来源：Pathway optimization and membrane engineering for highly efficient production of indigoidine in engineered Escherichia coli（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
靛蓝素作为一种微生物来源的联苯醌类蓝色色素，因其出色的化学稳定性和抗氧化、抗菌性能，被视为化学合成染料的潜在替代品。本研究以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，以甘油为唯一碳源，通过关键酶筛选、限速步骤解析、代谢途径优化及膜工程改造等多层次策略，最终在摇瓶和5 L发酵罐中分别实现4.95 g/L和26.71 g/L的靛蓝素产量，为疏水性产物的微生物高效合成提供了可借鉴的工程范式。
研究背景
纺织、食品及制药行业对染料的需求持续增长，但传统化学合成路线依赖大量有毒、难降解的化学试剂。以牛仔布印染常用的靛蓝为例，其化学合成需要使用苯胺等不可持续且危害环境的原料。靛蓝素是从微生物中发现的天然蓝色色素，属于联苯醌类化合物，具有着色力强、稳定性高以及显著的抗氧化和抗菌特性。1939年，该色素首次从沟渠水中的假单胞菌（Pseudomonas indigofera）中分离获得并命名为indigoidine。此后，多种野生微生物如Corynebacterium insidiosum ICPB-C113a等也被发现能够合成该色素。利用微生物发酵实现靛蓝素的绿色生物制造，是替代化学合成的重要方向。
研究方法
2.1 菌株与质粒
所有重组菌株和质粒列于补充材料中，本研究涉及的引物同样列于补充材料。质粒构建采用大肠杆菌JM109菌株，靛蓝素生产以大肠杆菌BL21(DE3)为初始宿主菌。密码子优化的靛蓝素合酶基因和PPTase基因由苏州金唯智生物科技有限公司（Azenta GENEWIZ Co., Ltd.）合成。所有基因均插入pTac质粒载体，构建含有不同靛蓝素合酶基因和PPTase基因、受tac启动子调控表达的重组质粒。膜工程涉及的密码子优化基因同样经合成后，在NcoI位点插入pCO-tac-tac质粒载体。其他质粒采用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit及相应引物对构建。所有质粒均经Sanger测序验证。
【数据】宿主菌：E. coli JM109（质粒构建）、E. coli BL21(DE3)（靛蓝素生产）；基因合成：Azenta GENEWIZ Co., Ltd.；质粒载体：pTac、pCO-tac-tac；克隆试剂盒：ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit；测序验证：Sanger测序
2.2 化学试剂与菌株发酵
谷氨酸和谷氨酰胺标准品购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。靛蓝素标准品（纯度≥95%）购自江苏华程生物科技有限公司（中国无锡）。其他化学试剂购自国药集团（中国上海）。种子培养使用Luria-Bertani（LB）培养基（含5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨）。LB琼脂平板添加1.5%（w/v）琼脂粉。靛蓝素生产用R/2培养基组成如下：20 g/L甘油、3 g/L酵母提取物、2 g/L (NH₄)₂SO₄、2 g/L (NH₄)₂HPO₄、6.75 g/L KH₂PO₄、0.85 g/L柠檬酸、0.7 g/L MgSO₄·7H₂O，以及每升添加5 mL微量元素溶液（TMES）。TMES组成：5 M HCl、10 g/L FeSO₄·7H₂O、2.25 g/L ZnSO₄·7H₂O、1 g/L CuSO₄·5H₂O、0.5 g/L MnSO₄·5H₂O、0.23 g/L Na₂B₄O₇·10H₂O、1.51 g/L CaCl₂、0.1 g/L (NH₄)₆Mo₇O₂₄。必要时在培养基中添加适当浓度的相应抗生素以维持工程菌株的生长和生产。重组菌株发酵实验流程如下：从相应LB琼脂平板挑取三个单菌落，接种于4 mL LB培养基中，在试管条件下于37°C、200 rpm振荡培养10–12小时。将2%（v/v）过夜培养物接种到装有25 mL R/2培养基（含相应抗生素）的250 mL摇瓶中，于200 rpm、37°C条件下培养。待OD₈₀₀达到0.4–0.6后，向培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.1 mM。随后在25°C、200 rpm条件下继续培养48小时，收集样品定量相关产物。
【数据】LB培养基：5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨；琼脂粉浓度：1.5%（w/v）；R/2培养基：20 g/L甘油、3 g/L酵母提取物、2 g/L (NH₄)₂SO₄、2 g/L (NH₄)₂HPO₄、6.75 g/L KH₂PO₄、0.85 g/L柠檬酸、0.7 g/L MgSO₄·7H₂O、5 mL/L TMES；接种量：2%（v/v）；培养条件：37°C、200 rpm、10–12 h（种子）；发酵条件：250 mL摇瓶/25 mL R/2培养基、200 rpm、37°C；诱导：OD₈₀₀ 0.4–0.6时加IPTG至0.1 mM；诱导后培养：25°C、200 rpm、48 h
2.3 靛蓝素补料分批发酵
