来源：Microbial synthesis of L-fucose from glycerol and glucose in engineered Escherichia coli（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
L-岩藻糖因在人体内以岩藻糖基化形式发挥多种生理和药学功能而备受关注，但其微生物从头合成研究起步较晚，碳通量的精细调控是瓶颈。本研究以大肠杆菌MG1655为底盘，通过基因组整合、质粒表达、竞争通路敲除及动态开关等多重策略，构建了重组菌株FZWP03。该菌株以甘油为底物摇瓶发酵可合成2.68 g/L L-岩藻糖。进一步引入pfkA关闭型动态开关和基于天然隐蔽质粒的无抗生素系统，最终在补料分批发酵中分别实现21.38、5.05和5.95 g/L的产量。
研究背景
L-岩藻糖（6-脱氧-L-半乳糖）是自然界中六碳糖岩藻糖的主要存在形式，也是哺乳动物系统利用的唯一左旋单糖。它主要以N-连接和O-连接聚糖及糖脂的结构组分存在，末端岩藻糖基化修饰在细菌、藻类、植物和动物等多种物种中发挥关键生物学作用。此外，L-岩藻糖是2′-岩藻糖基乳糖（2′-FL）等结构的基本单糖构件，而2′-FL是目前鉴定出的最丰富的人乳低聚糖。随着人乳低聚糖2′-FL获准用于婴儿配方奶粉补充，L-岩藻糖的市场需求稳步增长。未缀合的L-岩藻糖本身无不良效应和遗传毒性，具有多种值得深入研究和商业开发的生理功能。然而，微生物细胞工厂中碳通量的精细重布线是从头生物合成的关键，仍需进一步研究。
研究方法
2.1 质粒与菌株
本研究所用全部质粒和菌株分别列于表1和表2。DH5α用作质粒克隆的宿主菌。大肠杆菌MG1655用作原始菌株。FZ和FZWP系列菌株均通过多重代谢改造来源于MG1655，用于生产L-岩藻糖。质粒p15AY和pTFY02用于表达密码子优化的α1,2-岩藻糖基转移酶和α-L-岩藻糖苷酶。质粒pCY01来源于pCas，呈温度敏感性，用于构建控制pfkA基因表达的关闭型动态开关。质粒pMUT1K和pMUT2S来源于大肠杆菌Nissle 1917，用于无抗生素发酵研究。所有质粒均按照标准质粒构建方案构建。
【数据】宿主菌：DH5α；原始菌株：E. coli MG1655；质粒：p15AY、pTFY02、pCY01、pMUT1K、pMUT2S；抗生素抗性：原文未详述
2.2 基因编辑
采用CRISPR-Cas9系统进行基因编辑，包括DNA片段插入或基因删除，操作方法参照前期研究。为删除lacZ基因，构建了含其特异性N20序列的pTargetF-lacZ质粒；lacZ基因的上下游同源臂从MG1655基因组扩增，通过重叠延伸PCR（OE-PCR）组装成一个DNA片段。将pTargetF-lacZ质粒连同同源DNA片段电转化至含有pCas的宿主细胞中。阳性菌株用于后续基因编辑。类似地，rhaA、wcaJ、pfkA基因被依次删除。
人工构建的P_J23119-manA-manB-manC-gmd-wcaG基因簇被插入fucIK基因位点，从而使fucIK的天然启动子能够转录上述基因簇。fucIK基因簇的上下游同源臂以及含P_J23119启动子的五个基因均从MG1655基因组扩增。上述片段经多轮OE-PCR组装成一个完整的DNA片段，即用于fucIK位点基因编辑的供体DNA。
【数据】基因编辑系统：CRISPR-Cas9；删除基因：lacZ、rhaA、wcaJ、pfkA；插入基因簇：P_J23119-manA-manB-manC-gmd-wcaG；插入位点：fucIK；同源臂来源：MG1655基因组；电转化宿主：含pCas的细胞
2.3 摇瓶培养与培养基
LB培养基（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨和10 g/L NaCl）用于大肠杆菌菌株的培养。L-岩藻糖生产培养基每升含：25 g甘油/葡萄糖、8 g乳糖、13.5 g KH₂PO₄、4.0 g (NH₄)₂HPO₄、1.7 g柠檬酸、1.4 g MgSO₄·7H₂O、4.5 mg硫胺素，以及10 mL微量元素溶液（含10 g/L FeSO₄·7H₂O、2.2 g/L ZnSO₄·7H₂O、1.0 g/L CuSO₄·5H₂O、0.38 g/L MnSO₄·H₂O、0.02 g/L Na₂B₄O₇·10H₂O、0.1 g/L (NH₄)₆Mo₇O₂₄和2.0 g/L CaCl₂）。葡萄糖和甘油等碳源分别单独灭菌，在接种时与硫胺素一同加入培养基。如需要，向培养基中添加50 mg/L卡那霉素和/或50 mg/L壮观霉素。
