来源：Novel multimodal cation-exchange membrane for the purification of a single-chain variable fragment from Pichia pastoris supernatant（Journal of Chromatography A）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
单链抗体片段（scFv）在生物医药领域应用广泛，但其下游纯化常受限于高电导率发酵上清液需预先换缓冲液的繁琐步骤。本研究开发了一种基于2-巯基吡啶-3-羧酸（MPCA）配基的新型耐盐阳离子交换膜（MMC-MPCA），可直接从毕赤酵母高电导率发酵上清液中以结合-洗脱模式捕获scFv。研究系统考察了吸附pH、停留时间、上样量等因素对动态结合载量（DBC）、产率和纯度的影响，在最优条件下将产品纯度从约83%提升至92–95%，并实现了高达180 mg/mL/min的生产率。
研究背景
过去几十年，生物制药市场经历了巨大增长，治疗性蛋白质因在疾病治疗中的重要性而成为增长焦点。这催生了对新型优化工艺设备和方法的需求——既要提高生产率、降低运营和制造成本，又要保持最小的负面环境足迹。生物制药制造中的一个关键工艺挑战是发酵后的产品捕获步骤。由于FDA和EMA对最终治疗产品纯度有严格要求，捕获和纯化产品至一定纯度至关重要。
工业上，填充树脂层析一直是蛋白质捕获和纯化的传统方式，其中蛋白A层析尤为关键，是大多数商业化单克隆抗体纯化策略的核心组成部分。然而，膜技术作为更新颖的替代方案，已用于细胞去除等多种工艺。本研究探索的是一种基于多模式配基2-巯基吡啶-3-羧酸制备的新型耐盐阳离子交换膜，其设计目标是能够直接从高电导率的毕赤酵母发酵上清液中捕获scFv——若成功，将消除离子交换捕获前需进行缓冲液更换的步骤。
研究方法
2.1 产scFv13R4的Komagataella phaffii（毕赤酵母）X-33菌株设计
编码scFv13R4蛋白的DNA序列首先经密码子优化，以实现其在毕赤酵母野生型X-33中的高效表达。随后，使用引物scFv13R4 αF1（GCATGAATTCATGGCAGAAGTCCAATTAG）和scFv13R4 αR1（GAATGCGGCCGCTCATAAGACTGCCAACTTAGTACC）通过PCR扩增该基因，引物分别携带额外的EcoRI和NotI限制性酶切位点。PCR产物克隆至载体pPICZα-A的EcoRI和NotI位点，使scFv13R4序列与载体上的α-因子分泌信号同框融合，以确保蛋白分泌。反向引物上的终止密码子使得生成的scFv13R4蛋白不融合表达载体上的His标签和C-myc标签。经电穿孔转化至大肠杆菌Stbl4后，在含25 μg/mL zeocin的LB琼脂平板上筛选，通过菌落PCR鉴定阳性重组质粒。一个重组质粒经SacI限制性内切酶线性化后，通过电穿孔导入毕赤酵母X-33。转化子在含1000 μg/mL zeocin的YPD平板上筛选，阳性克隆经菌落PCR验证。
【数据】菌株：毕赤酵母X-33；抗生素浓度：25 μg/mL（大肠杆菌）、1000 μg/mL（毕赤酵母）；培养基：LB、YPD；限制性酶：EcoRI、NotI、SacI
2.2 毕赤酵母发酵
2.2.1 预培养准备
将1 mL冻存的毕赤酵母（scFv13R4）菌液在室温下解冻。随后，将毕赤酵母（scFv13R4）划线接种于YPD平板（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖、20 g/L琼脂），于30°C孵育过夜。次日，取一接种环（10 μL接种环）毕赤酵母（scFv13R4）接种至250 mL摇瓶中的50 mL YPD培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖），于30°C、350 RPM振荡孵育过夜。