来源：Utilizing a high-throughput visualization screening technology to develop a genetically encoded biosensor for monitoring 5-aminolevulinic acid production in engineered Escherichia coli（Biosensors and Bioelectronics）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）是一种在农业、畜牧业和医药领域具有广泛应用的非蛋白氨基酸。微生物细胞工厂被认为是其最具前景的生产方式，然而缺乏高通量的菌株筛选工具长期制约着产量提升策略的开发。本研究通过对天冬酰胺响应转录因子AsnC进行响应特异性工程改造，从饱和突变文库中筛选出突变体AC103-3H，并据此构建了特异性响应5-ALA的全细胞生物传感器EAC103-3H，其线性动态检测范围为1–12 mM，检测限达0.094 mM。在该传感器辅助下，通过启动子工程强化C5途径基因表达，使工程菌的5-ALA产量提升了4.78倍。
研究背景
5-ALA广泛存在于细菌、真菌、动物及植物中，在细胞代谢中作为所有卟啉化合物（如卟啉、血红素、叶绿素和维生素B12）合成的共同前体。外源5-ALA因能诱导光敏剂原卟啉IX在癌细胞中选择性积累，常被用作光动力治疗制剂；同时也可作为生物肥料、除草剂、杀虫剂及植物基人造肉中人工血红素的合成底物。传统化学合成法虽已有六种有效路线被提出，但普遍存在工艺复杂、产率较低、成本高昂等问题。微生物细胞工厂合成法被视为更高效环保的替代方案，5-ALA可通过Shemin途径（C4途径）或Beale途径（C5途径）在微生物细胞中合成，然而缺乏能够快速评估大量工程菌株产率的工具，严重限制了细胞工厂产量提升策略的探索。合成生物学 sensing 技术的发展为该瓶颈提供了可能的突破口——若能开发出响应5-ALA的基因编码生物传感器，即可实现产5-ALA菌株的可视化高通量筛选。然而，天然存在的5-ALA响应转录因子极为稀缺，这促使研究者考虑对结构相似的氨基酸响应转录因子进行改造，使其效应物特异性从原有配体转向5-ALA。
研究方法
2.1 菌株与试剂
5-氨基乙酰丙酸（5-ALA，99%）、L-酪氨酸（Tyr，99%）、L-半胱氨酸（Cys，99%）、L-苏氨酸（Thr，99%）、L-丝氨酸（Ser，99%）、L-谷氨酰胺（Gln，99%）和L-天冬酰胺（Asn，99%）均购自上海麦克林生化科技有限公司。大肠杆菌DH5α（实验室保藏）为本研究中所有质粒的宿主细胞。寡核苷酸合成、质粒测序以及来源于大肠杆菌的密码子优化基因（asnC、gltX、hemL和hemAC5）和基因rfp的合成均由北京瑞博生物完成。
【数据】试剂纯度：99%；宿主菌：E. coli DH5α；基因来源：E. coli
2.2 菌株与质粒构建
本研究所用全部菌株和质粒汇总于表S1。构建过程中所用基因和启动子序列分别整理于表S2和表S3。asnC基因通过XhoI和HindIII限制性酶切位点连接至pENTR/D-TOPO载体。随后，携带AsnC结合启动子的rfp基因通过KpnI和XhoI限制性酶切位点插入质粒骨架，获得5-ALA生物传感器质粒pAsnC（图S1）。用于5-ALA生产的质粒pgltX、phemL和phemAC5，分别将合成的大肠杆菌密码子优化基因gltX、hemL和hemAC5通过KpnI和HindIII限制性酶切位点连接至pENTR/D-TOPO获得。使用XbaI/HindIII限制性内切酶酶切phemAC5获得质粒骨架，pgltX经SpeI/HindIII限制性内切酶酶切获得SpeI-gltX-HindIII片段。上述骨架与片段经T4连接酶连接获得质粒pAg。同样地，将SpeI-hemL-HindIII片段连接至pAg获得质粒pAgL（用于5-ALA生产）；将SpeI-gltX-HindIII、SpeI-hemL-HindIII、SpeI-hemAC5-HindIII和SpeI-hemAC5-gltX-hemL-HindIII片段分别连接至pAC103-3H，获得用于5-ALA生产兼检测的质粒p3gltX、p3hemL、p3hemAC5和p3AgL。为获得用于确定hemAC5合适表达强度的质粒p3hemAC5mix，使用SpeI/BglII限制性内切酶酶切p3hemAC5获得质粒骨架。前端和后端分别带SpeI和BglII黏性末端的启动子（P200至P420）（表S3），通过引物对（P200-F/P200-R至P420-F/P420-R）（表S4）从95°C以0.3°C/s速率梯度退火获得。将上述片段等量混合，经T4酶连接至质粒骨架，获得质粒p3hemAC5mix。构建好的质粒转化至E. coli DH5α，获得可监测自身5-ALA产量的工程菌株。菌株在LB培养基中培养，并于−80°C、50%甘油中保藏备用。
