来源：Screening endogenous signal peptides and protein folding factors to promote the secretory expression of heterologous proteins in Pichia pastoris（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
毕赤酵母（Pichia pastoris）是广泛应用的重组蛋白表达宿主，但信号肽加工和蛋白折叠效率常限制异源蛋白的分泌表达。本研究基于已报道的分泌蛋白组和基因组数据，预测了4种新型内源信号肽（Dan4、Gas1、Msb2、Fre2）和3种折叠因子（Mpd1p、Pdi2p、Sil1p），并以yEGFP、β-半乳糖苷酶和头孢菌素C酰化酶三种报告蛋白系统评估其促分泌效果。结果显示信号肽Msb2使所有报告蛋白的胞外特异性产量提高1.5至8.0倍，Dan4使总蛋白产量最高提升172倍。该研究为毕赤酵母异源蛋白分泌表达提供了新工具。
研究背景
毕赤酵母作为蛋白质表达宿主，兼具原核和真核细胞的优势：能在简单培养基上旺盛生长、易于基因工程操作，并能对重组蛋白进行翻译后修饰。更为重要的是，毕赤酵母在正常情况下仅分泌少量内源蛋白，因此重组蛋白分泌到培养基中后可被高效地回收和纯化。然而，由于分泌机制的复杂性，许多异源蛋白的分泌常受到限制。当前最常用的分泌信号肽是酿酒酵母α-交配因子前导序列（α-MF），但其分泌效率常因目标蛋白不同而波动较大。为改善异源蛋白的分泌表达，筛选新型信号肽并共表达折叠因子是两条常用策略。
研究方法
2.1 试剂与酶
酵母提取物和胰蛋白胨购自Oxoid Ltd.（英国贝辛斯托克）。蛋白胨、酵母氮碱基（YNB）和D-生物素购自生工生物工程（上海）股份有限公司。质粒提取试剂盒（AxyPrep™ Plasmid Miniprep Kit）、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（AxyPrep™ DNA Gel Extraction Kit）、PCR产物纯化试剂盒（AxyPrep™ PCR Cleanup Kit）、基因组DNA提取试剂盒（AxyPrep™ Multisource Genomic DNA Miniprep Kit）和酵母总RNA提取试剂盒（AxyPrep™ Multisource Total RNA Miniprep Kit）均购自Axygen Biosciences（杭州）。限制性内切酶、PCR用DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit和SYBR® Premix DimerEraser™ Kit均购自TaKaRa Biotechnology（大连）。
2.2 重组质粒与菌株构建
大肠杆菌DH5α购自TaKaRa Biotechnology，用于常规质粒扩增。毕赤酵母菌株GS115（His⁻）和分泌表达载体pPIC9K购自Invitrogen（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）。含lacZ基因的质粒pSAOH5由James M. Cregg博士惠赠。本实验室前期构建的pG1Hg载体含有受突变GAP启动子G1控制的yEGFP报告基因。已报道的源自Pseudomonas sp.菌株SE83的头孢菌素C酰化酶序列（SECA），已按毕赤酵母密码子偏好性优化并克隆至pUC57（命名为pUC57-SECA）供后续研究。其他重组质粒和菌株列于表1。
