来源：Peptide-assisted lipofection enables efficient non-viral delivery of large CRISPR/Cas9 constructs for genome editing applications（Biomedicine & Pharmacotherapy）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
CRISPR/Cas9大片段质粒的体内外递送一直是基因治疗的核心瓶颈。本研究开发了肽辅助脂质转染（PAL）系统，通过在Lipo2000/pDNA复合物上偶联富含精氨酸的融合肽TAP，实现了高达98.7%的HEK293T细胞转染效率，成功递送29 kb大质粒并维持高细胞活性，基因编辑中实现了44.1%的插入缺失形成效率。小鼠体内实验证实了肝脏组织的持续基因表达。PAL为大型基因载荷递送提供了病毒载体之外的安全新选择。
研究背景
CRISPR/Cas9系统自2012年发现以来，已成为革命性的第三代基因组编辑工具。其应用已从基础基因编辑扩展到基因调控、表观遗传修饰及疾病诊疗。然而，CRISPR/Cas9技术的疗效高度依赖于合适的递送方式——DNA、mRNA或蛋白形式的Cas9各有局限：mRNA递送虽能快速瞬时表达并降低脱靶效应，但稳定性差且生产成本高；蛋白（RNP）递送作用最直接、脱靶最低，却面临大规模生产困难和细胞摄取效率低的问题。大质粒递送更是难上加难——传统电穿孔（EP）虽能递送大片段，却伴随严重的细胞损伤；常规脂质转染对大质粒的包装和递送效率低下。开发既能高效递送大质粒、又能保持细胞活性的非病毒载体，是当前基因治疗亟待解决的关键问题。
研究方法
2.1 材料
两个质粒pU6-(BbsI)_CBh-Cas9-T2A-mCherry（pCas9；Addgene #64324，9283 bp）和pMasterE（Addgene #165080，29,350 bp）购自Addgene。融合肽TAP（PKKKRKVGCGRRRRRRRRRRR）由LifeTein LLC合成并经HPLC纯化。琼脂糖（BioShop Canada, Inc.）、10,000× TopRed核酸凝胶染料（GenomicBase）、1× TAE缓冲液和6× DNA上样缓冲液（Biofact Co., Ltd.）用于琼脂糖凝胶电泳。1× TAE缓冲液由Tris（Glentham Life Sciences Ltd.）、冰醋酸（Merck）和EDTA（GenomicBase）配制。猪肠黏膜来源的肝素钠盐（Sigma-Aldrich）用于评估pDNA稳定性。含10%胎牛血清（FBS）（Corning）和1%青霉素-链霉素（Life Technologies）的Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）（Corning）作为细胞培养基。血清减量Opti-MEM™、0.25%胰蛋白酶-EDTA（1×）、Pierce™ BCA蛋白测定试剂盒和FastDigest BpiI（BbsI）购自Thermo Fisher Scientific Inc.。PBS片剂购自Life Technologies。Arthur™细胞分析玻片（NanoEnTek）用于荧光细胞计数。Lipofectamine™ 2000（Lipo2000）和KDalert™裂解缓冲液购自Thermo Fisher Scientific Inc.。D-Plus™ CCK细胞活力测定试剂盒购自Donginbiotech Co., Ltd.。FavorPrep™质粒DNA提取Mini Kit和EndoFree Plasmid Maxi Kit分别购自Favorgen和Qiagen。LaboPass™凝胶提取试剂盒、基因组DNA分离试剂盒和PCR纯化试剂盒购自Cosmogenetech Co., Ltd.。T4多核苷酸激酶（PNK）和T4 DNA连接酶分别购自New England Biolabs和Promega。2× DNA-free DLRTaq Master Mix（CellSafe）用于聚合酶链反应（PCR）。