【数据】酶切位点：XhoI/HindIII、KpnI/XhoI、KpnI/HindIII、XbaI/HindIII、SpeI/HindIII、SpeI/BglII；退火温度：95°C起始，0.3°C/s降温；保藏条件：−80°C，50%甘油
2.3 培养条件
质粒构建所用菌株在含20 mL LB培养基（含10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和5 g/L NaCl）的50 mL摇瓶中，于37°C、220 rpm条件下培养。根据需要向培养基中添加卡那霉素（50 μg/mL）。菌株在LB培养基中于37°C过夜预培养至种子培养物，然后以3%（v/v）接种量接种至含50 mL改良基础发酵培养基的250 mL摇瓶中，于37°C、220 rpm往复摇床上进行5-ALA摇瓶发酵。改良基础发酵培养基含有16 g/L葡萄糖、10 g/L酵母提取物、3 g/L胰蛋白胨、16 g/L (NH4)2SO4、3 g/L KH2PO4、10 g/L Na2HPO4-12H2O、1 g/L MgSO4-7H2O和0.01 g/L MnSO4-7H2O。根据需要向培养基中添加卡那霉素（50 μg/mL）。
【数据】培养基：LB（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl）；发酵培养基：16 g/L葡萄糖、10 g/L酵母提取物、3 g/L胰蛋白胨、16 g/L (NH4)2SO4、3 g/L KH2PO4、10 g/L Na2HPO4-12H2O、1 g/L MgSO4-7H2O、0.01 g/L MnSO4-7H2O；卡那霉素：50 μg/mL；温度：37°C；转速：220 rpm；接种量：3%（v/v）
2.4 分子对接
5-ALA和Asn的3D结构从PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取。AsnC蛋白结构从PDB数据库（https://www.rcsb.org/）获取，并使用PyMol软件进行去水和去配体预处理。无配体AsnC结构作为受体分子，通过AutoDock软件以Local Search Parameters模式分别与5-ALA或Asn进行对接，选取结合能最低的对接结果并用PyMol软件进行可视化。筛选出的103-3、105-7和138-6突变体的结构通过在PyMol软件中对相应位点进行氨基酸替换生成，选取空间位阻最小的结构作为最终模型和受体分子，同样以Local Search Parameters模式用AutoDock与5-ALA或Asn进行对接，选择结合能最低的对接结果并通过PyMol软件可视化。
【数据】软件：AutoDock（Local Search Parameters）、PyMol；数据库：PubChem、PDB；筛选标准：最低结合能
2.5 AsnC位点特异性饱和突变文库的构建
采用重叠延伸聚合酶链式反应（PCR）构建AsnC位点饱和突变文库，聚焦三个关键突变位点，即G103、Y105和T138。为构建G103饱和突变文库，使用AsnC-lib-Shou-fwd/AsnC-lib-G103-Overlap-rev引物对（表S4）扩增asnC基因前半段并在G103位点引入饱和突变。使用AsnC-lib-G103-Overlap fwd/AsnC-lib-Mo-rev引物对扩增asnC片段后半段。以AsnC-lib-Shou-fwd/AsnC-lib-Mo-rev引物对，通过易错PCR将两片段拼接，获得含G103位点饱和突变的完整AsnC序列。同样，使用AsnC-lib-Shou-fwd/AsnC-lib-Y105-Overlap-rev和AsnC-lib-Y105-Overlap fwd/AsnC-lib-Mo-rev引物对构建Y105饱和突变文库；使用AsnC-lib-Shou-fwd/AsnC-lib-T138-Overlap-rev和AsnC-lib-T138-Overlap fwd/AsnC-lib-Mo-rev引物对构建T138饱和突变文库。用XbaI/HindIII限制性内切酶将先前全细胞生物传感器基因电路中的野生型AsnC替换为位点特异性饱和突变文库。携带AsnC饱和突变文库的质粒转化至E. coli DH5α。转化细胞涂布于LB琼脂平板上，随机选取50个单菌落以评估突变方法的可行性。
