）持续增大，直到摩尔比为2时达到平台，表明适配体上的结合位点已完全饱和。因此，在后续实验中转录模板与适配体的摩尔比设定为2。
接下来，考察了T7 RNA聚合酶浓度对系统性能的影响。如图2(B)所示，ΔI随酶浓度增加逐渐增大，在200 U时达到平台，表明转录效率已达到最大化。据此，后续实验使用200 U的T7 RNA聚合酶。
TaqMan探针作为直接信号输出载体，其浓度直接影响RNA杂交效率以及DSN酶切割速率。如图2(C)所示，ΔI随探针浓度急剧增加，在20 μM时达到平台，表明RNA捕获已趋于饱和。因此，20 μM被确定为最佳探针浓度。
此外，DSN酶量是影响信号放大的关键因素。如图2(D)所示，ΔI逐渐增加，在2.0 U时达到峰值，超过该值后未见进一步增强；因此选择2.0 U的DSN酶。
最后，对DSN反应时间进行了优化。图2(E)展示了ΔI随时间的动态变化。ΔI稳步增加，在2.0小时后趋于平稳，表明切割循环已完成。因此，2.0小时被确定为最佳反应时间。
【数据】最佳模板与适配体摩尔比：2；最佳T7 RNA聚合酶用量：200 U；最佳TaqMan探针浓度：20 μM；最佳DSN酶量：2.0 U；最佳DSN反应时间：2.0 h
3.4 所提出生物传感器的性能表征
在优化实验条件下，使用所构建的生物传感器检测不同浓度的靶标PSA。如图3(A)所示，ΔI在100 fg/mL至100 ng/mL的PSA浓度范围内呈正相关。校准曲线如图3(B)所示，线性回归方程为：ΔI = 1615.01 + 391.15 lg C靶标（ng/mL），R² = 0.9989。其中，C靶标代表分析物浓度，ΔI代表荧光信号差，计算方式为实验组荧光强度减去空白对照组荧光强度。
【数据】线性范围：100 fg/mL–100 ng/mL；线性回归方程：ΔI = 1615.01 + 391.15 lg C靶标（ng/mL）；R² = 0.9989；检出限：35 fg/mL（原文摘要数据）
讨论与解读
本研究通过整合磁分离、适配体介导的链置换、无细胞转录和DSN依赖性循环切割，构建了用于PSA检测的超灵敏荧光生物传感器，实现了双重信号放大。磁纯化有效去除非特异性结合的冗余生物分子和未反应的核酸，从根本上抑制了背景噪声；T7转录与DSN循环的组合实现了两步级联放大，提升了检测灵敏度。在优化实验条件下，传感器表现出100 fg/mL至100 ng/mL的宽线性范围和35 fg/mL的超低检出限。对常见血清干扰蛋白的良好特异性以及在临床血清样本中的可靠定量性能均得到成功验证。值得注意的是，模块化设计允许仅通过替换适配体序列即可实现便捷的靶标转换，赋予该策略对多种蛋白质生物标志物的优异通用性。尽管整个流程涉及孵育和反应步骤，但实际动手操作时间仍然较短。此外，无需复杂的纳米材料合成、繁琐的等温扩增操作或精密的变温循环设备，该传感平台为前列腺癌的早期辅助诊断和高精度定量提供了有前景的分析工具。
【编译者解读】该研究在传感器设计上的精妙之处在于将无细胞转录的线性放大与DSN的指数式循环切割串联，形成两级信号增强，突破了单一无细胞系统放大倍数有限的瓶颈。磁分离策略从源头消除背景干扰，是获得35 fg/mL超低检出限的关键保障。从合成生物学应用角度看，这种"适配体可替换"的模块化架构使平台具备良好的通用性——只需更换适配体序列即可适配不同蛋白标志物检测。不过，多步孵育流程（累计约10小时以上）可能限制其即时检测场景的适用性，未来若能在缩短反应时间与保持灵敏度之间取得平衡，将更具转化价值。
参考来源
期刊：Sensors and Actuators B: Chemical, 2026
DOI: 10.1016/j.snb.2026.140756
DOI: 10.1016/j.snb.2026.140756