定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）中，使用Tri-RNA试剂（Favorgen）提取总RNA，随后使用含gDNA去除剂的ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix（TOYOBO Co., Ltd.）进行逆转录。qPCR使用GoTaq® qPCR Master Mix（Promega）进行。四种内吞抑制剂——盐酸氯丙嗪、甲基-β-环糊精、细胞松弛素D（来自Zygosporium mansonii）和菲律宾菌素III（来自Streptomyces filipinensis）购自Merck（Hesse, Germany）用于机制研究。作为细胞周期阻滞诱导剂，阿非迪霉素购自Merck。Label IT®质粒递送对照Cy3（2700 bp，Mirus Bio）、Hoechst 33342（Invitrogen）和Lysotracker Green DND-26（Invitrogen）用于PAL转运的荧光分析。体内研究中，异氟烷（Hana Pharm. Co., Ltd.）作为麻醉剂。Matrigel基质胶和10%中性缓冲福尔马林溶液分别购自Becton, Dickinson and Company和Sigma-Aldrich。苏木精H和伊红Y（1%醇溶液）（H&E）试剂购自BioGnost Ltd.用于组织学分析。
2.2 PAL的制备
各pDNA使用EndoFree® Plasmid Maxi Kit纯化，并用去离子水稀释至1 μg/μL浓度。TAP溶于去离子水至0.5 mg/mL浓度，实验前保存于−20°C。PAL形成的第一步，按照制造商方案在Opti-MEM™中形成pDNA与Lipo2000的脂质复合物。随后将TAP以特定N:P比（肽中氮与pDNA中磷酸之比）加入脂质复合物中。在室温（25°C）孵育20分钟后即得PAL。
2.3 凝胶阻滞分析
通过凝胶阻滞分析评估PAL形成。使用0.5 μg pCas9与0:1、0.25:1、0.5:1、1:1、2.5:1、5:1、10:1、15:1和20:1比例的TAP按上述方法制备PAL。将6×上样缓冲液加入PAL后，将各PAL上样至用1× TAE缓冲液（40 mM Tris，20 mM乙酸，1 mM EDTA，pH 8.6）和10,000× TopRed核酸凝胶染料配制的1%（w/v）琼脂糖凝胶。使用电泳系统（Mupid-2plus；Optima, Inc.）在100 V下电泳30分钟。使用凝胶成像系统（LSG1000；iNtRON Biotechnology）采集各凝胶图像。
【数据】pCas9用量：0.5 μg；TAP N:P比：0:1–20:1；凝胶浓度：1%（w/v）；TAE缓冲液：40 mM Tris/20 mM乙酸/1 mM EDTA，pH 8.6；电泳：100 V，30 min
2.4 粒径与zeta电位测量
PAL的粒径分布和zeta电位分别通过动态光散射和电泳光散射测量。使用0.8 μg pCas9与5:1比例TAP按上述方法制备PAL。将PAL用无核酸酶水稀释10倍后，取1 mL稀释液加入一次性折叠毛细管池（Malvern Panalytical Ltd.），使用Zetasizer（Zetasizer Ultra；Malvern Panalytical Ltd.）测量。
【数据】pCas9用量：0.8 μg；TAP比例：5:1；稀释倍数：10×；测量体积：1 mL；仪器：Zetasizer Ultra
2.5 PAL中pDNA的稳定性
在含血清的细胞培养环境中评估PAL中pDNA的稳定性。制备含1 μg pCas9和5:1比例TAP的PAL。将10%（v/v）FBS加入微量管中的PAL后于37°C孵育，在各时间点（6、12、24、36和48 h）取130 μL样品。为使pDNA从PAL中解离，加入10 μg肝素，随后于37°C孵育30 min。将含或不含肝素的PAL上样至1%（w/v）琼脂糖凝胶，使用电泳系统在100 V下电泳35 min。使用凝胶成像系统对剩余pDNA成像。
【数据】pCas9用量：1 μg；TAP比例：5:1；FBS浓度：10%（v/v）；孵育温度：37°C；取样时间点：6/12/24/36/48 h；肝素用量：10 μg；电泳：100 V，35 min
2.6 SEM成像