【数据】突变位点：G103、Y105、T138；文库构建方法：重叠延伸PCR + 易错PCR；评估菌落数：50个
2.6 AsnC突变文库的高通量筛选
携带突变文库的大肠杆菌在LB琼脂平板上培养14 h，然后均匀喷洒高浓度5-ALA溶液。继续培养至菌株变红。变红更快且红色更深的克隆被选为优选突变体——这些突变体对5-ALA更敏感且诱导效率更高。同样，均匀喷洒高浓度天冬酰胺溶液，培养至未观察到红色。筛选白色克隆以淘汰不利突变体——这些突变体对原始诱导物Asn的响应较弱。
【数据】LB平板培养时间：14 h；筛选方式：5-ALA喷洒（正筛）+ Asn喷洒（负筛）
2.7 分析方法
培养物用蒸馏水稀释至适当体积后，使用Synergy H1酶标仪（Biotek，美国）在600 nm波长处测定光密度（OD）以监测细胞生长。发酵液中5-ALA浓度采用Ehrlich试剂法测定，预处理步骤略有修改。具体操作：取1 mL培养液于12,000 rpm离心1 min，上清液在10 mL带塞离心管中稀释至2 mL。加入0.5 mL乙酰丙酮和1 mL乙酸缓冲液（pH = 4.6），溶液于100°C煮沸15 min。以水为空白对照，在OD554处测定吸光度。优选吸光度在0.2–0.8范围内的样品，根据标准曲线（图S2）计算浓度。
【数据】OD测定波长：600 nm；离心：12,000 rpm，1 min；显色试剂：0.5 mL乙酰丙酮 + 1 mL乙酸缓冲液（pH = 4.6）；煮沸：100°C，15 min；测定波长：OD554；优选吸光度范围：0.2–0.8
2.8 生物传感器检测5-ALA的操作流程
甘油菌通过平板划线分离获得单菌落，于37°C、220 rpm条件下在LB培养基中过夜培养。将过夜培养物以适当比例转移至新鲜培养基中，培养至OD600达到0.5–0.8。将不同浓度的5-ALA或待测氨基酸加入培养物中，继续在37°C、220 rpm条件下培养4 h。随后取200 μL培养物于黑色96孔板中，使用Synergy H1酶标仪测定荧光强度（激发波长585 nm，发射波长625 nm）。
【数据】预培养：37°C、220 rpm、过夜；诱导培养：37°C、220 rpm、4 h；荧光测定：激发585 nm/发射625 nm；菌液量：200 μL/孔
研究结果
3.1 5-ALA响应AsnC突变文库的开发
AsnC是天冬氨酸的转录因子，被选作突变改造的骨架蛋白——5-ALA和Asn分子大小相似的氨基酸，且两者在氨基末端附近均有一个羰基，可互为类似物。在许多原核生物中，AsnC蛋白诱导高亲和力Asn转运系统的表达，例如通过调控启动子PasnA的活性来调节天冬酰胺合成酶A编码基因asnA的转录，从而在天冬酰胺代谢中发挥关键调控作用（de Wind et al., 1985）（图1A）。
为选择改变AsnC效应物特异性（从Asn转向5-ALA）的突变位点，进行了分子对接。无配体野生型AsnC分别与Asn和5-ALA通过AutoDock软件进行对接，并用PyMol软件可视化。如图1B所示，AsnC的一个二聚体对中，Y100至S106的环状残基形成结合口袋的一侧，Asn配体被氨基酸残基T101、G103、Y105和S106紧密包围，T101和G103的主链羰基共同向内指向。此外，Asn的羧基和氨基基团与G103、Y105和T138的主链酰胺或羰基基团之间存在形成氢键的潜力（Thaw, 2006）。对于目标效应物5-ALA，其羟基基团与一个二聚体氨基酸残基Y105相互作用，同时其羰基基团与另一二聚体的E137相互作用（图1C）。最终选取G103、Y105和T138三个位点进行饱和突变，以质粒pAsnC为基础，通过三步融合PCR构建饱和突变文库，理论容量为8K（图1D）。分别从这三个位点的突变文库中选取单克隆进行测序，相应位点的突变情况如图1E所示，证实了所构建文库的随机性和多样性。
