来源：Heterologous biosynthesis of (+)-nootkatone in unconventional yeast Yarrowia lipolytica（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
(+)-诺卡酮是一种高价值的倍半萜类化合物，广泛应用于香精香料行业。本研究首次在非常规酵母解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中构建了(+)-诺卡酮的异源合成途径，通过共表达(+)-瓦伦烯合酶CnVS、密码子优化的(+)-诺卡酮合酶opCYP706M1及NADPH-细胞色素P450还原酶opAtCPR1，实现了目标产物的从头合成。进一步通过蛋白融合策略和MVA途径限速酶过表达，最终工程菌株产量达到978.2 μg/L，较初始菌株提高20.5倍。
研究背景
(+)-诺卡酮属于倍半萜类化合物，天然存在于葡萄柚和柚子等多种植物中。凭借其独特气味特征和极低的气味阈值，(+)-诺卡酮广泛应用于香精、化妆品和食品工业。此外，该化合物对白蚁具有驱避活性，可作为有效杀虫剂；其代谢产物还表现出抗增殖和抗血小板活性，在医药领域具有应用价值。然而，天然提取受限于植物中含量低且依赖年收，化学合成则需使用有毒催化剂，生物转化虽已有报道，但寻找具有区域选择性的P450酶催化(+)-瓦伦烯的烯丙位氧化仍是关键难题。近年来，利用微生物细胞工厂从头合成(+)-诺卡酮成为研究热点。Beekwilder团队首先从阿拉斯加雪松中鉴定了瓦伦烯合酶CnVS和瓦伦烯氧化酶CYP706M1。解脂耶氏酵母作为一种安全性公认的非常规酵母，拥有内源MVA途径可为萜类合成提供前体，是萜类化合物生产的潜在平台菌株。
研究方法
2.1 菌株、培养基与培养条件
原始菌株Y. lipolytica ATCC 201249及携带LEU2基因的单拷贝质粒pINA1269由天津大学元英进教授惠赠。本工作构建的全部工程菌株和质粒列于表1。大肠杆菌Escherichia coli Trans1 T1用于质粒的构建与增殖。Y. lipolytica转化子的筛选使用营养缺陷型SC平板，含有10 g/L葡萄糖、6.7 g/L酵母氮碱、16 g/L琼脂和2 g/L缺乏相应营养物的氨基酸混合物。YPD培养基（20 g/L葡萄糖、10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨）用于Y. lipolytica的生长和发酵。向30 ml YPD培养液中添加10%（v/v）十二烷以捕获产物(+)-诺卡酮和(+)-瓦伦烯。摇瓶培养条件为30℃、220 rpm、5天。
【数据】培养基：SC平板（10 g/L葡萄糖、6.7 g/L酵母氮碱、16 g/L琼脂、2 g/L氨基酸混合物）、YPD（20 g/L葡萄糖、10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨）；十二烷添加量：10%（v/v）；培养体积：30 ml；温度：30℃；转速：220 rpm；时间：5天
2.2 质粒构建
法尼基二磷酸合酶基因ERG20从Y. lipolytica基因组DNA扩增获得，截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1从Saccharomyces cerevisiae基因组DNA扩增获得。ERG20和tHMG1 DNA片段分别使用ClonExpress® Ⅱ一步克隆试剂盒（Vazyme，中国）插入pINA1269质粒的BamHI位点，得到pERG20和ptHMG1。随后从pERG20扩增ERG20表达盒并插入ptHMG1的SalI位点，获得质粒ptHMG1-ERG20（图2a）。重组质粒经NotI（NEB）限制性内切酶线性化后，通过转化整合至Y. lipolytica ATCC 201249染色体。