通过SEM成像分析PAL形态。使用100 ng pCas9与5:1比例TAP制备PAL。将25 μL PAL滴在铝箔上，用冷冻干燥机（TFD8503；IlShinBioBase）冻干后，将铝箔固定在样品台上并镀铂。使用SEM（JSM-7800F；JEOL Ltd.）在15 kV加速电压、50,000×放大倍数下成像。
【数据】pCas9用量：100 ng；TAP比例：5:1；样品量：25 μL；加速电压：15 kV；放大倍数：50,000×
2.7 PAL介导的pDNA转染
本研究中使用的pCas9中，Cas9和mCherry由T2A肽分隔表达。pMasterE编码增强绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因。鉴于Cas9与mCherry表达水平成比例，通过mCherry或EGFP荧光表达分析评估转染效率。本研究使用的所有细胞均在含10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM中、37°C和5% CO2标准条件下培养。HEK293T细胞以每孔105细胞密度接种于24孔板，过夜孵育。使用0.8 μg pCas9与不同比例（1:1、2.5:1和5:1）TAP按上述方法制备PAL。将细胞培养基更换为血清减量Opti-MEM™后加入PAL处理，培养24 h。随后更换为新鲜DMEM，再培养24 h。洗涤和胰蛋白酶消化后，细胞用PBS洗涤两次，取20 μL上样至细胞分析玻片。使用荧光细胞计数器（Arthur™；NanoEntek）计数并成像荧光阳性细胞。为验证优化PAL在不同细胞系中的应用，对以下细胞系进行Cas9-mCherry蛋白荧光分析。HEK293T、MCF-7、MDA-MB-231和HeLa细胞以每孔1.2 × 105细胞密度接种于24孔板，过夜孵育。使用1 μg pCas9与5:1比例TAP制备PAL并按上述方法转染各细胞。Lipo2000试剂按制造商方案作为阳性对照。48 h后，向细胞加入100 μL裂解缓冲液，在摇床（RF300；ForBioKorea Co., Ltd.）上4°C孵育20 min。取40 μL细胞裂解液转移至384孔黑色板（Corning），使用多功能微板读取器在激发波长580 nm、发射波长610 nm处测量荧光。
【数据】细胞密度：HEK293T 105/孔，其他细胞系1.2 × 105/孔；pCas9用量：0.8 μg（HEK293T）/1 μg（其他细胞系）；TAP比例：1:1、2.5:1、5:1；转染时间：24 h + 24 h；裂解缓冲液：100 μL；孵育：4°C，20 min；检测体积：40 μL/孔；激发/发射波长：580/610 nm
研究结果
3.1 肽辅助脂质转染的表征
凝胶阻滞分析（图2A）用于分析不同N:P比下PAL复合物中pDNA的迁移情况。对于TAP-pCas9相互作用，N:P比增加导致条带向上迁移，表明复合增强。相比之下，PAL-pCas9复合物表现出截然不同的行为——即使在低肽浓度（0.25:1）下，也观察到显著的pDNA阻滞。完全pDNA复合发生在1:1 PAL比例。值得注意的是，在≥5:1 PAL比例时，DNA条带变得微弱可见或无法检测。这种与传统脂质转染的显著差异证实了PAL独特的凝聚特性。凝胶阻滞分析揭示了PAL与pCas9的卓越复合效率，在较高N:P比下形成紧密凝聚结构，有效屏蔽DNA与嵌入染料的结合。后续表征研究基于其最佳凝聚能力选用5:1 PAL比例。
动态光散射（DLS）分析用于确认传统脂质转染与PAL之间流体动力学半径和zeta电位的差异（图2B、C）。Lipo2000复合物平均粒径为507.1 nm，多分散指数（PdI）较高，为0.548。相比之下，PAL粒径增至平均1461 nm，但PdI值适宜（0.294）。此外，Lipo2000测得非均匀的弱负电荷（−10.2 mV），而PAL观察到均匀的弱正电荷（11.66 mV）。这一归因于TAP的正电荷提示其具有增强的细胞穿透潜力。初步SEM观察显示PAL的平均水合粒径范围为1000–1500 nm（图2E）。该结果与图2B中显示的粒径分布一致。
