来源：Streamlining cell-free protein synthesis biosensors for use in human fluids: In situ RNase inhibitor production during extract preparation（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
细胞-free蛋白合成（CFPS）生物传感器虽可快速检测人体体液中的生物标志物，但体液中高浓度RNase会降解mRNA和tRNA，导致报告蛋白无法表达。商业RNase抑制剂成本占大肠杆菌裂解液CFPS传感器总成本的90%以上。本研究通过在大肠杆菌发酵阶段共表达鼠源RNase抑制剂（m-RI）与GroEL/ES伴侣蛋白，在24°C低温条件下制备出具备RNase抑制活性的细胞提取物，将CFPS传感器总成本降低约90%，并在唾液、血清和尿液三种人体体液中验证了其功能。
研究背景
人体体液中广泛存在多种RNase，它们会降解mRNA和tRNA，从而阻断报告蛋白的表达，这是CFPS生物传感器在临床样本中推广应用的主要障碍。向CFPS体系中添加RNase抑制剂虽可缓解该问题，但商业RNase抑制剂试剂成本约占自制大肠杆菌裂解液CFPS总成本的90%，严重制约了CFPS传感器的低成本应用。CFPS平台具有开放、快速、高产和灵活等优点，可生产治疗性蛋白、膜蛋白、病毒样颗粒、抗体及生物传感器等多种产品，且不受细胞活力和膜转运的限制。然而，相较于基于纯化组分的PURE系统（成本为裂解液体系的10–30倍），大肠杆菌裂解液体系性价比更高。本研究旨在通过在大肠杆菌提取物制备阶段直接生产RNase抑制剂，消除额外添加高成本试剂的需求，从而精简CFPS传感器在人体体液中的应用流程。
研究方法
2.1 提取物制备
m-RI序列来源于Protein Data Bank（PDB ID: 3TSR），经密码子优化以适于大肠杆菌表达，由Twist Bioscience（San Francisco, CA）构建于高拷贝pTwist载体中，以氨苄青霉素为抗生素抗性标记。pTwist m-RI基因通过化学转化法导入BL21-Star（DE3）（Invitrogen, Carlsbad, CA）感受态细胞中，该细胞或仅含pTwist m-RI质粒（m-RI/Normal提取物），或预先化学转化了GroEL/ES质粒（m-RI + pOFX提取物，为D.M. Kim惠赠）。大肠杆菌细胞提取物的制备参照先前报道的方法[39,40]并做了部分修改以提高RNase抑制活性。在玻璃细胞培养管中，将5 ml含氨苄青霉素（用于m-RI提取物）或氨苄青霉素和壮观霉素（用于m-RI + pOFX提取物）的LB培养基接种后于37°C、280 RPM过夜培养。随后将细胞转接至装有100 ml 2xYT培养基（16 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物、5 g/L氯化钠）的500 ml带挡板摇瓶中，于37°C、280 RPM培养约5小时。待OD600达到约2.0后，将细胞培养物加入装有900 ml新鲜2xYT培养基的2.5 L Tunair带挡板摇瓶（IBI scientific, IA）中，转移至另一台摇床培养箱，于15–37°C下继续培养。当OD600达到0.5–0.6时，加入1 ml 1 M异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导。细胞培养物在以下三种条件下继续培养：不添加DTT（No DTT）；在诱导时补充DTT（终浓度12 mM）（simultaneous DTT/IPTG）；或在OD600约0.9时补充DTT（终浓度12 mM）（delayed DTT）。所有细胞培养物在对数生长期末期（OD600在1.2–3.5之间，取决于培养温度和DTT含量）收获，于4°C、8000 RCF离心20分钟。随后每克湿细胞用10 ml冰冷的缓冲液A洗涤，再次于4°C、8000 RCF离心20分钟。缓冲液A含60 mM谷氨酸钾、10 mM Tris、14 mM醋酸镁和1 mM DTT（最终pH调至8.2），使用前经高压灭菌。细胞再次以每克湿细胞0.7 ml预冷缓冲液A重悬，通过French press匀浆器（Avestin, Ottawa, Canada）在21,000 PSI下破碎三次，破碎间隔设有冷却时间以避免提取物过热。最后，细胞碎片通过4°C、12,000 RCF离心30分钟与提取物（上层部分）分离，上清液小心吸取后分装为100–300 µl体积，液氮速冻后保存于−80°C，供CFPS反应单次使用。