【数据】试剂盒：ClonExpress® Ⅱ One Step Cloning Kit；限制酶：NotI；插入位点：BamHI、SalI；质粒：pERG20、ptHMG1、ptHMG1-ERG20
2.3 DNA操作
来自Callitropsis nootkatensis的原始CnVS和CYP706M1基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。AtCPR1从Arabidopsis thaliana的cDNA扩增获得。密码子优化的CYP706M1和AtCPR1由武汉金开瑞生物工程有限公司合成。所有启动子和终止子均从Y. lipolytica ATCC 201249基因组DNA扩增获得。表达盒TEF1p-CnVS-xpr2t、EXP1p-CYP706M1-mig1t和GPD1p-AtCPR1-lip2t通过重叠延伸PCR（OE-PCR）构建（图2b）。opCYP706M1还与opt46AtCPR进行融合，不使用连接肽或使用"GGTTCCACCTCCTCCGGT"连接肽，分别获得EXP1p-opCYP706M1-opt46AtCPR1-mig1t和EXP1p-opCYP706M1-linker-opt46AtCPR1-mig1t表达盒。相邻表达盒之间设计了超过70 bp的重叠区域。表达盒通过DNA assembler方法整合至Y. lipolytica ATCC 201249的rDNA位点。
【数据】基因来源：CnVS和CYP706M1来自C. nootkatensis，AtCPR1来自A. thaliana；连接肽序列：GGTTCCACCTCCTCCGGT；重叠长度：>70 bp；整合位点：rDNA
2.4 *Y. lipolytica*的转化
Y. lipolytica转化采用LiAc法进行。简要步骤如下：将Y. lipolytica在3 ml YPD培养基中过夜培养，然后取200 μl菌液转接至3 ml新鲜培养基中培养4小时。随后取1 ml菌液离心收集细胞，将细胞悬浮于100 mM LiAc中处理5分钟。离心收集细胞后，按顺序加入以下组分：240 μl 50%（w/v）PEG 3350、36 μl 1.0 M LiAc、10 μl SS载体DNA（2.0 mg/mL）、每个DNA片段300 ng，加蒸馏水至总体积360 μl。将混合物置于30℃培养箱中孵育30分钟，再于42℃水浴中热激30分钟。加入1 ml YPD培养感受态细胞2小时，然后用1 ml无菌水洗涤细胞两次，最后将细胞涂布于相应的SC培养基平板。平板于30℃培养3天以获得转化子。
【数据】PEG浓度：50%（w/v）PEG 3350，用量240 μl；LiAc浓度：1.0 M，用量36 μl；SS载体DNA：2.0 mg/mL，用量10 μl；DNA量：300 ng/片段；总体系：360 μl；孵育：30℃ 30 min；热激：42℃ 30 min；复苏：YPD 2 h；平板培养：30℃ 3天
2.5 (+)-瓦伦烯和(+)-诺卡酮的GC-MS分析与定量
收集十二烷相并用0.22 μm滤膜过滤。使用Agilent Technologies 7890 A GC系统（配备5975 C insert XL EI/CI MSD检测器）和HP-5 MS（30 m × 0.25 mm × 0.5 μm）气相色谱柱进行分析。进样量1 μl十二烷样品，分流比5。进样器和检测器温度分别设定为250℃和280℃。柱温箱初始温度100℃保持4分钟，然后以10℃/min的速率升至250℃并保持5分钟。(+)-瓦伦烯和(+)-诺卡酮的鉴定通过比较保留时间和质谱图与标准品完成。定量分析使用Bruker SCION 456 GC-FID，以氮气为载气建立标准曲线。(+)-瓦伦烯和(+)-诺卡酮的定量通过峰面积归一化至标准曲线完成。
【数据】GC柱：HP-5 MS（30 m × 0.25 mm × 0.5 μm）；进样量：1 μl；分流比：5；进样器温度：250℃；检测器温度：280℃；柱温程序：100℃ 4 min → 10℃/min → 250℃ 5 min；定量仪器：Bruker SCION 456 GC-FID