模拟细胞条件（37°C，10%血清）下的pDNA稳定性分析结果显示，PAL相比传统脂质转染具有更优的保护能力（图2D）。PAL在长达48 h内维持凝聚复合物结构，表现为孔中持续存在DNA条带而无游离pCas9。相比之下，脂质复合物在血清暴露6 h后出现pDNA阻滞，可能是血清蛋白相互作用所致，48 h后出现明显降解迹象。裸pCas9对照组在血清暴露后立即降解，从6小时时间点起即无可见DNA条带。此外，相同时间点通过DLS测量了PAL的粒径分布模式（图S1）。约1000 nm的最高强度峰随时间推移分解为小粒径峰，从803 nm降至77 nm。这种在保持pDNA完整性的同时向更小、更多样化形态的转变表明PAL具有适应性特性，可能促进有效的细胞摄取和核穿透。总体而言，这些发现凸显了PAL作为先进基因递送系统的前景——兼具强效pDNA保护、适应性理化特性和生理条件下的增强稳定性，与传统脂质转染相比可能转化为细胞环境中更高的功效。
【数据】Lipo2000粒径：507.1 nm，PdI 0.548，zeta电位 −10.2 mV；PAL粒径：1461 nm，PdI 0.294，zeta电位 +11.66 mV；SEM粒径范围：1000–1500 nm；稳定性时间：48 h；DLS粒径变化：803→77 nm
3.2 转染效率评估
PAL-pCas9复合物在HEK293T细胞中展现出优于EP的转染效率（图3A、S2）。荧光细胞计数分析显示，PAL-pCas9各比例（1:1、2.5:1和5:1）的Cas9-mCherry阳性细胞群显著高于EP-pCas9（92%、97.1%和98.7% vs 50.1%；p = 0.012、0.0057和0.0053）。平均荧光强度（MFI）在PAL-pCas9组也显著增强，较裸pCas9增加2.6至3.3倍，而EP-pCas9仅增加1.7倍（图S1）。5:1 PAL比例表现最佳，转染效率显著高于1:1比例（p = 0.036）。
与EP相比，PAL-pCas9复合物表现出更优的细胞回收率和活力（图3C、D）。在HEK293T细胞中，PAL-pCas9组回收率为80.3–93.6%，显著高于EP-pCas9（10.6%，p = 0.000070、0.044和0.041）。同样，在原代人真皮成纤维细胞（HDFn）中，PAL-pCas9维持94–104%的细胞活力，而EP-pCas9仅产生30.3%的活力（p = 0.0011、0.00030和0.011）。这些发现表明PAL-pCas9系统不仅增强转染效率，还维持高细胞活力和回收率，在两方面均优于传统EP方法。
PAL系统在向HEK293T细胞转染大型pDNA（pMasterE，29,350 bp）方面表现出优于EP的效率（图3E、S3）。在10:1 N:P比下，PAL-pMasterE实现显著更高的转染率（86.7% EGFP阳性细胞），而EP-pMasterE为54.3%，提升1.6倍（p = 0.050）。MFI分析显示，与裸pMasterE相比，PAL-pMasterE增加2.2倍，EP-pMasterE增加1.6倍（图3F），但该差异无统计学意义（p = 0.068）。这些结果表明PAL在转染大型pDNA方面具有优越性能，无论转染百分比还是表达强度均如此。
PAL系统在转染大型pDNA时也表现出显著更好的细胞回收率和活力（图3G、H）。在HEK293T细胞中，10:1 PAL-pMasterE的回收率为117.3%，而EP-pMasterE仅为4.2%，提升28倍（p = 0.026）。在原代人真皮成纤维细胞（HDFn）中，PAL-pMasterE维持65%的细胞活力，EP-pMasterE为46%，提升1.4倍（p = 0.0000038）。值得注意的是，PAL处理细胞保持原有形态和高细胞密度，而EP处理细胞显示形态改变，提示细胞应激。这些发现强调了PAL在高效递送大型pDNA的同时保持细胞活力和恢复能力，尤其在挑战性大质粒方面优于EP。
PAL-pCas9的转染效率在多种细胞系中进行了系统评估，包括HEK293T及癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231和HeLa。通过定量细胞裂解液中的mCherry荧光进行评估，结果如图4所示。各细胞系数据以两种图形格式呈现：左侧图为归一化至总蛋白含量的相对荧光单位（RFU），右侧图显示PAL相对Lipo2000的倍数变化。PAL-pCas9在所有检测细胞系中均表现出较裸pCas9显著增强的转染效率，倍数增加范围为4.8至43.4。此外，PAL-pCas9始终优于广泛使用的商业转染试剂Lipo2000。具体而言，PAL介导的mCherry表达强度相对Lipo2000在HEK293T中增加3.1倍、MCF-7中增加4.4倍、MDA-MB-231中增加2倍、HeLa细胞中增加2.9倍。所有差异均具有统计学意义（p = 0.0018、0.0016、0.0021和0.0048）。
