来源：Glycerol improves heterologous biosynthesis of betulinic acid in engineered Yarrowia lipolytica（Chemical Engineering Science）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
白桦脂酸是一种具有多种药理活性的五环三萜类化合物。本研究首次在非常规酵母解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中构建白桦脂酸异源合成途径，通过共表达羽扇醇合酶、细胞色素P450单加氧酶及P450还原酶实现白桦脂酸的从头合成。研究发现，以甘油替代葡萄糖作为碳源可将白桦脂酸产量提升1.8倍，最终在40 g/L甘油条件下获得26.53 mg/L白桦脂酸。该研究为利用廉价甘油生产高值萜类化合物提供了新方案。
研究背景
甘油是生物柴油生产过程中的主要副产物，每生产10 kg生物柴油约产生1 kg粗甘油，且产量逐年增加。将甘油这类低成本废弃碳源转化为高价值化合物，对提高可持续发展性具有重要意义。解脂耶氏酵母是一种被普遍认为是安全的产油酵母，能够利用多种底物作为碳源，已被广泛用于将包括甘油在内的低价值底物生物转化为高值产品。此前研究已利用甘油作为底物生产微生物油脂、酵母生物质及柠檬酸等产品。
白桦脂酸是一种五环三萜类化合物，具有多种药理特性。其生物合成途径中，2,3-氧化鲨烯经羽扇醇合酶（LUP1）环化生成羽扇醇，再由细胞色素P450单加氧酶CYP716A12催化C-28氧化生成白桦脂酸，该过程需要细胞色素P450还原酶（CPR）作为氧化还原伴侣。本研究旨在解脂耶氏酵母中实现白桦脂酸的异源生物合成，并考察甘油作为碳源对产量的影响。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养基
本研究所用菌株和质粒列于附表S1。解脂耶氏酵母ATCC 201249（MATA, ura3-302, leu2-270, lys8-11, PEX17-HA）作为初始菌株。SC培养基平板用于筛选解脂耶氏酵母转化子。YPD培养基含20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨和10 g/L酵母提取物，用于解脂耶氏酵母菌株的培养和发酵。YP培养基含20 g/L蛋白胨和10 g/L酵母提取物，分别添加20 g/L甘油、20 g/L大豆油、20 g/L玉米油或20 g/L油酸，用于工程菌株Y13的发酵实验。质粒pINA1269是解脂耶氏酵母单拷贝整合型质粒，含有hp4d启动子、XPR2终止子、亮氨酸筛选标记基因（LEU2）和氨苄青霉素抗性基因（Ampr）。大肠杆菌Trans1-T1用于质粒的构建和增殖，细胞在含10 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨和5 g/L酵母提取物的Luria–Bertani（LB）完全培养基中培养，必要时添加100 mg/L氨苄青霉素。
【数据】菌株：Y. lipolytica ATCC 201249；培养基：YPD（20 g/L葡萄糖+20 g/L蛋白胨+10 g/L酵母提取物）、YP（20 g/L蛋白胨+10 g/L酵母提取物+20 g/L甘油/大豆油/玉米油/油酸）；大肠杆菌培养基：LB（10 g/L NaCl+10 g/L胰蛋白胨+5 g/L酵母提取物）；氨苄青霉素：100 mg/L
2.2 DNA操作