2.6 拷贝数测定
使用实时荧光定量PCR（qPCR）确定整合至Y. lipolytica基因组中的外源基因的相对拷贝数，试剂盒为Super PreMix Plus（SYBR Green）（天根，中国）。以ERG5基因作为内参对照。使用TIANamp Yeast DNA Kit提取工程菌株Y1-Y4的基因组DNA。从Y1-Y4基因组DNA中扩增CnVS、opCYP706M1和opAtCPR1片段，使用比较CT方法将倍数变化归一化至ERG5基因。qPCR引物列于补充表S1。
【数据】qPCR试剂盒：Super PreMix Plus（SYBR Green）；内参基因：ERG5；分析方法：比较CT法；菌株：Y1-Y4
研究结果
3.1 在*Y. lipolytica*中构建(+)-诺卡酮异源合成途径
Y. lipolytica具有天然的MVA途径，可供应前体FPP，但由于缺乏(+)-瓦伦烯合酶和(+)-诺卡酮合酶，无法合成(+)-诺卡酮。为使Y. lipolytica能够生产(+)-诺卡酮，将来自C. nootkatensis的(+)-瓦伦烯合酶CnVS、(+)-瓦伦烯氧化酶CYP706M1以及来自Arabidopsis thaliana的AtCPR1在Y. lipolytica中共表达（图2b），获得菌株Y0。为避免(+)-瓦伦烯和(+)-诺卡酮的挥发损失，发酵过程中添加了10%（v/v）十二烷。结果显示，通过GC-MS在十二烷层中检测到7.8 mg/L的(+)-瓦伦烯（图3），但未检测到(+)-诺卡酮。
这表明CnVS成功发挥功能，而CYP706M1未能表达或表达量极弱，导致合成的(+)-诺卡酮量过低而无法检测。Y. lipolytica是一种非常规酵母，对某些特定异源基因的成功表达而言，密码子优化是必要的，这一点已被多项研究证实。因此，使用人工密码子优化的基因opCYP706M1和opAtCPR1构建菌株Y1（图2b）。如预期所料，对Y1培养物十二烷层进行GC-MS分析时，在14.63 min保留时间处出现了一个新峰。通过与标准品的保留时间和质谱图比较，该峰被鉴定为(+)-诺卡酮（图4）。经标准曲线定量，(+)-诺卡酮的产量为45.6 μg/L。
【数据】菌株Y0：(+)-瓦伦烯产量7.8 mg/L，(+)-诺卡酮未检出；菌株Y1：(+)-诺卡酮产量45.6 μg/L；新峰保留时间：14.63 min
3.2 融合opCYP706M1与opt46AtCPR1增强(+)-诺卡酮的生物合成
我们先前的研究表明，P450型酶与P450还原酶的融合可能提高催化效率。受此启发，将opCYP706M1与opt46AtCPR1进行融合，构建菌株Y2。令人惊讶的是，(+)-诺卡酮产量提高至312.2 μg/L，比菌株Y1提高了近6倍（表2）。这一结果表明，opCYP706M1与opt46AtCPR1的融合确实增强了氧化反应，我们推测融合加速了NADPH向CYP706M1的电子传递。实际上，测试了opCYP706M1与opt46AtCPR1之间的两种融合形式。第一种形式不使用连接肽，获得菌株Y2。另一种形式中，opCYP706M1与opt46AtCPR1通过由"GSTSSG"氨基酸残基组成的连接肽融合，获得菌株Y2 plus。发酵后，Y2产生312.2 μg/L的(+)-诺卡酮，而Y2 plus仅产生痕量(+)-诺卡酮，低于20 μg/L（数据未显示）。这一结果表明，连接肽的类型可能改变融合蛋白的折叠结构，对opCYP706M1的催化活性有显著影响。
【数据】菌株Y2：(+)-诺卡酮产量312.2 μg/L，较Y1提高近6倍；菌株Y2 plus：(+)-诺卡酮产量<20 μg/L；连接肽氨基酸序列：GSTSSG
3.3 过表达tHMG1和ERG20提高*Y. lipolytica*的(+)-诺卡酮产量