【数据】突变位点：G103、Y105、T138；文库理论容量：8K；AsnC结合口袋残基：T101、G103、Y105、S106、T138、E137
3.2 5-ALA响应AsnC突变体的高通量筛选
这些AsnC突变体与诱导型表达的rfp偶联，响应胞内5-ALA浓度的变化，转化为红色荧光信号（图2A）。在该传感系统中，优势AsnC突变体与5-ALA结合形成复合物，激活PasnA启动子，导致菌株中RFP的差异性积累。虽然野生型AsnC理论上也能与5-ALA自主结合，但由于亲和力不足，添加外源5-ALA不会引起基于野生型AsnC的传感系统产生显著的荧光变化（图2C）。
筛选流程如下：首先通过喷洒非理想配体（Asn）作为负筛程序筛选非红色菌株，再通过喷洒理想配体（5-ALA）作为正筛程序筛选红色菌株。通过交替负筛-正筛，从AsnC饱和突变文库中收集对原始效应物（Asn）亲和力降低、对目标效应物（5-ALA）相互作用增强的优势AsnC突变体（图2B）。在此过程中，所构建的5-ALA传感系统可作为高通量筛选工具，通过将5-ALA浓度与RFP表达偶联，精确高效地选择性可视化突变体。经过多轮负筛-正筛，最终从突变文库中筛选出13个优势AsnC突变体。与野生型AsnC相比，这些突变体对5-ALA的荧光响应显著增强，红色荧光信号的强度与菌落的红色亮度或变红顺序相对应（图2D）。
【数据】筛选轮次：多轮负筛-正筛；最终获得优势突变体：13个；筛选方式：Asn喷洒（负筛）+ 5-ALA喷洒（正筛）
3.3 人工5-ALA转录因子的获得
对13个优势突变体进行5-ALA浓度梯度响应测试，发现其中大多数突变体的荧光增强与5-ALA浓度的增加呈正相关（图3A）。突变体103-3、105-7和138-6效果较优，在0–12 mM的5-ALA浓度梯度下，其荧光信号从约600变化至2000。其中，103-3表现最佳——荧光信号增幅最大，且随5-ALA梯度浓度变化呈现平滑变化（图3A）。
测序结果显示，突变体103-3、105-7和138-6分别发生了G103H、Y105A和T138Q的氨基酸替换（图S3）。通过PyMol软件模拟突变AsnC的结构，将5-ALA配体引入模型并借助AutoDock进行分析，以理解突变如何在分子水平和/或结合水平改变对5-ALA配体的亲和力。结果发现，突变体103-3中的H103与5-ALA形成了新的氢键，而Y105和E137与5-ALA结合更加紧密，极大地增加了103-3对5-ALA配体的亲和力（图3B）。对于105-7和138-6突变体，突变氨基酸引起的空间位阻变化可能导致其结合口袋变窄，从而更好地包裹5-ALA，最终改善荧光诱导效果（图3C、D）。
【数据】5-ALA浓度梯度：0–12 mM；荧光信号变化范围：约600–2000；氨基酸替换：G103H、Y105A、T138Q
3.4 5-ALA生物传感器菌株EAC103-3H的构建与表征
由于对5-ALA具有优异的响应性能，突变体103-3在众多优势突变体中脱颖而出，被命名为AC103-3H，并作为人工转录因子构建特异性响应5-ALA的全细胞生物传感器菌株EAC103-3H。进一步评估了5-ALA对EAC103-3H的诱导效果。首先，加入12 mM的5-ALA，EAC103-3H中红色荧光信号随孵育时间的积累如图4A所示。3 h后荧光强度出现显著增强，因此后续测定选择4 h以确保传感过程完成。EAC103-3H与5-ALA的浓度响应关系初步确定在3.5至118 mM范围内（图S4）。加入梯度浓度的5-ALA后，EAC103-3H中红色荧光积累呈上升趋势（图4B内插图）。
测定结果证实了EAC103-3H对5-ALA具有良好的灵敏度，根据3σ/k方法计算检测限为0.094 mM（Uhrovcík, 2014）（图4B）。与Ehrlich试剂法（检测范围< 200 μM）相比，EAC103-3H的线性动态范围扩展至1–12 mM（R² = 0.992），能够更准确地反映胞内5-ALA含量的变化。随后，将原始效应物Asn、结构类似物Gln以及性质接近的其余极性中氨基酸（Tyr、Cys、Thr和Ser）的诱导效果与5-ALA的诱导效果进行比较。如图4C所示，与其他测试化合物相比，EAC103-3H对5-ALA表现出良好的特异性响应。紧接着，在12 mM 5-ALA存在的同时，分别单独或共同添加0.12 mM或1 mM的上述氨基酸，测试它们对传感器菌株5-ALA诱导效果的影响，荧光均未发生显著变化（图4D）。这一结果与此前以5-ALA和Asn进行的正筛和负筛结果相互印证。这种诱导特异性和抗干扰能力对于EAC103-3H作为高通量筛选工具的应用至关重要。