密码子优化的拟南芥羽扇醇合酶AtLUP1（opAtLUP1）、密码子优化的蒺藜苜蓿P450单加氧酶MtCYP716A12（opMtCYP716A12）和密码子优化的拟南芥P450还原酶AtCPR1（opAtCPR1）基因由武汉金开瑞生物工程有限公司合成。基因优化后的核苷酸序列见附表S2。TEF1p和EXP1p等启动子、xpr2t和mig1t等终止子、rDNAu、rDNAd、zetau、zetad、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1（HMG1，GenBank ID：XM_503558）以及鲨烯合酶基因erg9（GenBank ID：XM_499929）均从解脂耶氏酵母ATCC 201249基因组DNA中扩增获得。Ura3从质粒pEASY-blunt-101扩增获得，leu2从质粒pINA1269扩增获得。启动子、终止子、zeta、ura3和leu2的核苷酸序列见附表S2。TEF1p-opAtLUP1-xpr2t、EXP1p-opMtCYP716A12-mig1t、GPD1p-opAtCPR1-lip2t以及EXP1p-opMtCYP716A12-t46opAtCPR1-lip2t等表达盒通过重叠延伸PCR构建。opMtCYP716A12与t46opAtCPR1（opAtCPR1的N端46个氨基酸截短体）直接融合，不使用连接肽。
【数据】基因合成：武汉金开瑞生物工程有限公司；PCR方法：重叠延伸PCR；融合方式：无连接肽直接融合
2.3 质粒构建
将tHMG1和erg9基因分别克隆到pINA1269的Pml I位点，获得质粒p1（p1269tHMG1）和p2（p1269erg9）。将表达盒TEF1-opAtLUP1-XPR2t克隆到pINA1269的Sal I位点获得质粒p3（p1269opAtLUP1），将hp4d-erg9-XPR2t克隆到质粒p1的Cla I位点获得p4（p1269tHMG1erg9）。将tHMG1和erg9基因分别克隆到p3的Pml I位点，获得质粒p5（p1269opAtLUP1tHMG1）和p6（p1269opAtLUP1erg9）。上述质粒（补充表1）使用南京Vazyme生物技术有限公司的One Step Cloning Kit构建。质粒p0（pINA1269）至p6用限制性内切酶Not I线性化后整合到解脂耶氏酵母基因组中。
【数据】限制性内切酶：Pml I、Sal I、Cla I、Not I；试剂盒：One Step Cloning Kit（Vazyme Biotech，南京）
2.4 菌株构建
利用URA3作为筛选标记，将白桦脂酸合成相关表达盒整合到解脂耶氏酵母ATCC 201249的rDNA位点，获得菌株Yl-opAtLUP1、Yl-BA1和Yl-BA2（图S1）。以LEU2为筛选标记，将过表达关键基因的线性化质粒整合到Yl-BA2中，分别获得菌株Y0–Y6（图2A）。解脂耶氏酵母基因组中存在多拷贝整合位点zeta位点。以LEU2为筛选标记，将过表达关键基因的表达盒整合到Yl-BA2的zeta位点，分别获得菌株Y7–Y13（图2B）。解脂耶氏酵母的转化采用LiAc法进行。
【数据】筛选标记：URA3、LEU2；整合位点：rDNA位点、zeta位点；转化方法：LiAc法
2.5 工程菌株的摇瓶发酵
将工程解脂耶氏酵母菌株接种到5 mL YPD培养基中，在30°C、220 rpm条件下培养24小时作为种子培养液，随后将种子培养液接种到30 mL培养基中，在30°C、220 rpm条件下培养3天或5天。
【数据】种子培养：5 mL YPD，30°C，220 rpm，24h；发酵培养：30 mL培养基，30°C，220 rpm，3天或5天
2.6 羽扇醇和白桦脂酸的分析