【数据】菌株：BL21-Star (DE3)；质粒：pTwist m-RI（氨苄青霉素抗性）、pOFX（GroEL/ES，壮观霉素抗性）；培养基：LB（5 ml过夜）、2xYT（16 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物、5 g/L氯化钠）；温度：37°C（预培养）、15–37°C（诱导后培养）；转速：280 RPM；诱导剂：1 mM IPTG（OD600 0.5–0.6时加入）；DTT条件：无DTT/诱导时加12 mM/OD600约0.9时加12 mM；收获OD600：1.2–3.5；离心：8000 RCF 20 min（4°C，两次）；破碎：French press 21,000 PSI三次；终离心：12,000 RCF 30 min（4°C）；保存：液氮速冻，−80°C
2.2 细胞-free蛋白合成
偶联转录/翻译的CFPS反应在2 ml微量离心管（GeneMate, BioExpress）中进行，反应体积50 µl，条件为37°C、280 RPM、3小时（除非另有说明），采用PANOx-SP系统为反应供能，具体参照先前报道[41,42]。所有CFPS反应包含25%（v/v）大肠杆菌提取物、25%（v/v）小分子母液、16 mM谷氨酸镁、2 nM PY71-sfGFP DNA质粒，其余体积用去离子水补足至50 µl。如先前报道[40]，小分子母液含1 mM 1,4-二氨基丁烷、40 mM磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）、175 mM谷氨酸钾、2.7 mM草酸钾、1.5 mM亚精胺、10 mM谷氨酸铵、0.33 mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、0.27 mM辅酶A（CoA）、1.2 mM ATP、0.86 mM CTP、0.86 mM GTP、0.86 mM UTP、0.17 mM亚叶酸，以及除谷氨酸外（谷氨酸以谷氨酸镁形式单独添加）所有天然氨基酸各2 mM。除另有说明外，所有化学品购自Cayman Chemical Company（Ann Arbor, MI）。PY71 sfGFP质粒的设计与构建参照先前报道[42]，转化至XL1-Blue化学感受态细胞（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）中。为制备DNA质粒，细胞在200 ml TB培养基（24 g/L酵母提取物、12 g/L胰蛋白胨、4 ml/L甘油）中于37°C、280 RPM过夜培养。使用QIAGEN Plasmid Maxi Kit（Valencia, CA）按制造商说明书提取质粒。对于额外添加T7 RNA聚合酶的CFPS反应，按前述相同组成和反应条件加入1%（v/v）T7 RNA聚合酶（来自HiScribe T7 High Yield RNA Synthetase Kit, NEB, Ipswich, MA）。CFPS反应中sfGFP表达产量通过荧光读数定量。将20 µl CFPS反应液与45 µl去离子水混合于Costar®黑色96孔板（Corning Inc., Corning, NY）的孔中，在480/510 nm激发/发射波长下用BioTek Synergy MX微板阅读器（Biotek Instruments, Winooski, VT）测量荧光。sfGFP产量以相对荧光单位（RFU）报告，或相对于指定参考反应的归一化sfGFP表达量表示，或以µg/ml表示（通过将RFU转换为C14放射性标记sfGFP确定的浓度，方法参照先前报道[43]）。使用NuPAGE 10% Bis-Tris凝胶（Invitrogen, Carlsbad, CA）在还原条件下按制造商说明书（略作修改）观察提取物中表达的蛋白。商业m-RI（NEB, Ipswich, MA）作为m-RI对照，Color Prestained Protein Standard广谱蛋白标准（NEB-Cat.# P7719S, Ipswich, MA）作为标准蛋白标记。所有大肠杆菌细胞在诱导后于24°C培养，细胞提取物按前述方法制备。提取物制备完成后，每个细胞裂解液在离心前或离心后经50倍稀释后进行蛋白凝胶电泳。使用Coomassie SimplyBlue™ SafeStain（Invitrogen, Carlsbad, CA）显色蛋白条带。
