来源：CRISPR-Cas9 genome editing reveals that the Pgs gene of Fusarium circinatum is involved in pathogenicity, growth and sporulation（Fungal Genetics and Biology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
松树脂溃疡病是由松树脂溃疡病菌（Fusarium circinatum）引起的全球性松树毁灭性病害。本研究利用基于原生质体的CRISPR-Cas9介导基因组编辑技术，在三个不同菌株中对一个推定致病基因进行了功能性表征。该基因被命名为Pgs，编码一个小的分泌蛋白。敲除突变体在营养生长、无性产孢及致病性上均显著低于野生型。该研究为F. circinatum的功能基因研究开辟了新途径。
研究背景
松树脂溃疡病菌（Fusarium circinatum）是全球最具破坏性的松属病原真菌之一，可侵染松树所有生命阶段，导致幼苗根部和根颈病害以及成熟树木的树脂溃疡和枯梢。尽管对该病菌的群体生物学、遗传学和基因组学已有较多了解，但其致病性的分子机制仍不清楚。转录组数据显示寄主植物早期有效的植物激素信号传导起重要作用，但分子基础尚未阐明。本研究利用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，对三个不同F. circinatum菌株中的一个推定致病基因进行功能表征，以期揭示该基因在致病性中的角色。
研究方法
2.1 菌株、常规培养与DNA提取
本研究使用了三株F. circinatum分离物（CMWF350、CMWF24和CMWF1807），均保藏于南非比勒陀利亚大学森林与农业生物技术研究所（FABI）的镰刀菌培养物保藏中心（CMWF）。分离物CMWF350（FSP34）分离自加利福尼亚州发病松树组织，具有全基因组序列数据（De Vos et al., 2024; Wingfield et al., 2018）。分离物CMWF24（FCC1035）源自南非普马兰加省采集的发病P. patula幼苗（Santana et al., 2016）。分离物CMWF1807分离自南非夸祖鲁-纳塔尔省一株10年生P. greggii人工林树木溃疡前缘（Fru et al., 2017）。
菌株常规培养条件为：25°C、90 mm培养皿、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA），添加300 mg/L硫酸链霉素（Sigma-Aldrich, Mannheim, Germany），培养7天。DNA提取按先前描述的方法进行（Phasha et al., 2021b）。
【数据】培养基：PDA（含300 mg/L硫酸链霉素）；温度：25°C；时间：7天；培养皿：90 mm
2.2 推定致病基因的计算机模拟表征
本研究所靶向的基因源自一项初步的全基因组关联研究（Swalarsk-Parry et al., 未发表）。将该基因的序列数据和推断的氨基酸序列数据通过BLASTn和BLASTp分析，与美国国家生物技术信息中心（NCBI; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）及MycoCosm数据库（Grigoriev et al., 2014）中的序列进行比较。为鉴定功能重要的结构域和保守位点，使用在线版InterProScan（https://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence）（Jones et al., 2014）分析序列。使用SignalP 6.0（Teufel et al., 2022）检测该基因是否编码含信号肽的蛋白质，使用EffectorP 3.0（Sperschneider and Dodds, 2022）判断该蛋白是否为效应蛋白。预测蛋白还通过Bologna Unified Subcellular Component Annotator（BUSCA）在线工具（Savojardo et al., 2018）进行了分析。利用先前F. circinatum-松树互作体内研究产生的转录组数据（Visser et al., 2019）确定该基因是否表达。
【数据】分析工具：BLASTn/BLASTp、InterProScan、SignalP 6.0、EffectorP 3.0、BUSCA；数据库：NCBI、MycoCosm
