来源：Expanding the genetic toolkit of Yarrowia lipolytica: Dynamic promoter engineering enables high-titer biosynthesis of 3-hydroxypropionic acid（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是生产平台化学品的优良微生物底盘，但精密调控工具的匮乏限制了其工业应用。本研究通过转录组分析和功能筛选，构建了包含82个梯度强度启动子和34个生长阶段响应启动子的综合工具包，并鉴定出三个含新型上游激活序列的强启动子。通过模块化部署这些工具优化3-羟基丙酸（3-HP）生物合成途径，工程菌株最终实现100.37 g/L的3-HP产量——这是迄今酵母系统中报道的最高滴度。
研究背景
代谢工程的快速发展使微生物成为高价值化学品生产的可持续平台，但异源途径整合引起的代谢通量失衡仍是关键挑战（Cui et al., 2023; Fan et al., 2024; Gao et al., 2022; Xu et al., 2022; Yu et al., 2023）。具有可调强度和动态调控能力的启动子对平衡代谢网络至关重要——酿酒酵母中利用66个启动子文库成功优化了(2S)-柚皮素生物合成（Gao et al., 2020）。然而，非常规底盘如解脂耶氏酵母——一种在有机酸耐受性和可再生原料利用方面具有独特优势的代谢多功能酵母——缺乏类似的遗传工具，限制了其在生物制造中的工业潜力（Jia et al., 2022; Thomsen et al., 2023; Wang et al., 2023c; Zhang et al., 2022）。现有天然和杂合启动子虽已用于构建合成脂质、有机酸、糖醇和萜类等化合物的细胞工厂（Jia et al., 2022; Thomsen et al., 2023; Wang et al., 2023c），但无法满足复杂途径中的时间调控需求或前体竞争问题（Blazeck et al., 2011; Liu et al., 2022; Sun et al., 2022; Tai & Stephanopoulos, 2013）。Wang等人近期表征了与碳氮代谢相关的启动子，其强度……
研究方法
2.1 菌株与质粒
以解脂耶氏酵母Po1f菌株（MatA, xpr2-322, axp-2, leu2-270, ura3-302）作为启动子表征、潜在UAS鉴定和3-HP生产菌株构建的背景菌株。本研究所用野生型和工程酵母菌株列于补充表3。大肠杆菌DH5α菌株用于质粒构建。PCR扩增和重叠使用Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶（Vazyme，南京，中国）进行。本研究所有质粒均采用Gibson组装方法克隆（Gibson et al., 2009）。DNA凝胶纯化和质粒提取试剂盒购自Omega Bio-tek。本研究使用的主要质粒列于补充表5。天然启动子和基因从解脂耶氏酵母Po1f基因组DNA中扩增获得。相应的启动子序列和编码基因详见补充表2。编码来自C. aurantiacus的丙二酰辅酶A还原酶（MCRCa）的基因经密码子优化适配解脂耶氏酵母，并由General Bio-tek（滁州，中国）合成。本研究所用基因的序列信息见补充表6。
【数据】菌株：Y. lipolytica Po1f（MatA, xpr2-322, axp-2, leu2-270, ura3-302）；宿主：E. coli DH5α；聚合酶：Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase；组装方法：Gibson assembly；MCRCa来源：C. aurantiacus，密码子优化合成
2.2 培养基与培养条件
