来源：Biosensor-guided indexing of genome evolution for boosting microbial chemical synthesis（Trends in Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
微生物细胞工厂的构建长期面临两大瓶颈：随机突变库中高产菌株的筛选效率低下，以及工程改造后残留抗生素标记带来的安全隐患。本研究提出BRIDGE技术（Biosensor-guided indexing of genome evolution），将双功能生物传感器与无标记转座子突变系统相结合，在恶臭假单胞菌中实现了原儿茶酸（PCA）和顺,顺-粘康酸（ccMA）的高效生产。仅筛选15个突变株即获得产PCA达4.67 g/L的高产菌株，展示了该策略在加速菌株工程方面的巨大潜力。该技术成熟度评估为TRL 4（实验室环境组件验证）。
研究背景
微生物合成化学品和天然产物正成为传统植物提取和石油基路线的替代方案。微生物细胞工厂的开发通常基于基因工程，聚焦于操纵细胞代谢以最大化化学品的滴度、产量和生产率。随着基因工程工具的发展，人们对微生物代谢网络及其调控机制的理解取得显著进展。传统方法依赖蛋白质工程、代谢途径设计与优化，以及基于启动子、核糖体结合位点和转录因子等遗传元件的基因模块化来构建高效微生物细胞工厂。
在创建微生物细胞工厂的"设计-构建-测试-学习"循环中，理性设计已产生大量代谢网络模型和设计策略。然而，微生物代谢网络中存在的众多未知因素可能影响目标表型，识别所有相关遗传靶点并精确调整和协调多个代谢靶点仍是一项艰巨挑战，理性方法仍面临产量次优的局限。基于移动遗传元件的基因组工程已获得广泛关注，但如何高效筛选最优突变株并消除残留选择标记仍是关键难题。
研究方法
试剂与培养基
Luria Bertani（LB）培养基用于培养恶臭假单胞菌S12和大肠杆菌。为维持不同质粒，相应在培养基中添加卡那霉素（50 mg/L）和四环素（12.5 mg/L）。含四环素（12.5 mg/L）和庆大霉素（24 mg/L）的LB平板用于筛选高产恶臭假单胞菌菌株。所有限制性内切酶和分子克隆试剂购自New England Biolabs（美国马萨诸塞州伊普斯威奇）。抗生素和寡核苷酸购自Sangon（中国上海）。所有其他化学品购自Aladdin或Macklin（中国上海），或另有说明。
【数据】卡那霉素：50 mg/L；四环素：12.5 mg/L；庆大霉素：24 mg/L；菌株：P. putida S12、E. coli
菌株与质粒
选择恶臭假单胞菌S12作为化学品生产的底盘菌株。大肠杆菌Top10用于常规质粒克隆。本研究所用寡核苷酸列于补充表S1。所有含R6K复制子的转座质粒在大肠杆菌DH5α λpir中构建。对于恶臭假单胞菌S12中的基因敲除，使用质粒pK18mobsacB，通过重叠延伸PCR获得的靶基因约500 bp同源臂插入pK18mobsacB的EcoRI和HindIII位点之间。用于删除pcaHG基因的所得自杀质粒命名为pK18mobsacB-pcaHG。
使用Phusion高保真DNA聚合酶（New England Biolabs）分别从蜡状芽孢杆菌ATCC 14579（GenBank：AE016877.1）和先前构建的含AroG fbr质粒[38]扩增AsbF基因和AroG fbr基因。PCA诱导型启动子PLV及其相应调节蛋白PcaV从先前构建的质粒[35]扩增，与下游报告基因eGFP-GmR一起，通过EcoRI和HindIII插入pRK415质粒载体，产生生物传感器质粒pRK415-PcaV-PLV-eGFP-GmR。质粒pGBR-Ptac-PobA（来自恶臭假单胞菌的PobA，含Y385F突变）和pGBR-Ptac-GDC-ArCatA以先前构建的质粒为模板[37,43,44]PCR扩增，插入实验室自有质粒pGBR-Ptac的BamHI和XhoI位点之间（含庆大霉素抗性）。对于TolC的CRISPRi抑制，通过将来自先前构建的pCDF-dCas12a[37]的dAsCas12a插入BamHI和XhoI位点之间构建pGBR-Ptac-dCas12a-gTolC，随后通过golden-gate组装插入gTolC片段。本研究所用质粒列于补充表S2。