2.3 sgRNA的设计、合成与测试
sgRNA的设计按先前描述的方法（Wilson and Wingfield, 2020）特异靶向目标基因。sgRNA由一个与目标基因区域互补的原间隔区（20个核苷酸，nt）和一个Cas9结合的76-nt支架区组成（图1）。
通过手动搜索目标基因内的5' NGG 3'序列三联体来鉴定潜在的原间隔区，这些序列被注释为原间隔区相邻基序（PAM）（Wilson and Wingfield, 2020）。随后使用CLC Main Workbench V 21.0.3（Kim et al., 2013）中实施的BLASTn搜索，将鉴定出的PAM和原间隔序列与基因组其余部分进行比较，以确保潜在原间隔区在目标基因之外没有相似性，从而降低Cas9脱靶效应的可能性。此外，使用Vienna RNA Websuite中包含的RNAfold WebServer（Gruber et al., 2008）分析了不含PAM序列的组合原间隔区和支架序列。该步骤用于验证sgRNA折叠成正确的三维结构以便Cas9酶有效结合（图1）。
sgRNA使用EnGen® sgRNA合成试剂盒（Streptococcus pyogenes，New England Biolabs Inc.）合成。简言之，将T7启动子序列（5' TTCTAATACGACTCACTATAG 3'）添加到原间隔区5'端，将试剂盒特异性序列（5' GTTTTAGAGCTAGA 3'）添加到3'端。经5'和3'端修饰的原间隔区寡核苷酸由Inqaba Biotec合成，并按照制造商方案用于生成全长sgRNA。合成的sgRNA在1× TAE（40 mM Tris-乙酸盐，2 mM EDTA，pH 8.5）缓冲液中，于1%（w/v）琼脂糖（SeaKem®）凝胶上以GelRed®核酸凝胶染料（Biotium）染色电泳观察。sgRNA使用Monarch® RNA Cleanup Kit（New England Biolabs Inc.）纯化，并使用Qubit™ RNA Assay Kit（Thermo Scientific™）按制造商方案定量。
为评估RNP复合物的形成和切割能力，确保sgRNA能有效引导Cas9到达目标基因，并在PAM序列上游的互补区域内发生DNA切割，进行了以下测试：将合成的sgRNA与S. pyogenes Cas9核酸酶EnGen® Spy Cas9 NLS（New England Biolabs Inc.）按制造商方案使用。简要步骤为：30 nM sgRNA和30 nM Cas9在NEBuffer™ 3.1存在下于25°C预孵育10分钟。然后向混合物中加入总计3 nM的DNA靶标，随后在37°C孵育15分钟。DNA靶标使用降落PCR方法获得，采用Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer（Thermo Scientific™）及引物FCPPFTR和FCPPRTR（表S1和S2）。DNA靶标使用Sephadex® G-50（Sigma-Aldrich）清洁，并使用Qubit™ DNA Assay Kit按制造商方案定量。RNP复合物对PCR产物的切割使用上述琼脂糖凝胶电泳观察，预期可见两条较小的条带，而完整靶标区域为一条较大的条带。
【数据】sgRNA结构：20-nt原间隔区 + 76-nt支架区；预孵育：30 nM sgRNA + 30 nM Cas9，25°C，10 min；切割反应：3 nM DNA靶标，37°C，15 min；电泳：1× TAE，1%琼脂糖凝胶
2.4 dDNA的设计与合成
本研究中使用的dDNA设计用于介导目标基因被编码潮霉素B抗性基因盒的序列替换（图2）。
为此，dDNA片段设计包含一个与目标基因上游基因组区域同源的5'侧翼区，随后是抗性基因盒，最后是与目标基因下游基因组区域同源的3'侧翼区。为此目的，使用Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer以及引物FCPP5F、FCPP5RHYGF和FCPP3FHYGR、FCPP3R3（表S1），通过降落PCR（表S2）分别扩增5'和3'侧翼区。5'侧翼的反向引物和3'侧翼的正向引物带有约25-nt的额外序列，与潮霉素B抗性基因盒末端的5'和3'各自序列重叠（图2）。使用引物HygF和HygR（表S1和S2）从pCB1004质粒中扩增潮霉素B抗性基因盒，该质粒从大肠杆菌（Carroll et al., 1994）中提取，使用QIAGEN Plasmid Mini Kit按制造商方案进行。扩增子用Sephadex® G-50清洁，并使用BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1（Life Technologies）和AB13100 Automated Capillary DNA sequencer（Thermo Fisher Scientific）在比勒陀利亚大学测序中心（南非比勒陀利亚）进行测序。