第三天，将细胞离心沉淀（3500 × g，15 min，4°C，转子型号Sorvall Heraeus 75002000），重悬于30 mL缓冲发酵培养基21（BFM21）（含0.35%（v/v）85% H3PO4、0.119 g/L CaSO4、2.4 g/L K2SO4、1.95 g/L MgSO4·7H2O、0.65 g/L KOH、2.94 g/L Na3C6H5O7、5 g/L (NH4)2SO4、1.537 g/L NaOH、3.175%（v/v）甘油、4%（v/v）1 M醋酸盐缓冲液（64%（v/v）8.2%（w/v）C2H3NaO2、36%（v/v）5.724%（v/v）冰醋酸）、0.025%（v/v）消泡剂240，用NaOH或H3PO4调至pH 5.0），并补充0.75%（v/v）毕赤酵母痕量矿物质4（PTM4）（含0.51%（v/v）H2SO4、2 g/L CuSO4·5H2O、0.08 g/L NaI、3 g/L MnSO4、0.2 g/L Na2MoO4·2H2O、0.02 g/L H3BO3、0.5 g/L CoCl2、6.7 g/L ZnCl2、21.6 g/L FeSO4、0.2 g/L生物素），置于250 mL摇瓶中，于30°C、350 RPM孵育过夜。
【数据】培养基：YPD、BFM21；温度：30°C；转速：350 RPM；时间：过夜；离心：3500 × g、15 min、4°C；pH：5.0；PTM4补充量：0.75%（v/v）
2.2.2 补料分批发酵
发酵在1 L生物反应器（Applikon Biotechnology）中进行，初始工作体积750 mL。灭菌前，向生物反应器中加入750 mL BFM21培养基，将溶解氧（DO）和pH传感器（Applikon）安装于顶板并校准后者。灭菌条件为121°C、20 min，之后生物反应器连接至控制塔。向生物反应器中加入7.5 mL/L发酵培养基的PTM4补充液。温度设定为30°C，pH设定为5.0（由85% H3PO4和28–30% NH4OH控制），pO2设定为30%，空气/O2比例由总气体流量DO比例控制维持，气体流量维持在1700 mL/min，纯O2最大供给量设定为1000 mL/min。空气/O2比例根据维持DO在30%的需氧量而变化。预培养物以起始OD600为4接种至生物反应器中。每日监测OD600，当观察到溶解氧出现峰值时，引入含12 mL/L PTM4的50%甘油补料，流速为0.141 mL/min，过夜运行以增加细胞密度。次日关闭甘油补料，培养至观察到溶解氧峰值。此时，启动含12 mL/L PTM4的100%甲醇补料。
【数据】反应器体积：1 L；工作体积：750 mL；灭菌：121°C、20 min；温度：30°C；pH：5.0；pO2：30%；气体流量：1700 mL/min；纯O2上限：1000 mL/min；起始OD600：4；甘油补料：50%甘油+12 mL/L PTM4、0.141 mL/min；PTM4补充量：7.5 mL/L
2.2.3 甲醇补料策略
甘油补料分批培养后，监测OD600以确保其至少达到100，然后以0.014 mL/min的速率启动甲醇补料，以防止甲醇中毒。该流速维持过夜，使细胞完成从甘油到甲醇的代谢转换。当DO开始上升（表明甲醇饥饿而非中毒）时，流速增加至0.042 mL/min。随后，当搅拌速度开始从最大值1800 RPM下降时，流速逐渐增加至0.07 mL/min以避免甲醇中毒。甲醇补料速率的进一步调整基于空气/O2的气体比例。如果维持30% DO所需的纯氧量减少，则相应增加补料速率。基于气体比例的流速调整包括：0.084 mL/min、0.098 mL/min、0.112 mL/min，最终至0.14 mL/min。当气体比例保持稳定时，最大流速设定为0.182 mL/min，此值受玻璃生物反应器供氧能力的限制。整个甲醇补料分批培养持续4天。发酵结束时，收集全部发酵液于50 mL离心管中。