【数据】反应体系：50 µl；提取物比例：25%（v/v）；小分子母液：25%（v/v）；谷氨酸镁：16 mM；sfGFP质粒：2 nM；温度：37°C；转速：280 RPM；时间：3 h；T7 RNA聚合酶添加量：1%（v/v）；荧光检测：480/510 nm激发/发射
2.3 m-RI提取物RNase抑制活性的评估
使用RNase Alert™ Lab Test Kit（Cat.#: AM1964, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA）按制造商说明书检测CFPS反应及唾液、血清和尿液三种人体体液的总RNase活性（n = 3）。据制造商说明，该检测基于一种修饰的RNA寡核苷酸底物，该底物在被多种RNase（包括RNase A、RNase T1、RNase I、微球菌核酸酶和S1核酸酶）切割后，可在490/520 nm（激发/发射）发出荧光信号。试剂盒附带标准RNase A（0.01 U/ml），用于制作校准曲线并以等效RNase A活性每升测试样品（Unit equivalent RNase A/L）报告样品的总RNase活性。作为商业RNase活性检测试剂盒的替代方案，为显著降低检测成本，采用生产sfGFP的CFPS反应来测定m-RI对外源添加RNase A（10 mg/ml储存浓度，随QIAGEN Plasmid Maxi Kit（Valencia, CA）提供）的抑制活性，CFPS反应中RNase A终浓度最高达400 ng/ml。CFPS反应按前述方法组装并作部分修改。所有CFPS反应（50 µl反应体积）中使用25%（v/v）提取物，其中30%（3.75 µl）、50%（6.25 µl）或70%（8.75 µl）为m-RI提取物，其余用普通BL21-Star（DE3）提取物补足至总提取物25%（50 µl反应中为12.5 µl）。37°C反应3小时后按前述方法测量sfGFP表达荧光值，并归一化至未添加外源RNase A的CFPS反应的sfGFP表达量。
【数据】RNase活性检测：490/520 nm激发/发射；标准RNase A：0.01 U/ml；外源RNase A终浓度：最高400 ng/ml（储存浓度10 mg/ml）；m-RI提取物占比：30%/50%/70%；总提取物：25%（v/v）（12.5 µl/50 µl反应）；反应条件：37°C、3 h
2.4 m-RI提取物在冻干CFPS反应中对三种人体体液的RNase抑制活性
评估了两种性能最佳的m-RI提取物对0–100%（v/v）三种人体体液（唾液、血清和尿液）的RNase抑制活性。CFPS反应（50 µl反应）含25%（v/v）总提取物，按前述方法组装，其中含12.5%（v/v）m-RI提取物（每反应6.25 µl）和12.5%（v/v）普通BL21-Star（DE3）提取物（5
【数据】总提取物：25%（v/v）；m-RI提取物：12.5%（v/v）（6.25 µl/50 µl反应）；普通提取物：12.5%（v/v）；人体体液比例：0–100%（v/v）
研究结果
3.1 RNase添加对CFPS蛋白产量的影响量化
本研究的动因是减轻RNase存在时CFPS蛋白表达能力的损失——这是CFPS传感器在人体体液中进行生物检测时的常见问题。为更好地理解和量化这一影响，向CFPS反应中添加递增量的RNase A（QIAGEN, Valencia, CA），终浓度最高达100 ng/ml。如图1所示，生产sfGFP的CFPS反应在澄清CFPS提取物中携带的内源大肠杆菌RNases[44]之外，还能耐受约10 ng/ml的外源添加RNase A。然而，当外源RNase A浓度达到20 ng/ml时，CFPS蛋白产量急剧下降（降幅超过85%）；当浓度达到60 ng/ml时，产量已无法检测。
【数据】RNase A耐受阈值：约10 ng/ml；20 ng/ml时产量下降>85%；60 ng/ml时产量不可检测
3.2 m-RI在大肠杆菌提取物中的过表达及RNase抑制活性