【数据】同源臂长度：~500 bp；突变：PobA Y385F、AroGfbr D146N；限制性位点：EcoRI、HindIII、BamHI、XhoI
恶臭假单胞菌基因组编辑流程
为删除pcaHG基因，从恶臭假单胞菌S12基因组DNA PCR扩增pcaHG删除盒的同源区域，然后组装到pK18mobsacB的EcoRI和HindIII位点之间。所得自杀质粒pK18mobsacB-pcaHG在2.4 kV和5 ms条件下电穿孔进入恶臭假单胞菌S12。随后使用含卡那霉素平板的第一轮选择和含蔗糖平板的后续选择进行双交换重组，获得正确敲除菌株。使用设计在pcaHG上下游区域的引物进行诊断PCR以确认基因敲除，所得pcaHG缺失菌株命名为恶臭假单胞菌-∆pcaHG。类似地，构建pK18mobsacB-catBC::Ptac-GDC以同时删除catBC并将Ptac-GDC插入PCA过量生产菌株内源catA基因上游，使Ptac启动子能同时驱动GDC和CatA表达。
对于恶臭假单胞菌的无残留标记转座子工程，首先重新设计pRL27质粒，将R6K复制起点和卡那霉素抗性KmR重新定位到转座区域之外，新版本pRL27为无标记质粒。将含AsbF-AroGfbr的pRL27在2.4 kV和5 ms条件下电穿孔进入含有pRK415-PcaV-PLV-eGFP-GmR的恶臭假单胞菌-∆pcaHG。转化后，细胞涂布于含庆大霉素平板，30°C培养直至菌落出现。使用基因特异性引物进行菌落PCR确认生物合成模块的成功整合。本研究所用所有亲本菌株和工程菌株列于补充表S3。
【数据】电穿孔条件：2.4 kV、5 ms；培养温度：30°C；筛选标记：卡那霉素、蔗糖、庆大霉素
生物传感器表征
构建的pRK415-PcaV-PLV-eGFP-GmR质粒在2.4 kV和5 ms条件下电转化至受体菌株恶臭假单胞菌-∆pcaHG。诱导实验通过在对数期（OD600 ~0.6）向新鲜培养的生物传感器菌株中添加诱导物（PCA）进行。诱导后通过250 rpm、30°C振荡培养8小时监测eGFP强度。随后离心细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）洗涤并重悬。使用微板读数器（Biotek，Synergy HT1）测量OD600和荧光强度。荧光强度在激发波长480 nm和发射波长520 nm下记录。剂量-响应数据通过使用微板读数器（Biotek，Synergy HT1）将荧光输出归一化至细胞密度（GFU/OD600）进行分析。数据使用Origin 2019绘图并拟合Hill函数。使用倒置荧光显微镜（Leica DM4）制备荧光显微镜图像。
为评估庆大霉素对PCA生物传感器菌株的选择效果，将补充100 μM PCA或不含PCA的生物传感器菌株系列稀释液点样于含12 μg/mL庆大霉素的LB固体平板上，观察其对庆大霉素的抗性。
【数据】诱导时机：OD600 ~0.6；振荡条件：250 rpm、30°C、8 h；激发/发射波长：480/520 nm；庆大霉素浓度：12 μg/mL；PCA浓度：100 μM
发酵过程
发酵培养基由改良M9培养基组成，含葡萄糖40 g/L、酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、K2HPO4 3 g/L、NH4Cl 1 g/L、Na2HPO4·12H2O 6 g/L、NaCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、CaCl2 0.011 g/L、5 mg/L盐酸硫胺素、10 mg/L烟酸、0.1 mg/L生物素，以及1 mL/L pH 7.0的微量元素溶液。微量元素溶液含50 g/L EDTA、8.3 g/L FeCl3·6H2O、0.84 g/L ZnCl2、0.13 g/L CuCl2·2H2O、0.1 g/L CoCl2·6H2O、0.1 g/L H3BO3、16 g/L MnCl2·4H2O、0.3 g/L Na2MoO4·2H2O。