已有报道称，过表达MVA途径中限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的催化结构域有利于异戊二烯类化合物的生产。因此，通过将质粒ptHMG1转化至Y2中过表达tHMG1，获得菌株Y3。如表2所示，(+)-瓦伦烯和(+)-诺卡酮的产量均得到提高。Y3产生551.1 μg/L的(+)-诺卡酮，比Y2增加了约76%。为进一步提高(+)-诺卡酮产量，另一个关键酶FPP合酶ERG20也被过表达，即将质粒ptHMG1-ERG20整合至Y2基因组中，获得菌株Y4，该菌株产生22.8 mg/L的(+)-瓦伦烯和978.2 μg/L的(+)-诺卡酮。至此，构建了用于(+)-诺卡酮异源生物合成的工程Y. lipolytica菌株。当tHMG1和ERG20均过表达时，(+)-诺卡酮的最终产量较初始工程菌株Y1提高了20.5倍，(+)-瓦伦烯也从7.8 mg/L增加至22.8 mg/L，表明Y. lipolytica是一个具有潜在优势的底盘菌株，可通过工程改造实现萜类化合物的更高产量。
【数据】菌株Y3：(+)-诺卡酮产量551.1 μg/L，较Y2增加约76%；菌株Y4：(+)-瓦伦烯22.8 mg/L，(+)-诺卡酮978.2 μg/L；Y4较Y1：(+)-诺卡酮提高20.5倍，(+)-瓦伦烯从7.8 mg/L增至22.8 mg/L
3.4 拷贝数分析
为检验拷贝数对结果的影响，使用qPCR测定Y1-Y4中CnVS、CYP706M1和AtCPR1编码基因的相对拷贝数。qPCR结果显示，整合至Y. lipolytica基因组中的三个基因的相对拷贝数均约为1，尽管Y1中含有2拷贝的AtCPR1（补充图S1），这可能归因于Y. lipolytica中非同源重组的高概率。这一结果表明，不同工程菌株中外源基因的拷贝数水平几乎相同，但这并不说明拷贝数没有影响，仍需进一步研究以探索拷贝数对产量的影响。此前研究表明，使用缺陷型选择标记对于获得多拷贝整合至关重要。在本研究中，使用了非缺陷型ura3标记，这可能是大多数基因仅有一个拷贝整合的原因。
【数据】拷贝数：CnVS、opCYP706M1、opAtCPR1在Y1-Y4中相对拷贝数均约为1；Y1中AtCPR1拷贝数：2
讨论与解读
本研究成功在解脂耶氏酵母中构建了(+)-诺卡酮合成途径，通过蛋白融合和代谢工程手段，从工程菌株Y1到Y4，(+)-诺卡酮产量提高了约20倍。然而，即使菌株Y4也仅产生978.2 μg/L的(+)-诺卡酮，这可归因于以下原因。Y1中(+)-诺卡酮产量为0.3 mg/L，与工程化毕赤酵母共表达ValS与HPO和CPR时的产量几乎相同，证明Y. lipolytica具有生产(+)-诺卡酮的潜力。限制产量进一步提高的关键因素之一是(+)-瓦伦烯的低转化率。如表2所示，Y4中(+)-瓦伦烯积累至22.8 mg/L，但(+)-诺卡酮仅达到978.2 μg/L，表明(+)-瓦伦烯向(+)-诺卡酮的转化效率较差。一方面，大部分(+)-瓦伦烯一旦产生即被萃取至有机相，无法参与由CYP706M1催化的后续氧化反应——这似乎是由(+)-瓦伦烯在十二烷相中的高分配系数所致。为应对该问题，可使用DMSO等能增加(+)-瓦伦烯在水相培养体系中溶解度的添加剂。另一方面，虽然蛋白融合提高了CYP706M1的催化效率，但连接肽的类型对融合蛋白的催化活性影响显著，无连接肽的直接融合形式（Y2）明显优于含GSTSSG连接肽的形式（Y2 plus）。
编译者解读：该研究展示了一条清晰的合成生物学迭代优化路径——从异源途径构建、密码子优化到蛋白融合工程和MVA途径强化，每一步都有明确的产量数据支撑决策。无连接肽融合策略优于短肽连接的设计提示我们，P450酶与还原酶之间的空间排布对电子传递效率至关重要。值得注意的是，两相发酵中底物被有机相"截留"导致转化率受限的问题，在膜反应器或原位产物移除等工程策略中仍有优化空间。该体系为其他倍半萜类化合物及P450酶在解脂耶氏酵母中的高效表达提供了有价值的参考范式。
参考来源
期刊：Biochemical Engineering Journal, 2018
DOI: 10.1016/j.bej.2018.05.023
DOI: 10.1016/j.bej.2018.05.023