【数据】甲醇诱导前OD600阈值：≥100；甲醇流速梯度：0.014→0.042→0.07→0.084→0.098→0.112→0.14→0.182 mL/min；最大搅拌速度：1800 RPM；甲醇补料总时长：4天
2.2.4 上清液收获
为将细胞与发酵液上清液分离，将含发酵液和细胞的50 mL离心管离心（3500 × g，15 min，4°C，转子型号Sorvall Heraeus 75002000）。上清液收集至单独的50 mL管中，随后用0.2 µm PES膜过滤器（Fisherbrand，美国）过滤。
【数据】离心：3500 × g、15 min、4°C；过滤器：0.2 µm PES膜
2.3 膜制备与表征
2.3.1 无纺PBT膜的UV接枝
将无纺聚对苯二甲酸丁二醇酯（PBT）膜（75 × 50 mm，基重52 g/m2，平均纤维直径3.0 μm，孔隙率85%，平均孔径8.0 ± 0.5 μm，由Macopharma（法国图尔宽）提供）称重（W1），置于硼硅酸盐玻璃显微镜载玻片上。然后，将1 mL甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）接枝溶液（二苯甲酮（BP）与GMA摩尔比（BP:GMA）为1:20，含80%（v/v）1-丁醇）均匀分布至膜上，将第二块载玻片置于润湿的膜上方。将夹心膜暴露于UV灯（波长395 nm，强度5 mW/cm2，样品距光源3 mm）下，以诱导polyGMA在膜上的自由基聚合。照射时间范围为18至28 min，以实现所需的polyGMA接枝度（增重）16–18%。照射后，将膜在100 mL四氢呋喃（THF）中于超声浴中室温洗涤30 min，随后在100 mL甲醇中于超声浴中室温洗涤10 min。膜在室温下干燥后记录最终重量（W2）。polyGMA接枝度计算：增重 = (W2 − W1) × 100% / W1。
【数据】PBT膜尺寸：75 × 50 mm；基重：52 g/m2；纤维直径：3.0 μm；孔隙率：85%；孔径：8.0 ± 0.5 μm；BP:GMA摩尔比：1:20；UV波长：395 nm；UV强度：5 mW/cm2；样品距光源：3 mm；照射时间：18–28 min；目标增重：16–18%；洗涤：THF超声30 min+甲醇超声10 min
2.3.2 polyGMA接枝无纺PBT膜的功能化
为产生蛋白质捕获所需的表面化学性质，将80 mg 2-巯基吡啶-3-羧酸（MPCA）溶解于40 mL 1 M碳酸盐缓冲液（9.33%（w/v）Na2CO3、1%（w/v）NaHCO3，pH约11）中。随后，向溶液中加入8 mL异丙醇（IPA）。将膜浸泡于带挡板摇瓶中的该溶液内，置于60°C水浴中孵育16 h。孵育结束后，弃去缓冲液，将膜在纯水中剧烈振荡洗涤4次。洗涤后，将膜浸泡于100 mL 0.1 M H2SO4中，于50°C水浴孵育16 h。孵育结束后，将膜在纯水中剧烈振荡洗涤3次。
【数据】MPCA用量：80 mg；碳酸盐缓冲液：1 M、40 mL、pH约11；IPA：8 mL；孵育：60°C、16 h；洗涤：纯水4次；H2SO4处理：0.1 M、100 mL、50°C、16 h；最终洗涤：纯水3次
研究结果
3.1 毕赤酵母发酵生产scFv
按照相同方案进行了两次独立的发酵批次以产生含scFv的上清液。发酵使用经工程改造的毕赤酵母菌株，该菌株经甲醇诱导分泌抗β-半乳糖苷酶的scFv。两次发酵批次均在甲醇诱导前（诱导前）和培养结束时（诱导后）从上清液中收集样品用于scFv分析。诱导前和诱导后样品均进行Western blot分析（图1a）。在图1a中，泳道3和5分别显示批次1和批次2诱导后分泌型scFv的产生。在图1a的泳道2和4中，批次1和批次2分别观察到微弱得多的scFv条带（诱导前）。这表明即使没有甲醇诱导，也有一定程度的scFv被分泌——这一现象已知会发生在生物反应器中以甘油为碳源的诱导前培养物中。然而，诱导后样品中强烈的scFv条带表明，两个批次中scFv的产生主要归因于甲醇诱导。