【数据】5-ALA添加浓度：12 mM；荧光显著增强时间：3 h后；测定时间点：4 h；初步响应范围：3.5–118 mM；检测限：0.094 mM（3σ/k法）；线性动态范围：1–12 mM；R² = 0.992；干扰测试氨基酸浓度：0.12 mM或1 mM；Ehrlich试剂检测范围：< 200 μM
3.5 监测大肠杆菌中5-ALA的强化生产
生物传感器的主要目标是筛选参与目标代谢物生产的酶、途径或细胞。在5-ALA的两条天然生物合成路线中，C4途径需要持续添加昂贵的前体L-谷氨酸和琥珀酰辅酶A，而C5途径仅以廉价的葡萄糖为底物，具有更大的生产潜力（Zhao et al., 2018）（图5A）。因此，将C5途径相关基因（gltX、hemAC5、hemL）在大肠杆菌中进行过表达。
以p3AgL质粒为例，该质粒同时携带C5途径基因（gltX、hemL）和生物传感器模块（AC103-3H + RFP），使菌株能够通过荧光信号实时反映自身的5-ALA生产能力。为确定hemAC5的最佳表达强度，将p3hemAC5mix质粒（含混合启动子文库驱动的hemAC5）转化至大肠杆菌，通过荧光激活细胞分选（FACS）或荧光强度比较，筛选出具有最高5-ALA产量的菌株。结果表明，通过启动子工程辅助过表达C5途径基因，工程菌的5-ALA产量获得了4.78倍的提升。图5B展示了所构建的工程大肠杆菌的遗传电路示意图。图6展示了E-3-hemAC5菌株的5-ALA产量检测流程图——上游为利用生物传感器EAC103-3H的荧光评估E-3-hemAC5的5-ALA生产能力操作示意，下游为采用经典Ehrlich试剂测定其5-ALA产量的流程示意。
【数据】C5途径基因：gltX、hemAC5、hemL；产量提升：4.78倍；底物：葡萄糖（廉价碳源）
讨论与解读
本研究通过定向进化改变了AsnC的诱导特异性，并高通量筛选出与5-ALA良好结合的优势突变体AC103-3H，克服了缺乏5-ALA天然转录因子的瓶颈。以AC103-3H为5-ALA特异性人工转录因子，与RFP偶联构建了全细胞生物传感器EAC103-3H。作为一种可视化的原位高通量筛选工具，该传感器的操作更绿色、更简便、成本更低。EAC103-3H能够可视化展示具有高5-ALA产量的菌株，在辅助5-ALA细胞工厂工程改造（如hemAC5的启动子工程）方面具有巨大潜力，还可用于关键酶的定向进化或探索与5-ALA生产相关的新途径。
【编译者解读】该研究的核心价值在于将配体结合域改造策略系统性地应用于非天然效应物的传感——选择分子大小和化学特征相似的Asn/AsnC作为改造起点，通过理性设计锁定三个关键氨基酸位点，再以饱和突变+双轮正负筛选完成定向进化，这一范式对开发其他缺乏天然转录因子的代谢物传感器具有直接借鉴意义。传感器与生产菌株"自检测"的整合设计（p3系列质粒使菌株同时具备生产与报告功能）也颇为巧妙，省去了取样和外部检测步骤。4.78倍的产量提升验证了该工具在启动子工程筛选中的实际效用。值得关注的是，该传感器的线性检测范围（1–12 mM）恰好覆盖了工程菌株的典型胞外积累区间，这提示感应元件设计时的配体亲和力调谐需与目标产物的实际浓度范围匹配。然而，本研究中的分子对接分析仍以静态结构预测为主，对突变效应的解释存在一定推测成分；此外，传感器在复杂发酵体系中的长期稳定性与假阳性率等实际应用参数仍有待进一步考察。
参考来源
Su H. Utilizing a high-throughput visualization screening technology to develop a genetically encoded biosensor for monitoring 5-aminolevulinic acid production in engineered Escherichia coli. Biosensors and Bioelectronics, 2025. DOI: 10.1016/j.bios.2024.116806
DOI: 10.1016/j.bios.2024.116806