首先，从平板上挑取单个阳性菌落，接种至含5 mL LB培养基的试管中，于37°C（含pCY01质粒的菌株为30°C）过夜培养。随后，将种子培养物转移至含100 mL发酵培养基的500 mL挡板摇瓶中，进行72小时培养。培养条件为37°C、220 rpm振荡10–12小时，随后温度切换至25°C继续培养。
【数据】LB培养基配方：5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl；发酵培养基：25 g/L碳源、8 g/L乳糖、13.5 g/L KH₂PO₄、4.0 g/L (NH₄)₂HPO₄、1.7 g/L柠檬酸、1.4 g/L MgSO₄·7H₂O、4.5 mg/L硫胺素；抗生素：50 mg/L卡那霉素和/或50 mg/L壮观霉素；种子培养：5 mL LB、37°C（或30°C）过夜；发酵培养：100 mL/500 mL挡板摇瓶、72 h、37°C 10–12 h、220 rpm后转25°C
2.4 补料分批发酵
采用1.5 L和5 L生物反应器进行补料分批发酵。含初始20 g/L甘油的发酵培养基接种8–10%（v/v）的种子培养物。菌株在37°C下培养至OD₆₀₀达到20，随后温度切换至25°C进行产物合成。发酵过程中，通过自动添加NH₃·H₂O（14%，w/v）维持pH为6.8。补料溶液（500 g/L甘油或500 g/L葡萄糖、10 g/L MgSO₄·7H₂O和0.2 g/L硫胺素）用于补充碳源。发酵过程中每六小时取样一次，根据残余甘油浓度和摄氧速率实时调整甘油补加速率。
【数据】反应器：1.5 L和5 L生物反应器；初始甘油：20 g/L；接种量：8–10%（v/v）；生长温度：37°C至OD₆₀₀=20；生产温度：25°C；pH：6.8（NH₃·H₂O自动调节，14% w/v）；补料液：500 g/L甘油或葡萄糖、10 g/L MgSO₄·7H₂O、0.2 g/L硫胺素；取样间隔：6 h
2.5 分析方法
发酵液样品以12,000 rpm离心10分钟后，取上清液经0.22 μm Millipore滤膜（Millipore Corp, Bedford, MA, USA）过滤以去除颗粒物。发酵液中L-岩藻糖、葡萄糖和甘油的浓度采用高效液相色谱（HPLC）Essentia LC-16系统（Shimadzu, Kyoto, JP）测定，配备RID-20A示差折光检测器（Shimadzu, Kyoto, JP）。使用两根色谱柱——Shodex SUGAR SH1011（Showa Denko K.K., Tokyo, JP）和Rezex ROA-Organic Acid H+（8%）柱（Phenomenex Inc., Torrance, CA）——分析温度维持在60°C，流速为0.6 mL/min，以分离样品中各组分。流动相为5 mM H₂SO₄洗脱液（图S2）。
【数据】离心：12,000 rpm、10 min；滤膜：0.22 μm；HPLC系统：Essentia LC-16（Shimadzu）；检测器：RID-20A；色谱柱：Shodex SUGAR SH1011和Rezex ROA-Organic Acid H+（8%）；柱温：60°C；流速：0.6 mL/min；流动相：5 mM H₂SO₄
研究结果
3.1 L-岩藻糖从头生物合成的初始菌株工程
L-岩藻糖的从头生物合成途径可分为三个模块（图1）：（1）从葡萄糖或甘油合成F6P（模块1）；（2）从F6P合成GDP-L-岩藻糖（模块2）；（3）将GDP-L-岩藻糖转化为L-岩藻糖（模块3）。前两个模块是大肠杆菌的天然途径，其中F6P的合成是中心代谢途径，因此无需进一步强化。GDP-L-岩藻糖的合成是中心代谢途径的旁路途径，碳通量进入较低，因此需要过表达该途径。由manA、manB、manC、gmd和wcaG基因编码的五个内源酶——甘露糖-6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶和GDP-L-岩藻糖合酶——可依次催化F6P转化为GDP-L-岩藻糖。GDP-L-岩藻糖随后进入第三模块：GDP-L-岩藻糖与补充的乳糖在外源α1,2-岩藻糖基转移酶催化下发生岩藻糖基化产生2′-FL，再由引入的α-L-岩藻糖苷酶水解以释放L-岩藻糖。第三模块是大肠杆菌的非内源代谢途径，因此需要过表达。然而，大肠杆菌可通过内源途径利用L-岩藻糖——由L-岩藻糖异构酶和L-岩藻糖激酶（分别由fucI和fucK编码）催化L-岩藻糖分别转化为L-岩藻酮糖和L-岩藻酮糖-1-磷酸。据前期研究，fuc调控子参与大肠杆菌中L-岩藻糖作为碳源和能源的利用。此外，近期研究揭示FucR是fuc调控子的阻遏蛋白，L-岩藻糖的存在可触发去阻遏并诱导fuc基因簇的转录。