为确定细胞去除后粗上清液中scFv的纯度，我们对诱导前和诱导后样品进行了SDS-PAGE分析，随后用考马斯亮蓝染色以显现所有蛋白质（图1b）。在图1b中，泳道4显示批次1的纯度为83%，泳道6显示批次2的纯度为83.9%（表1）。发酵后立即获得的这些纯度与其他生产生物体相比已异常之高。这是毕赤酵母的一大优势——它有可能简化和减少下游处理步骤的数量。
为定量两次发酵中分泌的scFv量，对Western blot进行了光密度分析（数据未显示）。光密度分析显示批次1和批次2的浓度分别为555.7 mg/L和395.0 mg/L（表1）。毕赤酵母中的重组蛋白产物高度依赖具体蛋白，文献报道范围很宽，滴度最高可达3 g/L。抗体片段（如scFv）的生产和分泌效率较低，但Zahrl等人（2022年）通过优化成功达到1.3 g/L的scFv滴度。需要指出的是，本研究聚焦于毕赤酵母产scFv的新型膜纯化，因此在未做任何优化的情况下达到的滴度是合理的。此外，两个scFv发酵批次均使用毛细管电泳进行了定量（数据未显示），结果与光密度分析非常接近，这为选择光密度法作为主要定量方法提供了信心。
【数据】scFv滴度：批次1为555.7 mg/L、批次2为395.0 mg/L；纯度：批次1为83%、批次2为83.9%；定量方法：光密度法（Western blot）、毛细管电泳
3.2 MMC-MPCA膜用于scFv纯化
用于scFv纯化的膜通过将聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（polyGMA）层接枝到聚对苯二甲酸丁二醇酯（PBT）膜上制备，增重16–18%。随后，按前述方法用MPCA对膜进行功能化。在GMA接枝前后及MPCA功能化后拍摄了扫描电子显微镜图像（图2）。图像显示纤维在膜制备过程中保持完整，纤维上的涂层使膜表面略微粗糙。在scFv纯化实验中，将12层膜的堆叠体装入直径1.0 cm的柱中。
【数据】膜堆叠：12层；柱直径：1.0 cm；接枝增重：16–18%
3.2.1 吸附pH对MMC-MPCA膜纯化scFv的影响
为确定膜在scFv纯化中效率最高的pH条件，在pH 4.0、4.5、5.0、5.5和6.0下进行了纯化试验。平衡缓冲液和样品的pH均调节至待测pH条件，以直接将毕赤酵母scFv上清液上样至柱上。洗脱采用pH 8.5的磷酸盐缓冲液并添加150 mM NaCl，因为计算机预测的scFv序列理论等电点（pI）约为8.5–9.2，在此pH下蛋白质上的净正电荷较少，结合强度较弱。此外，通过毛细管等电聚焦（cIEF）实验测定的pI估计在约F范围内（表2），与计算机预测值合理吻合。
纯化实验产生了不同级分用于分析，包括合并的流穿+洗涤（FT+W）、洗脱（E）和再生（R）。再生样品定义为与膜结合但未被洗脱缓冲液洗脱、而是被含0.5 M NaOH的再生缓冲液洗脱的蛋白质。对不同pH条件下各纯化实验产生的各种级分进行了SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色（图3）。光密度分析用于定量不同级分中的scFv（数据未显示），用于计算DBC、产率和纯度（表3）。为验证不同级分的定量量确实等于上样scFv量，对所有数据（包括后续章节）进行了质量平衡计算（数据未显示），质量平衡与上样量高度一致。
在pH 5.0和5.5时观察到的最高结合载量分别为36.72 mg/mL和36.01 mg/mL，而在pH 4.0和4.5时结合载量急剧下降至2.39和2.50 mg/mL（图4）。同样的观察结果在凝胶上清晰可见（图3a），其中泳道4和5分别显示pH 4.0和4.5的FT+W级分，其scFv条带远比pH 5.0及以上FT+W级分的更大更宽。pH 4.0和4.5时低结合载量的原因在于，大多数羧酸的pKa值约为3.5–4.5，这意味着MPCA配基在pH 4.0和4.5时因负电荷不足而无法作为阳离子交换剂运行。由于配基的净负电荷此时接近零甚至可能为正，导致与带正电荷的scFv产生排斥或仅存在弱静电相互作用。在pH 6.0时，结合载量降至28.94 mg/mL（图4），这可以解释为：随着吸附pH接近scFv的pI，scFv上的正电荷减少。