CFPS系统的开放性允许按需直接添加小分子、核酸和蛋白质（如RNase抑制剂）。然而，相较于单独添加纯化的酶或伴侣蛋白，更经济的替代方案是在用于制备CFPS提取物的大肠杆菌发酵过程中诱导其表达[45]。该方法已成功用于供给T7 RNA聚合酶[46,47]、DsbC二硫键异构酶[48,49]、GroEL/ES折叠伴侣蛋白[48,50]，以及非天然氨基酸掺入所需的tRNA/氨酰-tRNA合成酶正交体系[42,43,51,52]。但迄今尚无在CFPS提取物中生产RNase抑制剂的报道。RNase抑制剂是CFPS传感器在人体体液中发挥功能所必需的试剂，其商业形式（鼠源RNase抑制剂，NEB-Cat.# M0314S, Ipswich, MA）的成本约为其他大肠杆菌裂解液CFPS试剂总成本的9倍[3]。作者近期报道了在CFPS反应中生产m-RI及其在第二个生物传感CFPS反应中提供所需m-RI的潜力，可将m-RI成本降低[3]。然而，将m-RI生产整合到提取物制备流程中将消除这一额外步骤，精简CFPS传感器在人体体液中的应用，同时进一步降低m-RI成本。为此，m-RI按方法部分所述克隆至pTwist质粒中，并在用于制备CFPS提取物的BL21-Star（DE3）大肠杆菌发酵过程中表达。先前研究报道，较低的发酵温度、向发酵培养基中添加DTT以及过表达蛋白折叠伴侣蛋白可提高m-RI在大肠杆菌中表达时的活性[32–34]。因此，在细胞提取物制备发酵中表达m-RI的初步尝试分别在37°C或24°C、存在或不存在12 mM DTT的条件下进行。然而，所得提取物的m-RI活性无法检测（图S1，补充材料）。因此，在用于制备CFPS提取物的BL21-Star（DE3）大肠杆菌发酵过程中，将GroEL/ES与m-RI共表达（m-RI + pOFX），具体方法如前所述。此外，发酵温度降至24°C和15°C，以减缓蛋白合成速度并促进新生蛋白正确折叠[53,54]。同时，鉴于m-RI含有30个半胱氨酸残基且必须保持还原态才能发挥正常活性，还评估了在诱导时（simultaneous DTT/IPTG）或诱导后OD600约0.9时（delayed DTT）向发酵培养基中添加12 mM DTT的效果。与预期一致[55]，15°C发酵相较于24°C生长动力学更慢，收获时细胞密度降低约50%（图S2，补充材料）。此外，DTT存在时细胞生长更慢。虽然这些条件被报道为m-RI表达的最适条件[32,33]，但它们并非制备CFPS用大肠杆菌提取物的最优条件，所得提取物的CFPS蛋白生产能力有所降低（图S3，补充材料）。这一结果符合预期——大肠杆菌在生长缓慢期酶和辅因子浓度较低[56]，因此所得提取物中这些成分的浓度预计较低。此外，这些提取物中T7 RNA聚合酶（CFPS转录所必需）水平预计较低，因为GroEL、GroES和m-RI与T7 RNA聚合酶共表达，竞争了可用于T7 RNA聚合酶表达的细胞资源。向这些提取物中额外添加纯化的T7 RNA聚合酶（1%（v/v），HiScribe™ Kit, NEB, Ipswich, MA）后CFPS产量提高，证实了这一推断（图S4，补充材料）。基于这些结果，作者假设可将含m-RI的提取物与不含m-RI且按优化提取物制备条件制备的提取物（BL21-Star（DE3）于37°C培养、不添加DTT、无GroEL/ES、无m-RI；以下简称"普通提取物"）混合，以同时获得显著的CFPS产量和RNase抑制活性。初步测试不同提取物混合比例（改变m-RI提取物和普通提取物的百分比）的实验表明，至少需要30%普通提取物和至少30% m-RI提取物才能同时获得显著的CFPS产量和RNase抑制活性（图S5，补充材料）。因此，将上述一系列条件制备的m-RI提取物（24°C或15°C、无DTT、延迟添加12 mM DTT、诱导时添加12 mM DTT；共表达GroEL/ES）与普通提取物按0/100、30/70、50/50和70/30的比例混合，在添加递增浓度RNase A的条件下评估CFPS生产能力（见图2A）。选择RNase A而非人体体液，是为了消除不同个体之间以及同一人一天中不同时间可能存在的样本变异性[57]。本研究的一个关键结果（图2）是：在24°C发酵、不添加DTT、共表达GroEL/ES条件下制备的m-RI提取物，在m-RI/普通提取物组合中面对400 ng/ml RNase A时保持高CFPS生产能力的效果最佳（图2B）。值得注意的是，其他m-RI提取物制备条件（15°C、不同时间点添加DTT）在应对高浓度RNase A时也能保持相当的CFPS产量（图2C–G）。