首先构建含GAS1基因天然信号序列的质粒pG1GASg，用于表达信号肽-yEGFP融合蛋白。以pG1Hg为模板，通过两轮PCR获得融合的GAS1信号-egfp序列，所用引物对分别为GAS F1（AACTCTGCTGGGCCTGTCTTGTGCTCTTAAG(Afl II)ATGTCTAAAGGTGAAG）/ EGFP R（CCCAAGCTT(Hind III)TTATTTGTACAATTC）和GAS F2（CTATGCGGCCGC(Not I)ATGTTGTCCATTTTAAGTGCATTAACTCTGCTGGGCCT）/ EGFP R。所得GAS1信号-egfp序列经Not I/Hind III双酶切后，替换pG1Hg中的egfp片段，生成含Gas1信号肽介导egfp的pG1GASg。
为构建含其他信号肽（Dse4、Dan4、Msb2和Fre2）的表达质粒，分别合成对应信号序列正义链和反义链的寡核苷酸，并引入5'-Not I和3'-Afl II位点。将寡核苷酸退火获得双链信号序列。作为对照，以pPIC9K为模板，用引物MF F（AATAATGCGGCCGC(Not I)ATGAGATTTCCTTCAATTTTTAC）/ MF R（GCGCTTAAG(Afl II)AGCTTCAGCCTCTCTTTTC）经PCR扩增获得带有5'-Not I和3'-Afl II位点的α-MF序列。将这些信号序列克隆至经Not I和Afl II双酶切的pG1GASg中，替换GAS1信号序列，生成相应的yEGFP表达质粒。
随后，为获得不同信号肽介导的Gal或SECA表达质粒，以pSAOH5和pUC57-SECA为模板，PCR扩增带有5'-Afl II和3'-Hind III位点的lacZ和SECA基因，克隆至yEGFP表达质粒中以替换egfp序列。所得质粒经Sal I线性化后转化毕赤酵母GS115菌株。重组菌株在含0.4 μg/mL生物素的最低葡萄糖（MD）平板上筛选，并经PCR和测序确认。
报告基因（egfp、lacZ或SECA）分别从pG1Hg、pSAOH5和pUC57-SECA扩增，插入pPIC9K质粒中受强诱导型启动子AOX1控制，生成表达载体pPIC9KG、pPIC9KL和pPIC9KCA。所得质粒转化毕赤酵母GS115细胞，获得相应的重组菌株G/9KG、G/9KL和G/9KCA，用于yEGFP、Gal和SECA的诱导表达。
折叠因子基因（HAC1除外）以毕赤酵母基因组DNA为模板，用含Sac II（正向）和Not I（反向）限制性位点的特异性引物PCR扩增。采用RT-PCR获取剪接后的HAC1基因。折叠因子基因经酶切后克隆至pAOX质粒中AOX1启动子下游。所得载体通过双交换整合至重组菌株（G/9KG、G/9KL或G/9KCA）的ADRH（PAS_chr1-4_0191）—DDKC（PAS_chr1-4_0192）位点，获得相应的共表达菌株。
为确保报告基因单拷贝整合，使用含100、200、500和1000 μg/mL Zeocin的YPD平板筛选潜在的单拷贝菌株——仅能在100 μg/mL Zeocin平板上生长而不能在200 μg/mL及以上浓度Zeocin平板上生长的菌株。随后，每种构建体的10个单克隆在摇瓶中评估，选择表达水平居中的转化子用于本研究。必要时，采用实时荧光定量PCR（qPCR）进一步确认拷贝数。
2.3 培养基与培养条件
除非特别说明，所有培养基和成分均按Pichia表达试剂盒（Invitrogen）的方案配制。大肠杆菌在37°C、LB培养基（0.5%酵母提取物、1%胰蛋白胨、1% NaCl）中需氧培养，或在含15 g/L琼脂及适当抗生素的平板上培养。毕赤酵母常规在YPD培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）中于30°C培养。
重组酵母菌株单菌落接种于10 mL试管中的2 mL YPD培养基，过夜培养后，将过夜培养物转接至250-mL摇瓶中，进行组成型或诱导型异源蛋白表达。BMDT培养基（2%胰蛋白胨、1%葡萄糖、1.34% YNB、4 × 10⁻⁵%生物素、0.1 M K₂HPO₄/KH₂PO₄，pH 6.0）用于yEGFP的组成型表达，YPD用于Gal和SECA的产生。