使用LongAmp® Taq 2× Master Mix（New England Biolabs Inc.）进行重叠延伸PCR（表S3），在单次反应中将三个组分连接成dDNA片段（Zhao et al., 2019）。仅添加5'侧翼正向引物（FCPP5F）和3'侧翼反向引物（FCPP3R3），因为附着在5'侧翼3'端和3'侧翼5'端的重叠区域分别充当潮霉素B抗性基因盒的引物（图2B）。组装的dDNA片段使用上述电泳方法观察，使用Lambda DNA/EcoRI + HindIII Marker 3梯状标记（Thermo Scientific）。扩增子按前述方法清洁，然后以引物步移法进行长读长Sanger测序，使用引物FCPP5F、HygF、HygR和FCPP3R3（表S1）获得约9 kb的叠连序列读段。
【数据】潮霉素B抗性基因盒来源：pCB1004质粒；重叠延伸PCR酶：LongAmp® Taq 2× Master Mix；侧翼重叠序列：约25 nt
研究结果
3.1 推定致病基因的计算机模拟表征
将本研究中检测的推定致病基因的编码序列与先前从F. circinatum感染的松树组织产生的转录组数据进行比较，结果显示该基因在植物体内表达上调（Visser et al., 2019）。SignalP分析表明预测蛋白含有一个信号肽。分析报告的概率评分为0.9989，即推断蛋白N端的前24个氨基酸代表一个通常将蛋白靶向分泌途径的信号肽（Teufel et al., 2022）。BUSCA分析表明成熟蛋白可能（预测评分=1）被分泌，因为它被赋予了"细胞外空间"基因本体（GO）术语，GO编号为0005615（Binns et al., 2009）。EffectorP以0.75的概率预测该蛋白代表一个质外体效应蛋白，即分泌到植物组织质膜外空间的蛋白质（De Wit, 2016）。这些预测得到InterProScan的证实，其将前24个残基注释为信号肽，将蛋白其余部分注释为"非细胞质"结构域。InterProScan未检测到其他保守结构域。
将目标基因编码区的核苷酸序列和推断蛋白序列与NCBI数据库中的序列进行比较，结果显示与F. circinatum中注释为"致病性蛋白"的基因（登录号KAF5663390）和Fusarium subglutinans中的相应基因（登录号XM_036676922.1）具有高度相似性（>96%）。这两个基因都是在先前的一项基因组学研究中通过计算机模拟注释的，没有支持基因功能的实验证据（Kim et al., 2020）。其余大多数BLAST命中也是如此。使用MycoCosm的BLAST工具获得了类似结果，唯一例外是Fusarium graminearum中的基因FGSG_07755，该基因有额外信息可用。它与F. circinatum目标基因共享89.4%的mRNA和89.3%的蛋白序列同一性，且先前已被证明参与F. graminearum侵染小麦的过程（Hoang, 2017）。
【数据】SignalP概率评分：0.9989（前24 aa为信号肽）；BUSCA预测评分：1（分泌）；EffectorP概率：0.75（质外体效应蛋白）；序列同一性：>96%（NCBI）、89.4% mRNA/89.3%蛋白（FGSG_07755）
3.2 敲除突变体与转化对照
sgRNA靶向目标基因中距第一个核苷酸66-nt的区域。将该sgRNA与EnGen® Spy Cas9 NLS结合制备的RNP复合物如预期切割了靶向的双链DNA区域。这通过从完整的478-bp扩增子产生对应于66-bp和412-bp的两条明显条带得到证实。
在dDNA存在下，预组装的RNP复合物也有效介导了目标基因被潮霉素B抗性基因盒的替换，因为F. circinatum原生质体的转化产生了大量推定转化子。尽管能够在添加150 μg/ml潮霉素B的PDA上生长，使用引物FCPPI5F、FCPPI5R、FCPPI3F和FCPPI3R的PCR用于确认基因盒在来自所有三个菌株的转化子中整合到正确位置。对于三个野生型菌株中的每一个，还分离了一个转化对照菌株，其中dDNA整合到基因组其他位置而未破坏目标基因。Southern blot分析确认所有敲除菌株和转化对照菌株均为单拷贝整合。