事实上，最关键的因素似乎是GroEL/ES的共表达——未共表达GroEL/ES的含m-RI提取物未观察到任何RNase抑制活性（图S1）。此外，虽然图2显示含GroEL/ES的提取物对许多应用场景具有足够的RNase抑制活性，但SDS-PAGE分析揭示发酵过程中产生的m-RI部分以不溶形式存在，并未进入最终用于CFPS的提取物中（图S6，补充材料）。这表明在本文工作范围之外，未来的优化研究有可能获得更高的提取物RNase抑制活性。最后，基于图2的结果，对于大多数测试条件，50/50的m-RI提取物与普通提取物比例是在不同RNase A浓度下保持CFPS活性的最佳比例。因此，后续人体体液研究采用50/50比例的m-RI/普通提取物组合，其中m-RI提取物在24°C、共表达GroEL/ES但不添加DTT的条件下制备。该条件相较于其他条件具有最高的RNase抑制活性，且最为便捷（例如室温发酵且无需添加DTT）。
【数据】发酵温度：24°C/15°C；DTT条件：无/延迟12 mM/诱导时12 mM；GroEL/ES共表达：是/否；m-RI/普通提取物比例：0/100、30/70、50/50、70/30；RNase A最高浓度：400 ng/ml；15°C较24°C细胞密度降低约50%
3.3 m-RI + pOFX提取物在含高达100%人体体液（唾液、血清和尿液）的CFPS反应中的RNase抑制活性
图3A报告了上述最优50/50 m-RI/普通提取物组合在含不同比例人体体液时的CFPS活性保持情况。
【数据】m-RI/普通提取物比例：50/50；人体体液比例：0–100%（v/v）
3.4 冻干CFPS传感器在人体体液中的谷氨酸检测应用
将上述最优提取物组合与其他CFPS试剂混合、冻干后，用不同比例人体体液复水，评估其维持蛋白表达的能力。随后将该冻干试剂用于基于唾液的谷氨酸CFPS生物传感器检测。图4显示了在去离子水和30%唾液中，外源添加谷氨酸浓度最高达200 µM时谷氨酸CFPS生物传感器的响应。
【数据】谷氨酸浓度范围：0–200 µM；唾液比例：30%；反应条件：37°C、3 h
【数据】原文未详述
讨论与解读
RNase抑制剂是CFPS生物传感器在检测含RNase样本（如人体体液）时的关键试剂。然而，RNase抑制剂是大肠杆菌裂解液CFPS传感器中最昂贵的试剂，使试剂成本增加约900%[3]。本研究首次报道了将m-RI的生产和优化整合到大肠杆菌裂解液制备流程中，从根本上消除了RNase抑制剂的额外成本。制备含m-RI提取物的最优发酵条件确定为24°C并与GroEL/ES折叠伴侣蛋白共表达。为同时实现高产出CFPS和RNase抑制活性，50/50的m-RI/普通提取物混合比例被确定为最佳条件。该提取物与其他CFPS试剂混合、冻干以长期储存，并评估了其在三种人体体液（唾液、血清和尿液）中的活性。最后，该提取物被用于实现人唾液样本中谷氨酸的CFPS生物传感。本研究开发的含m-RI的CFPS提取物有望将CFPS成本降低约90%，为在人体体液中低成本、精简地检测多种生物标志物铺平道路。
编译者解读：本研究的技术路线颇具巧思——将高成本的RNase抑制剂从"外源添加试剂"转变为"提取物内源组分"，在发酵阶段就完成功能蛋白的生产，省去了单独纯化和添加步骤。方法选择上，作者系统评估了温度、DTT添加时机和伴侣蛋白共表达三个变量，最终锁定24°C+GroEL/ES共表达的组合，体现了对蛋白折叠动力学的细致考量。50/50混合策略尤为务实——既保留了RNase抑制活性，又不牺牲CFPS产量，这种"功能互补"思维在合成生物学工具开发中具有借鉴价值。值得关注的是，该策略不仅降低了成本，还简化了操作流程——冻干后可直接用体液复水，向"样本进、结果出"的床旁检测迈近一步。局限在于m-RI在发酵中存在部分不可溶表达，未来或可通过融合标签或共表达策略进一步提高活性组分占比。
参考来源
Soltani M. Streamlining cell-free protein synthesis biosensors for use in human fluids: In situ RNase inhibitor production during extract preparation. Biochemical Engineering Journal, 2022. DOI: 10.1016/j.bej.2021.108158
DOI: 10.1016/j.bej.2021.108158