对于诱导型表达，菌株先在BMGY培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、1%甘油、1.34% YNB、4 × 10⁻⁵%生物素、0.1 M K₂HPO₄/KH₂PO₄，pH 6.0）中生长至OD₆₀₀约5–7，然后收集细胞并重悬于诱导培养基中，每24小时添加甲醇以维持甲醇浓度为1%。yEGFP生产在BMMT培养基（2%胰蛋白胨、1.34% YNB、0.5%甲醇、4 × 10⁻⁵%生物素、0.1 M K₂HPO₄/KH₂PO₄，pH 6.0）中进行，Gal和SECA表达则在BMMY培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、1.34% YNB、0.5%甲醇、4 × 10⁻⁵%生物素、0.1 M K₂HPO₄/KH₂PO₄，pH 6.0）中进行。
2.4 异源蛋白产量分析
采用三个技术重复测定yEGFP荧光、Gal活性和SECA活性以监测异源报告蛋白产量，每个样品设三个独立的生物学重复。在指定时间点取样，8000 rpm离心10分钟，分别收集上清液和细胞沉淀部分，用于胞外和胞内蛋白表达分析。
yEGFP荧光按前述方法测定，使用Molecular Devices SpectraMax M2酶标仪（美国加利福尼亚州森尼维尔），激发波长485 nm，发射波长525 nm。简要步骤为：取50 μL无细胞上清液与150 μL复性缓冲液（0.1 M NaCl、0.05 M NaH₂PO₄、0.5 M咪唑）混合，测定胞外荧光。为测定胞内表达，将细胞沉淀洗涤三次并重悬于复性缓冲液中进行测定。Gal和SECA的酶活性分别在上清液和细胞裂解液中测定。
【数据】大肠杆菌培养温度：37°C；LB培养基成分：0.5%酵母提取物、1%胰蛋白胨、1%NaCl；毕赤酵母培养温度：30°C；YPD培养基成分：1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖；Zeocin筛选浓度：100、200、500、1000 μg/mL；离心条件：8000 rpm、10 min；荧光测定波长：激发485 nm/发射525 nm；复性缓冲液：0.1 M NaCl、0.05 M NaH₂PO₄、0.5 M咪唑；BMDT培养基pH：6.0；甲醇诱导浓度：1%；BMGY生长OD₆₀₀：约5–7
研究结果
3.1 内源信号肽与折叠因子的预测
为筛选用于毕赤酵母异源蛋白分泌的新型信号肽，研究人员检索了毕赤酵母分泌蛋白组研究中预测的内源分泌蛋白。共选取4个推定ORF：gi|254564917、gi|254567898、gi|254565023和gi|254573438，分别是酿酒酵母的GAS1、DAN4、MSB2和FRE2同源基因，编码Gas1p、Dan4p、Msb2p和Fre2p。Gas1p是参与细胞壁组装的β-1,3-葡聚糖转糖基酶，在毕赤酵母的甲醇和葡萄糖诱导培养物中均有鉴定。假定蛋白Dan4p在诱导后样品中定量丰富。Msb2p是黏蛋白家族成员，Fre2p（铁还原酶和铜还原酶）负责胞外铁或磷酸盐的摄取。这些蛋白被预测具有不同功能，其信号肽序列迄今未经实验验证。此外，Gas1p和Dan4p均在二维凝胶上的培养上清液中被鉴定到，表明它们作为天然分泌蛋白在培养基中含量丰富。
这4个潜在分泌蛋白经SignalP 4.1进一步分析推定分泌信号肽。所有序列均显示分泌蛋白的特征模式（D-score），具有推定切割位点（Y-max），预测的信号序列命名为Dan4、Gas1、Msb2和Fre2（表2）。内源信号肽Dse4（gi|254565329，DSE4）已被报道能介导yEGFP在毕赤酵母中的高效分泌。因此，以Dse4和广泛使用的酿酒酵母α-MF为对照，考察4种新型信号肽的分泌效率。