取1 mL培养液中的细胞，在10,000g条件下离心10分钟收集。向细胞中加入0.5 mL乙酸乙酯提取羽扇醇和白桦脂酸，转移有机相并空气干燥。干燥的提取物在80°C下用BSTFA衍生化30分钟，然后进行GC–MS分析。使用Agilent Technologies 7890A GC系统（配备5975C insert XL EI/CI MSD检测器）和HP-5MS色谱柱（30 m × 0.25 mm × 0.5 μm）。样品进样量为1 μL，采用不分流进样模式。进样口温度和检测器温度分别设定为320°C和280°C。柱温箱在80°C保持1分钟，然后以20°C/min的速率升至310°C并保持18分钟。通过m/z 50–600范围内的全扫描产生质谱图用于代谢物鉴定。化合物通过比较保留时间和质谱图与标准品进行鉴定。产量以三次独立测定的平均值±标准差（误差线）表示。
【数据】离心：10,000g，10min；提取溶剂：0.5 mL乙酸乙酯；衍生化：BSTFA，80°C，30min；进样量：1 μL；进样口温度：320°C；检测器温度：280°C；柱温程序：80°C保持1min → 20°C/min升至310°C保持18min；扫描范围：m/z 50–600；色谱柱：HP-5MS（30 m × 0.25 mm × 0.5 μm）
2.7 qPCR基因拷贝数测定
采用实时定量PCR（qPCR）测定整合到解脂耶氏酵母基因组中的基因（opAtLUP1、opCYP716A12、t46opAtCPR1、tHMG1和erg9）的拷贝数；以erg5（MVA途径中的一个基因，GenBank ID：XM_500188）作为内参。扩增各基因的开放阅读框并定量，使用附表S3所列引物生成标准曲线。使用Super PreMix Plus（SYBR Green）试剂盒（天根生化科技，北京）进行三次重复qPCR。采用CT（阈值循环数）法测定目标基因的拷贝数。结果见图S4。
【数据】内参基因：erg5；qPCR试剂盒：Super PreMix Plus（SYBR Green）；重复次数：3次；分析方法：CT法
2.8 RT-qPCR转录水平基因表达研究
在18小时时取5 mL样品，用磷酸盐缓冲液稀释后保存在液氮中。总RNA提取和cDNA合成按照Xue等人的方法进行。使用实时定量PCR（qPCR）进行转录水平基因表达的定量分析，所用引物列于附表S3。qPCR进行三次重复。目标基因的CT值以16S rRNA基因作为参考进行归一化。获得的数据采用2−ΔΔCT方法分析。
【数据】取样时间：18h；取样量：5 mL；保存方式：液氮；内参基因：16S rRNA；分析方法：2−ΔΔCT法
2.9 细胞总脂质、乙酰辅酶A、有机酸和鲨烯的定量
细胞总脂质的提取和测定参照Du等人的方法。使用在葡萄糖或甘油培养基中培养的500 mL培养液中的细胞提取脂质。菌株Y13的代谢物（如乙酰辅酶A、鲨烯和有机酸）在培养3天后进行分析。乙酰辅酶A使用乙酰辅酶A ELISA试剂盒（上海双赢生物科技有限公司，中国）测定。有机酸使用配备Shodex RI-201H检测器的Elite P230II高压泵系统在40°C下分析。色谱分离在65°C的Aminex-HPX-87H色谱柱上进行，以5 mM H2SO4为洗脱液，流速为0.6 mL/min。鲨烯使用配备203 nm紫外检测器的Elite P230II高压泵系统分析。色谱分离采用Hypersil C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 µm），以甲醇为流动相，流速为1 mL/min。
【数据】脂质提取：500 mL培养液；乙酰辅酶A测定：ELISA试剂盒；有机酸分析：Shodex RI-201H检测器，40°C，Aminex-HPX-87H柱，65°C，5 mM H2SO4，0.6 mL/min；鲨烯分析：UV 203 nm，Hypersil C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 µm），甲醇流动相，1 mL/min
研究结果
3.1 工程解脂耶氏酵母中白桦脂酸的异源生物合成