因此，为阻断L-岩藻糖降解并增强GDP-L-岩藻糖合成，首先删除fucIK基因簇，随后将合成操纵子P_J23119-manA-manB-manC-gmd-wcaG整合至染色体（图2A），得到菌株FZ（MG1655ΔlacIΔlacZΔfucIK::P_J23119-manA-manB-manC-gmd-wcaG）。为实现L-岩藻糖生物合成，选取三种α1,2-岩藻糖基转移酶（来自幽门螺杆菌的FutC和FuT2、来自大肠杆菌O126的WbgL）和两种α-L-岩藻糖苷酶（来自双歧杆菌的AfcA、来自木薯黄单胞菌的α-L-岩藻糖苷酶）进行途径优化。这些酶已被成功用于生产L-岩藻糖。为表达这两种异源酶，将低拷贝质粒p15AY和高拷贝质粒pTFY02分别改造以表达上述基因，产生十种质粒（图2B）。将这些质粒转化至菌株FZ，生成系列菌株FZ01–FZ10，筛选最优表达组合。
菌株FZ01至FZ07的L-岩藻糖产量可忽略不计，仅FZ08–FZ10（从p15AY载体表达afcA）表现出较高产量，其产量水平随α1,2-岩藻糖基转移酶活性而变化。携带p15AY-LA质粒的FZ10表现出最高的L-岩藻糖产量（2.39 g/L），其次是FZ08（2.20 g/L）和FZ07（1.19 g/L）。这三株菌的生物量积累相当，最终OD₆₀₀值介于16至17之间（图2C、D）。启动子强度对下游酶表达及最终产量的影响大于质粒拷贝数。结果表明，α1,2-岩藻糖基转移酶活性顺序为：WbgL > FutC > FucT2。α-L-岩藻糖苷酶未能表现出与AfcA相当的预期功能。因此，选择wbgL和afcA用于表达后两种酶。无论以甘油还是葡萄糖为碳源，单独过表达α1,2-岩藻糖基转移酶和α-L-岩藻糖苷酶均无法积累L-岩藻糖。然而，P_J23119-manA-manB-manC-gmd-wcaG的联合过表达使L-岩藻糖产量显著增加。实际上，产量提高主要归因于两个策略：（1）人工操纵子含有强启动子，且每个基因与极强RBS（BS0030）结合，因此这些基因的表达水平较高，不受RscA和RcsB等全局调控因子的控制；（2）胞内L-岩藻糖的积累诱导了fucIK天然启动子以及人工基因簇的转录。因此，模块2（从F6P合成GDP-L-岩藻糖）的通量强度进一步增强，进而进入模块3积累目标产物L-岩藻糖。
【数据】模块1：葡萄糖/甘油→F6P；模块2：F6P→GDP-L-岩藻糖（manA、manB、manC、gmd、wcaG）；模块3：GDP-L-岩藻糖+乳糖→2′-FL→L-岩藻糖；菌株FZ：MG1655ΔlacIΔlacZΔfucIK::P_J23119-manA-manB-manC-gmd-wcaG；FZ10产量：2.39 g/L；FZ08产量：2.20 g/L；FZ07产量：1.19 g/L；OD₆₀₀：16–17；酶活性顺序：WbgL > FutC > FucT2
3.2 培养条件考察
前期研究通常在大肠杆菌BL21(DE3)摇瓶培养中采用37°C进行菌体生长、25°C进行产物合成，碳源通常为甘油。BL21(DE3)是公认的酶表达平台菌株，T7RNAP与pET系列质粒结合可在低温下实现蛋白的可溶性表达。然而，低温是否影响目标代谢途径中酶的酶活性需要验证。大肠杆菌中目标化合物的生物合成通常以葡萄糖为碳源，微量元素主要含Mn²⁺和Fe²⁺。此外，不同微量元素对代谢途径中酶的稳定性和活性有不同影响。例如，Yuan等人证明铜和锌可与5′-甲硫腺苷磷酸化酶结合并抑制其活性，导致5′-甲硫腺苷积累。因此，采用不同培养温度和微量元素优化培养条件。