【数据】HEK293T转染率：PAL-pCas9 92–98.7% vs EP-pCas9 50.1%；MFI倍数：PAL 2.6–3.3× vs EP 1.7×；HEK293T回收率：PAL 80.3–93.6% vs EP 10.6%；HDFn活力：PAL 94–104% vs EP 30.3%；pMasterE转染率：PAL 86.7% vs EP 54.3%；MFI倍数：PAL 2.2× vs EP 1.6×；pMasterE回收率：PAL 117.3% vs EP 4.2%（28倍）；HDFn活力：PAL 65% vs EP 46%；细胞系倍数变化：HEK293T 3.1×、MCF-7 4.4×、MDA-MB-231 2×、HeLa 2.9×
3.3 基因编辑效率和mRNA表达水平评估
使用mCherry作为瞬时表达模型靶标，评估了PAL系统递送all-in-one pCas9-crRNA（图5A、S4）的基因编辑效率。图5B显示了应用pCas9（原始质粒）和pCas9-crmCherry（含crmCherry序列的重组质粒）后mCherry表达的相对MFI值。背景扣除和归一化后，经pCas9处理的HEK293T细胞显示100% mCherry MFI，而经pCas9-crmCherry处理的细胞仅显示11.9% mCherry MFI，表明mCherry表达显著降低（p = 0.0059）。这一荧光显著下降归因于非同源末端连接（NHEJ）修复导致的mCherry敲除。
【数据】pCas9组mCherry MFI：100%；pCas9-crmCherry组mCherry MFI：11.9%；p = 0.0059
（注：原文方法部分还包含qRT-PCR步骤、机制研究（内吞抑制剂和细胞周期阻滞）、体内动物实验等详细内容，此处因原文节选截断未能完整呈现，按原文未详述处理。）
讨论与解读
PAL系统作为基因递送平台相比EP具有多项优势。与EP相比，PAL在有效递送大质粒的同时实现更高的细胞回收率和细胞活力，从而获得显著更高的转染效率和蛋白表达。这些发现可归因于以下因素：（i）细胞摄取：PAL通过脂筏介导的内吞机制进入细胞，这是细胞天然存在的过程，因此PAL利用细胞固有的转染途径递送质粒，细胞损伤极小。相比之下，EP通过在细胞膜上产生孔隙或长pDNA的机械作用破坏膜结构而造成显著损伤，导致细胞回收率存在巨大差异。此外，作为脂质复合物，PAL的脂质组分有助于提供内吞所需的必需脂质。另一方面，未与pDNA结合的高浓度游离阳离子肽可与细胞膜相互作用——精氨酸残基的胍基与脂质磷酸基之间的氢键诱导负膜曲率，从而通过囊泡出芽和塌陷机制促进细胞内摄取。通过这些机制，PAL有效最大化细胞内化效率，实现安全高效的大质粒递送。
【编译者解读】PAL系统的核心巧思在于将细胞穿透肽（TAP）的膜活性与脂质体的内吞逃逸能力"叠加"，而非简单替换——这使其在保持高转染效率的同时避开了电穿孔的膜损伤代价。98.7%的转染率和44.1%的indel效率在非病毒载体中颇为亮眼，尤其对29 kb级大质粒的递送能力值得关注。但PAL粒径达1461 nm且体内数据仍限于局部注射，其向全身性递送的转化路径尚需更多验证。从合成生物学应用角度看，该系统为大型基因回路、多基因编辑工具包的功能验证提供了温和高效的体外工具，若能在靶向性和可规模化生产上继续优化，有望成为病毒载体之外的有力补充。
参考来源
Ryu YC. Peptide-assisted lipofection enables efficient non-viral delivery of large CRISPR/Cas9 constructs for genome editing applications. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2025. DOI: 10.1016/j.biopha.2025.118838
DOI: 10.1016/j.biopha.2025.118838