2,3-氧化鲨烯环化生成羽扇醇是白桦脂酸生物合成的起始步骤，催化该反应的酶——羽扇醇合酶LUP1已从拟南芥中分离获得。来源于蒺藜苜蓿的细胞色素P450单加氧酶CYP716A12是一种C-28氧化酶，催化羽扇醇转化为白桦脂酸，拟南芥的细胞色素P450还原酶CPR作为其氧化还原伴侣。由于解脂耶氏酵母是一种非常规酵母，对AtLUP1、MtCYP716A12和AtCPR1进行了密码子优化。
研究首先测试了解脂耶氏酵母是否适合异源生物合成羽扇醇。构建了表达盒TEF1p-opAtLUP1-xpr2t，整合到解脂耶氏酵母ATCC 201249的rDNA位点，获得9个阳性转化子。通过GC–MS分析阳性转化子的代谢物检测到前体羽扇醇。羽扇醇产量最高的菌株达到1.89 mg/L，命名为Yl-opAtLUP1。
随后测试了转入opMtCYP716A12和opAtCPR1能否使解脂耶氏酵母进行羽扇醇的C-28氧化。构建了TEF1p-opAtLUP1-xpr2t、EXP1p-opMtCYP716A12-mig1t和GPD1p-opAtCPR1-lip2t表达盒，整合到解脂耶氏酵母ATCC 201249的rDNA位点。通过GC–MS分析转化子代谢物鉴定到白桦脂酸，证明在解脂耶氏酵母中实现了白桦脂酸的异源生物合成。白桦脂酸产量最高的菌株达到0.32 mg/L，命名为Yl-BA1。
【数据】羽扇醇产量：1.89 mg/L；白桦脂酸产量：0.32 mg/L；阳性转化子数量：9个
3.2 通过细胞色素P450单加氧酶与细胞色素P450还原酶融合优化白桦脂酸产量
发酵后，Yl-BA1的白桦脂酸产量为0.32 mg/L，同时有1.13 mg/L羽扇醇未被转化，表明羽扇醇向白桦脂酸的转化效率不足。在之前的研究中发现，将PPDS（一种细胞色素P450型原人参二醇合酶）与t46AtCPR1（AtCPR1的N端46个氨基酸截短体）融合，在工程酿酒酵母中的催化活性比共表达PPDS和AtCPR1的菌株提高约4.5倍。因此，设计DNA表达盒EXP1p-opMtCYP716A12-t46opAtCPR1-lip2t，将opMtCYP716A12（去除终止密码子）与t46opAtCPR1（无ATG起始密码子）直接连接，以增强P450系统的催化活性。将该表达盒整合到解脂耶氏酵母ATCC 201249的rDNA位点，白桦脂酸产量最高的菌株达到1.53 mg/L，命名为Yl-BA2。对Yl-BA2发酵后代谢物的分析表明羽扇醇前体被完全消耗，证实了opMtCYP716A12与t46opAtCPR1融合策略的有效性。
【数据】Yl-BA1白桦脂酸产量：0.32 mg/L；剩余羽扇醇：1.13 mg/L；Yl-BA2白桦脂酸产量：1.53 mg/L；羽扇醇消耗：完全耗尽
3.3 通过过表达白桦脂酸合成途径关键基因优化白桦脂酸产量
HMGR1（羟甲基戊二酰辅酶A还原酶）是MVA途径中异源生物合成萜类化合物的主要限速酶。此前研究表明，在产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母中过表达tHMG1（删除500个N端氨基酸产生）可使β-胡萝卜素产量提高130%。在工程解脂耶氏酵母中过表达酿酒酵母tHMG1使α-法尼烯产量提高12%。由于存在重组异源酿酒酵母tHMG1，工程解脂耶氏酵母的柠檬烯产量仅提高约30%，而同源重组HMG1使柠檬烯产量提高18倍。本研究中过表达同源HMG1和tHMG1对其他三萜类化合物生物合成的影响几乎相同（数据未发表）。
构建质粒p1（图2A），线性化后转化到Yl-BA2中以过表达tHMG1。所得转化子中白桦脂酸产量最高为3.49 mg/L，比Yl-BA2高2.3倍，该菌株命名为Y1。对照菌株Y0的白桦脂酸产量与Yl-BA2几乎相同，表明亮氨酸缺陷不会对YPD培养基发酵产生负面影响。
对工程解脂耶氏酵母其他三萜类化合物生物合成的研究（数据未发表）表明，过表达鲨烯合酶erg9而非2,3-氧化鲨烯合酶erg1可提高三萜类化合物的产量。因此构建质粒p2（图2A），线性化后转化到Yl-BA2中过表达erg9，获得菌株Y2。该菌株产生2.46 mg/L白桦脂酸，比Yl-BA2提高1.6倍。