首先，考察三种温度条件（25°C、30°C和37°C）对L-岩藻糖生物合成的影响。结果显示，较低温度25°C有利于L-岩藻糖的生物合成，较高温度导致产量降低（图3A、C）。进一步，以FZ10为宿主菌，根据前期研究考察了酵母提取物补充和简化微量元素组成对产物合成的影响。结果表明，当温度切换至30°C或37°C时，L-岩藻糖产量急剧下降至0.4–0.5 g/L，OD₆₀₀变化极小，介于13至15之间。酵母提取物补充和微量元素减少均使L-岩藻糖产量降至0.2 g/L。然而，酵母提取物使最终生物量从OD₆₀₀ 16增加至20（图3B、D）。酵母提取物的添加可能将代谢通量转向生物量积累，从而减少了从F6P流向L-岩藻糖的碳流量。温度和微量元素可能影响代谢途径中酶的催化效率。因此，最终确定优化条件为25°C和微量元素溶液2，用于后续摇瓶培养和分批发酵研究。
【数据】25°C产量最高；30°C/37°C产量：0.4–0.5 g/L；OD₆₀₀（30°C/37°C）：13–15；酵母提取物补充/微量元素减少产量：0.2 g/L；酵母提取物OD₆₀₀：16→20；优化温度：25°C；微量元素：溶液2
3.3 通过敲除和过表达L-岩藻糖生物合成途径相关基因对菌株FZ10的进一步遗传改造
wcaJ和rhaA基因参与大肠杆菌中GDP-L-岩藻糖和L-岩藻糖的消耗。在中心代谢途径中，pfkA将大部分F6P导入糖酵解以支持细胞生长，仅少部分进入GDP-L-岩藻糖合成途径。为阻断竞争途径，我们在菌株FZ10中进一步删除了wcaJ、rhaA和pfkA。随后，对p15AY载体进一步改造以过表达wbgL-afcA（添加额外启动子P_trc形成连续启动子以转录这些基因）、lacY和ppnK（旨在增强胞外乳糖摄取和NADPH合成），得到菌株FZWP01、FZWP02、FZWP03和FZWP……
【数据】删除基因：wcaJ、rhaA、pfkA；过表达基因：wbgL-afcA（P_trc连续启动子）、lacY、ppnK；菌株：FZWP01、FZWP02、FZWP03、FZWP04（原文节选未完整列出，后续数据未详述）
讨论与解读
本研究通过多重基因组改造构建了重组菌株FZWP03：在fuc调控子（即fucIK）位点染色体整合P_J23119-manA-manB-manC-gmd-wcaG基因簇以增强GDP-L-岩藻糖积累；对两种酶（α1,2-岩藻糖基转移酶和α-L-岩藻糖苷酶）的表达进行组合优化；上调乳糖转运蛋白并敲除竞争途径基因。所得菌株以甘油和葡萄糖为底物分别达到2.68 g/L和0.96 g/L的L-岩藻糖产量。随后，为解决ΔpfkA菌株以葡萄糖为底物时早期生长受损的问题，通过将GPP（P_rpsP）与degradation tag（DAS）结合构建了pfkA关闭型动态开关，通过分阶段代谢补偿实现比对照提高0.30 g/L的产量提升。在5 L生物反应器补料分批发酵中，FZWP03以甘油为底物L-岩藻糖产量达21.38 g/L，FZWP06以葡萄糖为底物达5.05 g/L。最后，为实现可持续和环境安全的发酵生产，利用来源于Nissle 1917的天然隐蔽质粒构建了不依赖抗生素的菌株FZWP08，在无抗生素条件下摇瓶和补料分批发酵产量分别为0.83 g/L和5.95 g/L。基于以上结果，可得出结论：含强组成型启动子P_J23119和RBS的人工GDP-L-岩藻糖合成基因簇显著提升了目标产物的合成能力。
编译者解读：本研究展示了合成生物学中"模块化设计—组合优化—动态调控—无抗生产"的系统性策略。值得关注的是，作者将GDP-L-岩藻糖合成基因簇整合至fucIK位点，巧妙利用L-岩藻糖自身诱导fuc启动子的特性形成正反馈回路，这种"产物自诱导"设计在代谢工程中颇具巧思。pfkA关闭型动态开关的引入也体现了从静态敲除向动态调控的思维升级——完全敲除虽能增加碳通量但损伤生长，而生长偶联的开关则兼顾了菌体增殖与产物合成。利用Nissle 1917天然隐蔽质粒实现无抗生素发酵，则回应了工业放大中质粒稳定性与成本控制的现实需求。不过，以葡萄糖为底物时产量仍显著低于甘油（5.05 vs 21.38 g/L），碳源差异背后的代谢调控机制值得进一步解析。整体而言，该研究为其他GDP-岩藻糖衍生化合物的微生物合成提供了可借鉴的通路组装与调控范本。
参考来源
Zhang Y. Microbial synthesis of L-fucose from glycerol and glucose in engineered Escherichia coli. Biochemical Engineering Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.bej.2025.110044
DOI: 10.1016/j.bej.2025.110044