已有研究表明，在毕赤酵母中共表达折叠因子（包括内质网（ER）分子伴侣蛋白BiP/Kar2p、二硫键异构酶PDI和UPR途径转录因子Hac1p）可增强多种异源蛋白的分泌表达。为鉴定更多潜在的分泌增强因子，根据注释功能在NCBI毕赤酵母GS115基因组数据库中搜索PDI和BiP相关蛋白。获得3个PDI序列、1个BiP/Kar2p序列和1个ER腔Hsp70分子伴侣Kar2p的核苷酸交换因子。基于酿酒酵母分泌途径与其他酵母物种的比较，其中2个PDI家族蛋白分别与酿酒酵母Pdi1p和Mpd1p同源，核苷酸交换因子与Sil1p同源。由于另一个PDI蛋白在酿酒酵母中未发现同源基因，将其命名为Pdi2p。在这些折叠因子中，Mpd1p、Pdi2p和Sil1p此前未被研究。因此，本研究考察这些新型内源折叠因子，并与已报道的折叠因子进行比较（表3）。
【数据】预测信号肽数量：4个（Dan4、Gas1、Msb2、Fre2）；预测折叠因子数量：3个（Mpd1p、Pdi2p、Sil1p）；分析工具：SignalP 4.1
3.2 信号肽对异源蛋白分泌表达的影响
采用三种报告蛋白评估新型信号肽的潜力：酵母增强型绿色荧光蛋白（yEGFP）、β-半乳糖苷酶（Gal）和头孢菌素C酰化酶（SECA）。每个报告基因的编码序列融合于信号序列的3'端，置于强组成型启动子G1（PGAP突变体）控制下，实现报告蛋白在重组菌株中的组成型表达。选择仅能在含100 μg/mL Zeocin的YPD平板上生长但不能在更高浓度Zeocin平板上生长的重组细胞（摇瓶培养中报告蛋白产量居中者），以确保表达盒以单拷贝整合至这些菌株。
摇瓶培养120小时，考察新型信号肽对报告蛋白分泌表达的影响。首先监测细胞生长，发现这些重组菌株与亲本菌株GS115之间无明显差异（数据未显示）。同时测定胞外和胞内蛋白表达水平。yEGFP、Gal和SECA的胞外产量分别在24小时、72小时和72小时达到最大值。因此，取这些时间点的上清液和细胞中的荧光强度和酶活性，计算目标蛋白的比产量、总产量和分泌比率（图1）。
酿酒酵母信号序列α-MF广泛用于毕赤酵母重组蛋白的分泌表达。在引导三种报告蛋白的分泌生产方面，α-MF表现出不同水平的活性。yEGFP的分泌比率分别比Gal和SECA高10倍和2倍。用内源信号序列替代α-MF后，各报告蛋白间也观察到不同活性。所有内源信号肽在Gal分泌生产方面均表现出高于α-MF的活性，替换为这些新型信号肽后，胞外比酶活性较α-MF提高2倍以上，其中Gas1获得最高分泌产量（191.8 ± 21.2 U/g DCW），提高16.8倍。对于SECA，Dan4和Msb2介导的胞外比活性分别比α-MF高3.8倍和1.9倍，达到1.37 ± 0.14和0.70 ± 0.15 U/g DCW。yEGFP的分泌经Msb2（60.6 ± 2.47 RFU/OD₆₀₀）和Fre2（55.7 ± 2.13 RFU/OD₆₀₀）增强，上清液荧光强度与已报道的Dse4信号相似，分别比α-MF高1.5倍和1.4倍。基于三种不同报告蛋白的结果，Msb2可视为毕赤酵母中更有效的异源蛋白分泌信号。
信号序列不仅影响分泌产量，还影响报告蛋白的胞内积累，从而导致总表达水平的差异。所有内源信号肽均提高了Gal和SECA的胞内比酶活性。相应地，内源信号对Gal和SECA的总酶活性均有改善。所有信号肽对Gal总活性的增强均超过α-MF的4倍，其中Gas1分泌信号获得最高230倍提升（64381.0 ± 5729.5 U/g DCW），Dan4和Msb2次之。