LB培养基（5.00 g/L酵母提取物，10.00 g/L胰蛋白胨，10.00 g/L NaCl）用于大肠杆菌常规培养。YPD培养基（10.00 g/L酵母提取物，20.00 g/L胰蛋白胨，40.00 g/L葡萄糖）或YPG培养基（10.00 g/L酵母提取物，20.00 g/L胰蛋白胨，40.00 g/L甘油）用于解脂耶氏酵母培养。为维持质粒，添加抗生素氨苄青霉素（100.00 μg/mL）和潮霉素B（600.00 μg/mL）。使用酵母合成缺陷培养基-SD基础（TAKARA，北京，中国）和相应的氨基酸缺陷混合物筛选解脂耶氏酵母营养缺陷型转化子。每升3-HP发酵培养基含：7.50 g (NH₄)₂SO₄，14.40 g KH₂PO₄，0.50 g MgSO₄·7H₂O，0.10 g尿嘧啶，0.10 g亮氨酸，40.00 g葡萄糖，2.00 mL微量元素溶液和1.00 mL维生素溶液。每升微量元素溶液含：15.00 g C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈·2H₂O，4.50 g ZnSO₄·7H₂O，0.84 g MnCl₂·2H₂O，0.30 g CoCl₂·6H₂O，0.40 g Na₂MoO₄·2H₂O，4.50 g CaCl₂·2H₂O，3.00 g FeSO₄·7H₂O，1.00 g H₃BO₃和0.10 g KI。每升维生素溶液含：0.05 g生物素（D-），1.00 g D-泛酸钙，1.00 g烟酸，25.00 g肌醇，1.00 g盐酸硫胺素，1.00 g盐酸吡哆醛和0.20 g对氨基苯甲酸。摇瓶发酵时，3-HP生产菌株先在固体YPD平板上活化，然后转移到液体YPD中进行第二次活化，最后以2.00%接种比转入含40.00 g/L葡萄糖的50.00 mL YPD培养基中，培养72 h后测定3-HP滴度。补料分批发酵时，将−80°C保存的H6-4和H6-14菌株在固体YPD培养基上划线活化36 h。单菌落接种于含10.00 mL YPD培养基的50.00 mL摇瓶中，30°C、220 rpm振荡培养。培养24 h后，以2.00%接种量转入含100.00 mL YPD培养基的500.00 mL摇瓶中，30°C、220 rpm继续培养20 h。随后以5.00%接种量将二级种子培养物接入5-L生物反应器（BXBIO，上海，中国）启动3-HP发酵。补料分批发酵的最适条件为30°C、400 rpm和1 vvm。以含60.00–80.00 g/L葡萄糖的3-HP发酵培养基作为初始批次培养基。每4 h测定葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度降至10.00 g/L以下时，补充葡萄糖储液（500.00 g/L）。同时检测发酵液中的3-HP和生物量。
【数据】培养基：LB/YPD/YPG/SD；抗生素：氨苄青霉素100.00 μg/mL、潮霉素B 600.00 μg/mL；碳源：葡萄糖40.00 g/L或甘油40.00 g/L；摇瓶发酵：接种比2.00%，72 h；补料分批：30°C、400 rpm、1 vvm，初始葡萄糖60.00–80.00 g/L，补糖阈值10.00 g/L，葡萄糖储液500.00 g/L
2.3 转录组分析
基于解脂耶氏酵母Po1f菌株在YPD和YPG液体培养基中的生长情况，选取三个时期进行转录组测序：对数早期（12 h）、对数后期（24 h）和稳定期（60 h）。每个样品设三个重复。在每个培养阶段，收集1.00 mL样品于无菌离心管中，液氮速冻，−80°C保存，随后干冰运输。样品送至上海欧易生物技术有限公司进行总RNA提取和转录组测序分析。以NCBI提供的解脂耶氏酵母基因组序列（https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCA/001/761/485/GCA_001761485.1_ASM176148v1）作为参考基因组进行样品比对和分析。基于转录水平基因表达分析，将YPD-60 h和YPG-60 h样品的FPKM值从高到低排序。共选择82个呈现强、中、弱转录水平的基因作为候选基因。使用NCBI和KEGG数据库鉴定相应启动子序列，随后在基因组上进行注释。
【数据】取样时间点：12 h、24 h、60 h；样品量：1.00 mL；重复数：3；参考基因组：NCBI GCA_001761485.1；候选启动子数：82
2.4 荧光强度表征