洗脱液中scFv的纯度随吸附pH从4.0升至6.0而增加（表3）。这一观察可归因于大多数宿主细胞蛋白（HCP）是酸性蛋白，在较高pH下其正电荷相对于scFv减少更多，从而使scFv的竞争性结合更强、纯度更高。在表3和图4中，pH 5.5时获得的79.0%总产率是不同pH条件中最高的。因此，后续所有结果均采用pH 5.5作为吸附pH。
图5展示了MMC-MPCA膜在pH 5.5下最佳scFv纯化性能的色谱图。该色谱图来自一次实验，其中将近30 mL上清液加样至膜柱（柱体积为0.255 mL，如前所述）。洗涤步骤使用平衡缓冲液完成。值得提及的是，毕赤酵母已被报道能在pH 3–7范围内生长。因此，可以在pH 5.5下进行发酵，然后将上清液直接上样至膜上，进一步简化发酵、回收和纯化流程——这对未来建立连续生产工艺具有意义。
【数据】吸附pH测试范围：4.0–6.0；最大DBC：pH 5.0为36.72 mg/mL、pH 5.5为36.01 mg/mL；低pH DBC：pH 4.0为2.39 mg/mL、pH 4.5为2.50 mg/mL；pH 6.0 DBC：28.94 mg/mL；最高总产率：pH 5.5为79.0%；洗脱缓冲液：pH 8.5磷酸盐缓冲液+150 mM NaCl；再生缓冲液：0.5 M NaOH；柱体积：0.255 mL；上清液上样量：约30 mL；pI估计：约8.5–9.2（计算）、cIEF约F（实验）
3.2.2 停留时间对MMC-MPCA膜纯化scFv的影响
pH优化后，测试了0.2至2.0 min的不同上样停留时间，以在不影响DBC和产率的前提下实现最高生产率。
【数据】停留时间测试范围：0.2–2.0 min（原文此节后续数据未在节选范围内详述）
讨论与解读
本研究考察了一种新型多模式、耐盐阳离子交换膜纯化毕赤酵母中产生并分泌的单链抗体片段的能力。确定膜实现最高DBC（39.06 mg/mL）的最适pH为5.5，而低于5.0的pH条件显著降低scFv结合。纯化在低至0.2 min的停留时间下成功进行，实现了180 mg/mL/min的生产率。然而，这仅适用于首次使用的膜。停留时间低于1 min的复用膜导致压降高达2 MPa。在合并的流穿和洗涤级分中观察到scFv并非归因于膜过载。即使减少scFv上样量，仍有10–20%比例的scFv存在于FT+W级分中，表明存在低质量或聚集的scFv。毕赤酵母上清液中约83%的初始scFv纯度经MMC-MPCA膜提升至92–95%。然而，这一提高后的纯度仍达不到治疗性蛋白质设定的高质量标准，因此下游处理流程中需要额外的纯化步骤。一个有吸引力的选择是探索基于亲和力的层析方法，可能利用对scFv特异的肽配基，以去除MMC-MPCA膜未能解决的杂质。
编译者解读
该研究的技术亮点在于将耐盐多模式配基与膜介质结合，直接处理高电导率发酵上清液，省去了传统离子交换前的换液步骤，这对简化连续生产工艺具有实际价值。膜介质因无扩散限制而支持极短停留时间（0.2 min），生产率达180 mg/mL/min，远超传统树脂柱——这是膜纯化的核心优势所在。但需注意，膜复用时的污染问题和10–20%的scFv损失提示了原料质量（聚集或片段化）对纯化效率的制约。从合成生物学应用视角看，将上游菌株工程（减少分泌蛋白异质性）与下游膜设计协同优化，或可进一步提升整体工艺的经济性与可靠性。
参考来源
Pham, D. N. (2024). Novel multimodal cation-exchange membrane for the purification of a single-chain variable fragment from Pichia pastoris supernatant. Journal of Chromatography A. DOI: 10.1016/j.chroma.2024.464682
DOI: 10.1016/j.chroma.2024.464682