为排除基因剂量效应导致Gal活性升高的可能性，测定了这三个菌株中lacZ基因的拷贝数和转录水平。如图2所示，所有菌株均确认为单拷贝转化子，且各菌株中lacZ相对mRNA水平相似。对于SECA，所有内源信号序列均检测到中等程度的胞内酶活性升高，其中Dan4信号获得最高总酶活性（4.73 ± 0.47 U/g DCW），比α-MF高2.8倍。仅信号肽Dan4增强了yEGFP的胞内荧光强度，将α-MF替换为Dan4使总荧光强度（267.0 ± 8.6 RFU/OD₆₀₀）提高2.6倍。因此，尽管Dan4在促进所测蛋白分泌方面不如Msb2，但在提高总蛋白产量方面更为有效。
【数据】yEGFP胞外产量达峰时间：24h；Gal和SECA胞外产量达峰时间：72h；α-MF介导的yEGFP分泌比率比Gal高：10倍，比SECA高：2倍；Gas1介导Gal胞外比活性：191.8 ± 21.2 U/g DCW（较α-MF提高16.8倍）；Dan4介导SECA胞外比活性：1.37 ± 0.14 U/g DCW（较α-MF高3.8倍）；Msb2介导SECA胞外比活性：0.70 ± 0.15 U/g DCW（较α-MF高1.9倍）；Msb2介导yEGFP荧光：60.6 ± 2.47 RFU/OD₆₀₀（较α-MF高1.5倍）；Fre2介导yEGFP荧光：55.7 ± 2.13 RFU/OD₆₀₀（较α-MF高1.4倍）；Gas1介导Gal总活性：64381.0 ± 5729.5 U/g DCW（较α-MF高230倍）；Dan4介导SECA总活性：4.73 ± 0.47 U/g DCW（较α-MF高2.8倍）；Dan4介导yEGFP总荧光：267.0 ± 8.6 RFU/OD₆₀₀（较α-MF高2.6倍）
【数据】共表达折叠因子对细胞生长影响：因折叠因子种类和报告蛋白不同而异；具体数据原文未详述
讨论与解读
为筛选具有广泛适用性的内源信号肽和折叠因子以促进毕赤酵母中不同异源蛋白的分泌表达，本研究选用了三种序列和大小各异的报告蛋白。yEGFP分子量较小，已在多种酵母属中借助病毒前原毒素信号序列实现高效分泌。Gal是由1023个氨基酸多肽链组成的大型四聚体，与α-交配因子分泌前导序列融合时无法在毕赤酵母中分泌。SECA比Gal小，可将头孢菌素C脱酰基生成7-氨基头孢烷酸（7-ACA），用于半合成头孢菌素的工业生产。
在4种新型信号肽中，Msb2对所有三种蛋白的分泌均表现出积极效果，与α-MF相比，yEGFP、Gal和SECA的胞外比产量分别提高1.5倍、8.0倍和1.9倍。对于最大的蛋白Gal，用内源信号肽替换α-MF信号序列可显著提高胞内和胞外产量。Gas1是Gal生产中最有效的信号序列，其胞外比产量和总产量分别比α-MF提高16.8倍和230倍。综上，本研究鉴定了一种能高效分泌所有三种测试重组蛋白的新型信号肽Msb2，以及一种能显著提高总蛋白产量的新型信号序列Dan4。
编译者解读
从合成生物学应用角度看，该研究的价值在于系统性地从毕赤酵母自身分泌组中挖掘信号肽和折叠因子资源，而非仅依赖酿酒酵母的α-MF通用方案。以三种大小和结构差异显著的报告蛋白做平行评估，使结论更具普适性。Msb2和Dan4的发现为不同分子量目标蛋白的分泌提供了可选择的工具组合。值得注意的是，信号肽与折叠因子的效果呈现蛋白特异性，提示实际应用中需针对目标蛋白进行组合筛选。该策略对工业酶和药用蛋白的毕赤酵母生产体系优化具有直接参考价值。
参考来源
Duan G. Screening endogenous signal peptides and protein folding factors to promote the secretory expression of heterologous proteins in Pichia pastoris. Journal of Biotechnology, 2019. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2019.06.297
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2019.06.297