启动子表征工作使用解脂耶氏酵母附加型载体（Cui et al., 2021）进行，由各鉴定启动子表达hrGFP基因。使用Zymogen Frozen EZ酵母转化试剂盒II（Zymo Research Corporation）将表达质粒导入解脂耶氏酵母Po1f。转化子在含600.00 μg/mL潮霉素B的平板上筛选。正确的单克隆菌株随后在添加相应潮霉素B的YPD液体培养基中，30°C、220 rpm培养24 h。以1.00%（体积比）比例接种于48孔板，每孔含600.00 μL补充相应潮霉素B的YPD、YPG和SD液体培养基。使用多功能酶标仪（Synergy HT, Biotek，美国）在30°C连续培养72 h期间，每20 min测量荧光和细胞密度（激发波长485 nm，发射波长528 nm）。测试组的荧光值通过减去不表达hrGFP的对照Po1f菌株获得的背景值进行校正，然后以OD600归一化。
【数据】筛选抗生素：潮霉素B 600.00 μg/mL；培养条件：30°C、220 rpm、24 h；接种比：1.00%（vol/vol）；孔板体系：48孔板，600.00 μL/孔；检测间隔：20 min；激发/发射波长：485/528 nm；检测时长：72 h
2.5 FAS1基因RT-qPCR分析
为比较携带下调启动子PD19、PD20、PD21的工程菌株与携带天然启动子的对照菌株中FAS1基因的相对表达水平，在不同时间点收集发酵样品进行实时定量PCR（RT-qPCR）分析。细胞沉淀通过−20°C离心收集，液氮淬灭，−80°C保存备用。使用Trizol试剂提取总RNA，并使用SynScript® III RT SuperMix（Cat#TSK314S，擎科）反转录为cDNA。RT-qPCR在StepOnePlus® RT PCR系统（Applied Biosystems）上使用ArtiCanCEO SYBR qPCR Mix（Cat#TSE401，擎科）进行。以肌动蛋白基因（YALI0D08272g）作为参考基因，采用2^(-ΔΔCT)方法进行相对定量分析。所有实验设三个重复。
【数据】参考基因：肌动蛋白YALI0D08272g；定量方法：2^(-ΔΔCT)；重复数：3；菌株：PD19、PD20、PD21及天然启动子对照
2.6 分析方法
使用分光光度计（Shimazu，日本）在600 nm处测定细胞密度。葡萄糖和3-HP浓度使用配备Aminex HPX-87H色谱柱（BioRad Laboratories, Hercules, CA，美国）和示差折光检测器（RID）的高效液相色谱（HPLC）测定。上样前所有样品经0.22 μm水相滤膜过滤。分析使用5.00 mM H₂SO₄作为流动相，流速0.6 mL/min，柱温维持35°C。
【数据】检测波长：OD600；HPLC柱：Aminex HPX-87H；流动相：5.00 mM H₂SO₄；流速：0.6 mL/min；柱温：35°C；滤膜：0.22 μm水相
2.7 统计分析
结果以平均值±标准误（SEM）表示。在启动子表征中……
【数据】统计方法：平均值±SEM
研究结果
3.1 全基因组规模挖掘解脂耶氏酵母内源启动子
为扩展解脂耶氏酵母启动子文库以实现代谢途径的精准动态调控，对Po1f菌株在葡萄糖（YPD）和甘油（YPG）培养基中不同生长阶段进行了RNA-seq分析（补充图1）。将稳定生长期样品的FPKM值按降序排列（补充图2）。根据先前报道，候选启动子长度设计为约1000 bp（Shabbir Hussain et al., 2016）。共选择82个代表从高到低不同转录水平的启动子作为候选，相应序列和编码基因详见补充表2。以Po1f基因组DNA为模板扩增启动子序列，克隆至附加型表达质粒中。以人源化绿色荧光蛋白（hrGFP）为报告蛋白，在YPD培养基中48 h时表征这些候选启动子的表达强度（图1a）。如图1b所示，启动子文库的荧光倍数变化达93.40倍。鉴定出PD02、PU12、PC48和PU13四个强启动子，其表达强度分别为常用启动子pTEFin（Tai & Stephanopoulos, 2013）的1.10倍、1.10倍、1.48倍和1.69倍。出乎意料的是，PC48启动子是pTEF的延长版本，其增强的表达可能由潜在调控序列引起。当5′内含子序列融合到PC48时，PC48in的表达显示出与pTEFin相似的增强效果（补充图3）。进一步在YPG（补充图4）和基本培养基SD（补充图5）中表征了启动子文库的荧光强度。虽然部分启动子存在差异，但在不同培养条件下梯度增强的趋势一致。此处发现的启动子丰富了解脂耶氏酵母的启动子文库，为代谢工程提供了更多选择。