将工程菌株接种到含3 mL LB培养基的试管中，30°C、250 rpm培养12小时作为种子培养物。将1%（体积比）种子培养物接种到50 mL改良M9培养基中用于PCA、GA和ccMA的生产。发酵过程中定期收集菌液，监测细胞生长和产物水平。
【数据】葡萄糖：40 g/L；酵母提取物：5 g/L；胰蛋白胨：10 g/L；接种量：1%（体积比）；培养基体积：50 mL；种子培养：30°C、250 rpm、12 h
分析方法
使用配备光电二极管阵列检测器的高效液相色谱仪（HPLC）分析PCA、GA和ccMA的浓度[65]。样品制备过程中，发酵液以13,000 rpm离心10分钟去除细胞沉淀。上清液在注入HPLC系统前用0.22 μm超滤膜过滤。使用C18色谱柱（180×4.6 mm×5 μm）测定工程菌株产生的PCA、GA和ccMA浓度，柱温维持40°C。PCA定量的流动相为溶液A（超纯水，含0.1%三氟乙酸）和溶液B（乙腈，含0.1%三氟乙酸）的混合物，流速1.0 mL/min，梯度浓度：0分钟100%溶液A；7分钟70%溶液A+30%溶液B；9-12分钟100%溶液A。PCA、GA和ccMA的检测波长设为259 nm。PCA、GA和ccMA的保留时间分别为10.5分钟、8.0分钟和10.7分钟。
【数据】离心：13,000 rpm、10 min；滤膜：0.22 μm；柱温：40°C；流速：1.0 mL/min；检测波长：259 nm；保留时间：PCA 10.5 min、GA 8.0 min、ccMA 10.7 min
基因组和转录组测序
PpPCA12在LB液体培养基中30°C、220 rpm培养至对数期（OD600 = 0.6），约需16小时。细胞通过12,000 rpm、4°C离心10分钟收集，然后用PBS缓冲液洗涤三次以去除残留培养基。细胞在液氮中快速冷冻，随后送往广东美格基因科技有限公司（Magigene）进行全基因组测序，测序在……
【数据】培养条件：30°C、220 rpm；收获时机：OD600 = 0.6（~16 h）；离心：12,000 rpm、4°C、10 min
研究结果
BRIDGE系统的设计原理
转座子诱变是产生全基因组随机突变文库的强大工具，能够在鉴定关键遗传变异的同时获得工业优势菌株。Tn5是最早发现的转座子之一，通过DNA转座酶介导的"剪切-粘贴"机制运作，能在多种细菌宿主中实现整个生物合成途径的转移和表达。然而，传统Tn5转座子整合在筛选过程中不可避免地引入抗生素抗性——这是工业应用的关键限制，通常需要额外努力去除抗生素标记以防止抗性基因水平转移至环境。
本研究提出设计一种兼具筛选和选择双重功能的生物传感器，用于分离高产菌株（图1），该工作流程命名为BRIDGE，旨在获得无残留标记且具有工业潜力的工程菌株。BRIDGE系统利用产物响应性调控电路控制来自非必需质粒的选择标记基因和/或可定量报告基因的表达。选择模块通过抗性筛选提供生存阈值以消除低产菌株，而荧光报告基因反映工程菌株产生的目标化合物的实际生物合成输出。
特别地，研究团队重构了转座子结构，仅将生物合成模块定位在长末端重复序列（LTRs）侧翼的转座区域之间。一旦生物合成模块整合到受体细胞基因组中，合成的代谢物触发双功能生物传感器，通过可定量报告输出和在选择压力下的生长优势来监测其产生水平。值得注意的是，由于使用的最小转座子系统不含终止子，当转座子表达盒以顺式方向插入时，某些基因组基因会被转录激活；而如果转座子以反向插入，则会因转录冲突而发生抑制，从而通过抑制、激活和破坏重塑基因组基因功能（在线补充信息图S1）。