【数据】sgRNA靶位点：距目标基因第一个核苷酸66 nt处；切割产物：66 bp + 412 bp（完整扩增子478 bp）；筛选浓度：150 μg/ml潮霉素B；整合方式：单拷贝
3.3 营养生长与产孢
菌落形态和分生孢子座形成以及分生孢子的形状和大小在各菌株间相似，无论其基因型如何（图3和图S2）。
所有菌株的分生孢子也在25°C孵育约12小时后萌发，表明基因敲除对这些特性的影响有限。然而，在培养物中观察到色素沉着的差异，野生型菌株和转化对照比浅色的敲除突变体显得更紫色。此外，所有菌株都产生气生菌丝，但敲除菌株的气生菌丝数量似乎比野生型和转化对照略有增加。
生长测定进一步表明，三个F. circinatum菌株的敲除突变体在25°C孵育7天后，在PDA上产生的菌落均显著小于野生型（p < 0.1）（图3）。其平均菌落直径范围为32 mm至39 mm，而野生型菌株为48 mm至54 mm（图3B）。转化对照的平均菌落直径与野生型菌株无显著差异。类似地，与转化对照和野生型菌株相比，敲除突变体的分生孢子产量显著（p < 0.01）降低（图4），而野生型菌株产生的分生孢子数量与转化对照相似。
【数据】菌落直径：敲除突变体32–39 mm vs 野生型48–54 mm；生长条件：25°C，7天，PDA；产孢差异：p < 0.01；孢子萌发时间：约12 h（25°C）
3.4 致病性测定
在使用离体松树枝条的测定中，敲除突变体的致病力显著低于转化对照和野生型菌株（p < 0.1）（图5）。
三个敲除突变体引起的病斑长度范围为1.2 mm至4.8 mm，而野生型菌株产生的病斑为5.0–6.9 mm。野生型菌株引起的病斑长度与转化对照菌株无显著差异。在对照处理中，即用无菌PDA接种离体松树枝条，未观察到病斑发展（图5）。使用F. circinatum特异性引物对从病斑中重新分离的真菌进行PCR（对突变体的潮霉素B抗性基因盒部分进行测序），确认病斑是由接种时使用的相同菌株引起的。
【数据】病斑长度：敲除突变体1.2–4.8 mm vs 野生型5.0–6.9 mm；显著性：p < 0.1；对照处理：无菌PDA接种无病斑
讨论与解读
本研究开发并应用了基于CRISPR-Cas9的F. circinatum基因删除流程，在三个菌株中敲除了目标基因，并通过一系列表型特征对敲除突变体进行了表征。所有敲除突变体在离体P. patula枝条上引起的病斑、营养生长和产孢数量方面均较各自野生型菌株显著降低。据此，研究者建议将本研究中表征的推定致病基因命名为Pgs，以反映其参与致病性（pathogenicity）、生长（growth）和产孢（sporulation）。
该基因敲除系统涉及Cas9效应蛋白与sgRNA的体外结合形成RNP复合物，再与原生质体结合进行转化。使用体外预组装的RNP通常被认为比使用编码Cas9和相应sgRNA的质粒转化更有优势，特别是可以避免Cas9表达不足和潜在的随机基因组整合。此外，在丝状真菌中使用基于质粒的方法在组成型启动子下引入Cas9也可能导致Cas9过表达，随时间推移产生脱靶效应。相比之下，使用RNP复合物转化确保了Cas9仅在短时间内存在，降低了脱靶风险。
本研究中的原生质体在光镜下呈球形（图6），分生孢子座及分生孢子的形态特征如图7所示。
编译者解读
该研究是CRISPR-Cas9基因编辑技术在F. circinatum中的成功应用范例。选择RNP复合物递送策略而非质粒载体，体现了对丝状真菌编辑特异性的精细考量——瞬时表达Cas9可最大限度减少脱靶整合。将致病性、生长与产孢三种表型归因于单一基因Pgs，为后续解析该小分泌蛋白在松树-病原互作中的分子机制提供了明确靶标。值得注意的是，计算机模拟预测该蛋白为质外体效应蛋白，但实验证据仍属表型层面，蛋白互作与寄主靶点的鉴定是未来值得深挖的方向。对林业病理学而言，这一编辑平台也为其他镰刀菌物种的功能基因组学研究提供了可推广的技术路线。
参考来源
van Dijk A. CRISPR-Cas9 genome editing reveals that the Pgs gene of Fusarium circinatum is involved in pathogenicity, growth and sporulation. Fungal Genetics and Biology, 2025.
DOI: 10.1016/j.fgb.2025.103970
DOI: 10.1016/j.fgb.2025.103970