【数据】启动子文库荧光倍数变化：93.40倍；强启动子相对pTEFin强度：PD02 1.10×、PU12 1.10×、PC48 1.48×、PU13 1.69×；启动子长度：约1000 bp；表征时间点：48 h
3.2 生长阶段依赖性启动子的表征
为表征候选启动子随生长阶段的响应行为，分别在对数早期（7 h）和对数后期（32 h）、稳定期早期（48 h）、中期（60 h）和后期（72 h）检测hrGFP荧光强度。观察到34个启动子的荧光强度随生长阶段发生变化。在这些生长阶段依赖性启动子中，13个启动子（PU01-PU13）被鉴定为生长上调型，在生长早期（7 h和32 h）活性较低，在稳定期（48 h、60 h和72 h）活性较高（图2a）。例如，PU13、PU12和PU11启动子在72 h的荧光强度分别比32 h高1.61倍、1.94倍和1.46倍。相反，21个启动子（PD01-PD21）被鉴定为生长下调型，在对数早期活性高但稳定期活性降低。如图2b所示，PD01、PD02、PD03和PD04启动子在72 h的强度比32 h分别低0.63倍、7.33倍、0.68倍和0.52倍。此外，将PU12、PU13和PC48三个强启动子在300 mL摇瓶中培养表征以验证生长阶段依赖性表达（图2c和2d）。结果表明，PU12、PU13和PC48启动子的相对荧光强度分别比常用pTEFin启动子高0.87倍、0.76倍和1.00倍。PU12和PU13的荧光强度随生长阶段增加而增强，与酶标仪表征结果一致。这些结果表明这些启动子在大规模系统中具有动态基因表达调控的潜在应用价值。
【数据】生长上调启动子：13个（PU01-PU13）；生长下调启动子：21个（PD01-PD21）；PU13/PU12/PU11在72 h vs 32 h：+1.61×/+1.94×/+1.46×；PD01-PD04在72 h vs 32 h：−0.63×/−7.33×/−0.68×/−0.52×；摇瓶验证相对pTEFin：PU12 +0.87×、PU13 +0.76×、PC48 +1.00×；检测时间点：7 h、32 h、48 h、60 h、72 h
3.3 强启动子PC48和PU13中潜在上游激活序列的鉴定
UAS是一类位于真核核心启动子上游的顺式调控序列，能够结合转录激活因子（图3a）（Li et al., 2022; Shabbir Hussain et al., 2016）。目前，来源于pXPR2启动子的UAS1B序列常被选用于构建强表达杂合启动子（Madzak et al., 1999）。pUAS1B8-TEF通过将八个UAS1B元件与pTEF启动子融合构建（Blazeck et al., 2011; Madzak et al., 2000）。为鉴定新型UAS，以25-bp步长逐步截短强组成型启动子PC48（图3b）和生长阶段依赖性启动子PU13（图3c）的5′区域。随着截短接近核心启动子，观察到不同的荧光强度变化模式——在不同区间呈现增加或减少趋势——表明启动子长度与启动子强度密切相关。在特定截短点出现荧光强度下降：PC48在525 bp处下降38.50%，625 bp处下降85.24%，850 bp处下降68.16%；PU13在600 bp处下降80.88%，675 bp处下降62.05%，850 bp处下降52.98%，提示存在潜在UAS。参考已报道的解脂耶氏酵母UAS长度（Madzak et al., 1999），在这些区间内为每个启动子定义了三个候选UAS（UAS1-3PC48和UAS1-3PU13）。将单拷贝UAS融合至pLEUmin核心启动子进行功能验证，结果显示UAS1PC48-pLEUmin将hrGFP表达增强1.30–1.74倍，而UAS1PU13-pLEUmin实现1.73–2.51倍激活，优于常规UAS1B（图3d）。为进一步探索潜在UAS在人工启动子构建中的应用，将1–8拷贝的UAS1PC48和UAS1PU13串联融合至核心启动子pLEUmin（补充图6a），然后在YPD培养基中表征其荧光强度。如补充图6b和4c所示，5×UAS1PC48或3×UAS1PU13融合pLEUmin达到阳性对照（pTEFin、pUAS1B8-TEF）的强度，但峰值表达延迟（稳定期：48–72 h vs. 对照24 h）。这些数据证明UAS1PC48和UAS1PU13的潜在UAS可用于解脂耶氏酵母中目标基因表达的功能性激活。