基于Yl-BA2菌株中缺乏羽扇醇的事实，推测羽扇醇向白桦脂酸的转化不是限速步骤，因此将重点放在羽扇醇的生物合成步骤上。构建质粒p3（图2A），线性化后转化到Yl-BA2中过表达opAtLUP1，获得菌株Y3，其白桦脂酸产量为5.47 mg/L，比Yl-BA2高3.6倍，验证了这一推测。
随后构建质粒p4至p6（图2A），线性化后分别转化到Yl-BA2中过表达tHMG1erg9、tHMG1opAtLUP1和erg9opAtLUP1，获得菌株Y4至Y6。Y4和Y5的产量分别比Y1和Y2有所提高，表明在Yl-BA2中过表达tHMG1erg9或tHMG1opAtLUP1对提高白桦脂酸合成是有效的。
在最初实验中，基因以单拷贝过表达，推测通过提高这些关键基因的拷贝数可能进一步提高白桦脂酸产量。为验证这一假设，将tHMG1、erg9、opAtLUP1、tHMG1erg9、tHMG1opAtLUP1、erg9opAtLUP1和tHMG1erg9opAtLUP1的表达盒分别整合到Yl-BA2的多拷贝zeta位点，构建菌株Y7至Y13（图2B）。将Y7至Y12的产量与Y1至Y6进行比较后发现，拷贝数的增加不一定带来产量提升。工程菌株Y13在zeta位点同时过表达tHMG1、erg9和opAtLUP1，获得了令人满意的结果。Y13产生9.41 mg/L白桦脂酸且无羽扇醇残留，比工程菌株Yl-BA2高6.2倍，表明解脂耶氏酵母是异源生物合成萜类化合物的有前景的平台。
【数据】tHMG1过表达（Y1）：3.49 mg/L，为Yl-BA2的2.3倍；erg9过表达（Y2）：2.46 mg/L，为Yl-BA2的1.6倍；opAtLUP1过表达（Y3）：5.47 mg/L，为Yl-BA2的3.6倍；Y13产量：9.41 mg/L，为Yl-BA2的6.2倍；羽扇醇残留：无
3.4 甘油替代葡萄糖提高白桦脂酸产量
解脂耶氏酵母是一种天然存在于富含蛋白质和脂质环境中的非常规酵母，许多研究表明优化碳源对提高工程菌株的代谢物产量至关重要。
【数据】原文未详述本节具体实验数据，详见后续图表
讨论与解读
本研究首次报道了在解脂耶氏酵母中构建白桦脂酸合成途径实现异源生物合成。通过P450酶融合和关键基因过表达，初始菌株的产量提高了30倍。最重要的是，以甘油为碳源获得的白桦脂酸产量远高于葡萄糖，突显了甘油作为碳源在工程解脂耶氏酵母异源生物合成高值萜类化合物方面的潜力。甘油通过提高MVA途径关键基因的表达和增加乙酰辅酶A的供应来提高白桦脂酸产量。随着对可持续发展的日益关注，将廉价废弃碳源转化为高价值化合物的必要性日益凸显。该研究进一步支持了甘油作为解脂耶氏酵母生产可再生化学品的底物的实用性。
编译者解读
从合成生物学应用角度看，该研究有三点值得关注：一是选用解脂耶氏酵母这一产油非常规酵母作为底盘，其天然的强乙酰辅酶A供应能力为三萜类化合物合成提供了优势；二是P450酶与还原酶的无连接肽融合策略有效解决了真核P450系统异源表达中电子传递效率低的问题；三是将生物柴油副产物甘油用作碳源，既降低了原料成本，又通过代谢调控提升了目标产物产量，体现了"废弃物资源化"的循环经济理念。然而，当前产量仍处于实验室水平，距离工业化生产尚有差距。后续可进一步结合启动子工程、蛋白工程及发酵工艺优化等手段提升产量。该研究为其他萜类化合物在解脂耶氏酵母中的异源生物合成提供了可借鉴的策略框架。
参考来源
Sun J. Glycerol improves heterologous biosynthesis of betulinic acid in engineered Yarrowia lipolytica. Chemical Engineering Science, 2019. DOI: 10.1016/j.ces.2018.10.052
DOI: 10.1016/j.ces.2018.10.052