【数据】转座子类型：Tn5；筛选策略：双功能生物传感器（选择+报告）
BRIDGE辅助构建恶臭假单胞菌PCA产生突变文库
凭借其强大的氧化还原代谢和多样的代谢途径，恶臭假单胞菌已成为合成生物学和工业应用的重要微生物底盘。作为概念验证，研究选择PCA作为目标化合物，在恶臭假单胞菌S12中测试BRIDGE的适用性——该菌株为溶剂耐受菌株，更适合化学品过量生产。
首先基于来自放线菌天蓝色链霉菌的PcaV异构转录因子及其嵌合启动子（PLV）构建了高特异性PCA生物传感器。为同时选择和筛选高产PCA菌株，将选择标记模块[庆大霉素抗性（GmR）]和报告模块[增强型绿色荧光蛋白（eGFP）]作为单个操纵子置于PLV启动子控制下（图2A和在线补充信息表S2）。原理上，转录抑制因子PcaV最初结合其同源启动子，导致PLV启动子被抑制；当PCA结合PcaV时，触发PcaV的变构变化并使PcaV从其同源启动子释放，从而解除下游基因的抑制（图2A）。
由于恶臭假单胞菌能通过原儿茶酸3,4-双加氧酶（PcaHG）介导的代谢自然降解PCA，首先使用自杀质粒pK18mobsacB通过同源重组生成ΔpcaHG菌株（在线补充信息图S2和表S3）。PCA消耗实验证明（在线补充信息图S3），野生型恶臭假单胞菌能在24小时内完全降解10 mM PCA，而恶臭假单胞菌-ΔpcaHG菌株的PCA降解能力显著降低。
将双功能生物传感器质粒（pRK415-PcaV-PLV-eGFP-GmR）导入工程菌株恶臭假单胞菌-ΔpcaHG。如图2B所示，PCA诱导后观察到明显的剂量依赖性eGFP表达，表明重构的PCA生物传感器在异源宿主恶臭假单胞菌中有功能。拟合Hill函数后，PCA的计算半有效浓度（EC50）为17.25 μM，Hill斜率为0.77（图2B），表明PCA生物传感器在恶臭假单胞菌中对PCA相对敏感。
为检验GmR选择标记的有效性，将含有生物传感器质粒的工程菌株补充或不补充100 μM PCA，然后点样于含12 μg/mL庆大霉素的LB固体平板。进一步在含庆大霉素平板上进行生长选择，结果显示不含PCA的对照组无明显生长（图2C），而补充PCA的组能在含庆大霉素平板上存活。相比之下，携带生物传感器的野生型恶臭假单胞菌S12菌株在外源添加PCA时未能激活eGFP和GmR的表达，因为PcaHG酶能有效降解PCA（图2B、C）。通过检查剂量-响应曲线和选择压力实验，确认了PCA生物传感器系统严格的配体依赖性激活，以及在恶臭假单胞菌-ΔpcaHG中赋予抗生素抗性表型。
建立PCA生物传感器偶联筛选平台后，研究团队接下来探索转座子诱变以在恶臭假单胞菌-ΔpcaHG中构建PCA过量生产突变文库。恶臭假单胞菌中的异源PCA生物合成可通过引入3-脱氢莽草酸脱水酶（3DSD，由蜡状芽孢杆菌的AsbF编码）实现，该酶将中心代谢物3-脱氢莽草酸转化为PCA（图2D）。此外，还引入了来自大肠杆菌的反馈抗性版本AroGfbr（含D146N突变）以增加流向3-脱氢莽草酸的代谢通量。
研究团队重新设计了携带AsbF-AroGfbr生物合成模块的无标记转座子系统（图2D和表S2）。该系统具有最小转座元件特征，仅包含侧翼为反向末端重复序列的生物合成模块。含有pRK415-PcaV-PLV-eGFP-GmR的恶臭假单胞菌-ΔpcaHG作为起始菌株，进一步转化转座质粒pRL27*-AsbF-AroGfbr以构建具有各种荧光菌落的PCA产生突变文库（单次转化约100个荧光菌落，图2D）。
【数据】EC50：17.25 μM；Hill斜率：0.77；PCA降解：野生型24 h完全降解10 mM；庆大霉素：12 μg/mL；单次转化荧光菌落数：~100
恶臭假单胞菌PCA产生突变文库的表征