【数据】截短步长：25 bp；PC48荧光下降：525 bp处−38.50%、625 bp处−85.24%、850 bp处−68.16%；PU13荧光下降：600 bp处−80.88%、675 bp处−62.05%、850 bp处−52.98%；UAS1PC48-pLEUmin激活倍数：1.30–1.74×；UAS1PU13-pLEUmin激活倍数：1.73–2.51×；最佳拷贝数：5×UAS1PC48或3×UAS1PU13
3.4 利用梯度强度启动子对3-HP生物合成途径进行组合表达优化
作为启动子文库的功能验证，在解脂耶氏酵母中对丙二酰辅酶A途径进行模块化调控以合成平台化学品3-HP（图4a）。首先，在Po1f菌株中表达来自Chloroflexus aurantiacus的关键酶丙二酰辅酶A还原酶（MCR），所得H0-1菌株仅积累0.02 g/L 3-HP（补充表4）。为进一步提高3-HP生物合成，将MCR拆分为MCR-C（氨基酸550–1219）和MCR-N（氨基酸1–549）两个结构域，MCR-C结构域催化丙二酰辅酶A还原为丙二酸半醛，MCR-N结构域将丙二酸半醛还原为3-HP（补充图7）（Liu et al., 2013）。随后在pTEFin、PC48和PU13启动子调控下将这些结构域导入解脂耶氏酵母，所得菌株的3-HP滴度分别为0.75 g/L、0.57 g/L和0.26 g/L。如先前报道，具有N940V、K1106W和S1114R三个氨基酸残基突变的突变体MCR-C具有更高活性（Liu et al., 2016）。因此，使用相同启动子过表达MCR-C和MCR-N基因。如图4b和4c所示，携带由PC48启动子表达MCR-C*和MCR-N的H2-2菌株产生2.47 g/L的高3-HP，比对照菌株H1-1提高3.33倍。这些结果表明异源独立表达MCR结构域可在解脂耶氏酵母中实现3-HP生产。对于多基因生物合成途径，共……
【数据】H0-1菌株：0.02 g/L 3-HP；单结构域表达（pTEFin/PC48/PU13）：0.75/0.57/0.26 g/L；H2-2菌株（PC48启动子）：2.47 g/L，为H1-1的3.33倍；突变位点：N940V、K1106W、S1114R
3.5 补料分批发酵
【数据】原文未详述
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究从不同生长阶段的解脂耶氏酵母Po1f菌株RNA-seq数据中挖掘出82个内源启动子，构成梯度强度覆盖93.40倍荧光变化的启动子工具包。强启动子PC48和PU13分别达到pTEFin强度的1.48倍和1.69倍。34个生长阶段依赖性启动子的开发在解脂耶氏酵母中尚属首次。利用新表征的启动子元件模块化调控3-HP生物合成途径，最终工程菌株以葡萄糖为碳源实现100.37 g/L的3-HP产量和0.21 g/g葡萄糖的得率——这是迄今报道的最高3-HP产量。该研究为代谢网络的动态调控和高效细胞工厂的构建提供了宝贵参考，也为生物基3-HP的高效合成奠定了基础。
编译者解读
该研究最值得借鉴之处在于"先建库、后筛选、再应用"的系统策略——从转录组数据出发构建启动子库，以荧光报告基因完成功能验证，再将启动子特性与代谢途径的具体需求精准匹配。梯度启动子平衡MCR两结构域表达、生长下调启动子削弱脂肪酸合成竞争通量、强启动子强化丙二酰辅酶A前体供给，三层调控逻辑清晰且具有可移植性。100.37 g/L的产量数据极具说服力，但需注意该数值可能依赖高密度补料发酵条件，其在小试规模的可重复性和向其他产物途径的普适性仍有待进一步验证。
参考来源
Kang, F. (2025). Expanding the genetic toolkit of Yarrowia lipolytica: Dynamic promoter engineering enables high-titer biosynthesis of 3-hydroxypropionic acid. Bioresource Technology. DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132656
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132656