随后，从突变文库中随机挑选15个绿色荧光菌落进行PCA产生测试。由于Tn5转座子随机整合的特性会造成拷贝数和整合位点的变异，可以清楚观察到15个选定菌株之间的PCA滴度存在差异（表S3），在摇管中范围为0.04 mM（6.62 mg/L）至2.19 mM（337.52 mg/L）（图3A）。可能由于PCA生物传感器的高灵敏度，突变文库中也分离出一些低PCA生产力菌株（图3A）。
荧光水平的定量进一步证实了PCA滴度与eGFP水平之间的良好相关性（图3B），表明通过eGFP信号分离高水平PCA生产者是可行方法。如图3C所示，通过单轮文库筛选即可轻松分离出两个PCA水平相对较高的突变株（PpPCA08和PpPCA12）（表S3）。在摇瓶培养条件下，突变菌株PpPCA12产生30.33 mM（4.67 g/L）……
【数据】突变株数量：15个；PCA滴度范围：0.04 mM（6.62 mg/L）至2.19 mM（337.52 mg/L）；摇瓶产量：30.33 mM（4.67 g/L）
高产菌株PpPCA12的比较转录组分析
【数据】转录组比较：PpPCA12 vs 野生型；取样时机：对数生长期（OD600 = 1.2）
恶臭假单胞菌作为GA和ccMA生产平台的工程改造
【数据】原文未详述
讨论与解读
尽管转座子诱变已广泛用于菌株工程，但由于缺乏有效的筛选方法，分离性能最优的突变菌株仍是劳动密集型过程。此外，菌株工程后残留的选择标记（通常为抗生素抗性基因）不仅给蛋白质合成带来额外代谢负担，还引发抗生素抗性基因水平转移至环境的担忧。
本研究证明BRIDGE工作流程能快速提升工程微生物中的化学品产量。通过实施双功能生物传感器和仅携带生物合成模块的最小转座子系统，可通过转座子诱变快速获得无标记的高化学品生产力工程菌株。作为概念验证研究，研究团队通过基于平板的筛选探索BRIDGE在恶臭假单胞菌中实现高水平PCA生产。通过仅筛选文库中的15个突变株，分离出能在摇瓶中产生30.33 mM（4.67 g/L）PCA的突变菌株。
考虑到TolC系统介导的PCA主动外排可能影响邻近细胞并产生假阳性，研究团队注意到许多非荧光菌落也出现。因此，未来需要开发微流控筛选方法，使水溶性代谢物PCA可以被限制在……
从技术成熟度角度看，基于NASA技术就绪水平（TRL）量表，BRIDGE技术被评估为TRL 4，对应"实验室环境中的组件验证"。该评估得到恶臭假单胞菌工作流程成功示范的支持，在摇瓶培养中实现了原儿茶酸（4.67 g/L）和顺,顺-粘康酸（ccMA）（2.97 g/L）的高滴度。转录组学分析进一步验证了产量提高的机制基础，确认了该技术在基础层面的功能性。将BRIDGE扩展到工业实施的主要挑战包括：（i）扩展生物传感器库以覆盖更广泛的有价值化学品；（ii）确保放大至生物反应器条件下的遗传稳定性和一致性表现；（iii）优化复杂表型的筛选通量。从政策角度看，BRIDGE工程菌株的无标记特性可能简化转基因生物（GMOs）的监管审批流程，但制定明确的随机整合修饰评估指南对于确保生物安全和公众接受至关重要。
编译者解读
BRIDGE技术的核心价值在于将"筛选"与"选择"合二为一，巧妙解决了转座子突变库构建中长期存在的筛选通量瓶颈。仅筛15个菌落即获高产株的效率令人印象深刻，这得益于双功能生物传感器将胞内产物浓度转化为可定量荧光信号和生存优势的双重输出。无标记设计对工业化应用至关重要——既减轻了代谢负担，又规避了抗性基因扩散的监管障碍。但该策略的通用性仍受限于生物传感器种类，如何为更多目标化合物构建高特异性感应元件是未来推广的关键。此外，随机插入引发的基因组重排效应（如基因激活或抑制）既是挑战也是可挖掘的进化资源。
参考来源
Yu D. Biosensor-guided indexing of genome evolution for boosting microbial chemical synthesis. Trends in Biotechnology, 2026. DOI: 10.1016/j.tibtech.2025.12.019
DOI: 10.1016/j.tibtech.2025.12.019