首先，将质粒pTac-bpsA-RBS-sfp2、pCD-tac-glnA(Y405F)-odhI(T15A)-tac-gdh和pCO-tac-dgkA转入大肠杆菌BL21(DE3)，构建最终发酵菌株BIG33。随后，从构建的BIG33菌株挑取三个单菌落，接种于含氨苄青霉素（AmpR，100 μg/L）、链霉素（SmR，50 μg/L）和卡那霉素（KanR，50 μg/L）的4 mL LB培养基中。接着，将1%（v/v）种子液从试管接种到装有125 mL R/2培养基的500 mL摇瓶中。最后，在装有2.5 L R/2培养基的5 L生物反应器（平行生物反应器，中国上海）中进行工程菌株的生长和发酵，温度为37°C。当OD₈₀₀达到约13时，向生物反应器中加入终浓度为0.1 mM的IPTG。同时，生物反应器温度逐渐降至25°C以促进靛蓝素生产。通过控制流加NH₃·H₂O（50%，v/v），将生物反应器pH自动维持在6.8。当甘油浓度低于5 g/L时，向生物反应器补加含600 g/L甘油和3 g/L (NH₄)₂SO₄的补料液，以确保充足的碳源供应。
【数据】菌株：BIG33（含pTac-bpsA-RBS-sfp2、pCD-tac-glnA(Y405F)-odhI(T15A)-tac-gdh、pCO-tac-dgkA）；抗生素：AmpR 100 μg/L、SmR 50 μg/L、KanR 50 μg/L；摇瓶培养：500 mL摇瓶/125 mL R/2培养基；生物反应器：5 L（装液2.5 L）；温度：37°C（发酵）→25°C（诱导后）；IPTG：0.1 mM（OD₈₀₀≈13时添加）；pH：6.8（NH₃·H₂O自动控制）；补料：600 g/L甘油+3 g/L (NH₄)₂SO₄（甘油<5 g/L时流加）
2.4 代谢物、碳源和细胞生长的测定
取500 μL靛蓝素发酵样品，使用台式离心机（Eppendorf 5424/5424R，德国汉堡）在12,000g条件下高速离心5分钟。随后弃去发酵液上清，收集底部沉淀。沉淀用无水甲醇洗涤两次以去除残余杂质。待样品准备好后，加入适量二甲基亚砜（DMSO），通过充分涡旋使靛蓝素完全重新溶解。将靛蓝素稀释至一定浓度范围后，加入96孔透明平底板（BKMAMLAB，比克曼生物，中国）中准备测定。靛蓝素产量浓度（g/L）通过高效液相色谱（HPLC）系统（Waters，美国马萨诸塞州米尔福德）配备紫外检测器（600 nm）测定，根据靛蓝素标准曲线换算计算。HPLC系统配备Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）。HPLC分析采用线性梯度洗脱，使用两种流动相：洗脱液A为超纯水，洗脱液B为无水甲醇（HPLC级）。洗脱程序如下：0–9分钟，80% A：20% B→50% A：50% B；9–13分钟，50% A：50% B→80% A：20% B；13–18分钟，80% A：20% B（均为v/v）。洗脱流速设为1.0 mL/min，柱温箱温度维持在35°C。甘油浓度采用先前报道的HPLC方法测定。靛蓝素在615 nm处的吸光值会显著影响常规600 nm OD测量的精度。本研究采用先前报道的更精确的OD₈₀₀测量方法来确保发酵过程中菌株生长表征的准确性。OD₈₀₀与OD₆₀₀之间相关性的图示见补充材料。超高效液相色谱-质谱联用（UPLC/MS）（Acquity UPLC System，Waters，美国）用于检测标准品和发酵样品中的靛蓝素及潜在副产物。结构表征通过¹H核磁共振（NMR）波谱（400 MHz AVANCE NEO 400，Bruker，美国）完成，使用氘代DMSO溶解纯化后的靛蓝素。两种技术的分析流程均遵循已建立的方案。
【数据】样品量：500 μL；离心：12,000g、5 min；洗涤：无水甲醇×2次；复溶溶剂：DMSO；检测波长：600 nm（HPLC紫外检测器）；色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；柱温：35°C；洗脱程序：0–9 min（80% A→50% A）、9–13 min（50% A→80% A）、13–18 min（80% A）；OD测量波长：800 nm（避免靛蓝素615 nm干扰）；结构表征：¹H NMR（400 MHz，氘代DMSO）
2.5 磷脂酰乙醇胺（PE）含量测定
测定PE含量时，样品预处理如下：取1 mL待测菌液，与3.75 mL混合溶剂（氯仿/甲醇/12 N HCl = 2:4:0.1，v/v）充分混合，然后加入1.25 mL氯仿振荡30秒，再加入1.25 mL纯水再次振荡30秒。随后样品在5,000×g条件下离心10分钟，取下层氯仿层转移至新试管中，将溶剂吹干获得样品干粉，用于后续LC-MS测定。
【数据】样品量：1 mL菌液；混合溶剂：氯仿/甲醇/12 N HCl = 2:4:0.1（v/v）3.75 mL；氯仿：1.25 mL；纯水：1.25 mL；振荡：30 s×2次；离心：5,000×g、10 min；检测：LC-MS
2.6 扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）样品的制备与分析
样品制备时，将构建菌株BIG33在R/2培养基中培养，待OD₈₀₀达到0.4–0.6后添加0.1 mM IPTG。取1 mL样品通过离心收集，用0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次，然后进行后续处理。
【数据】菌株：BIG33；培养基：R/2；诱导：OD₈₀₀ 0.4–0.6时加0.1 mM IPTG；样品量：1 mL；洗涤：0.1 M PBS×3次
研究结果
3.1 不同来源的靛蓝素合酶和PPTase对靛蓝素生物合成的影响
为实现靛蓝素的优化生产，本研究构建了大肠杆菌BL21(DE3)重组菌株，评估不同来源的靛蓝素合酶和PPTase。在大肠杆菌BL21(DE3)的内源TCA生物合成途径中，靛蓝素的两种前体——谷氨酸（Glu）和谷氨酰胺（Gln）——可由α-酮戊二酸（α-KG）转化而来。因此，大肠杆菌能够内源合成谷氨酰胺，随后通过一步异源反应合成靛蓝素（图1a）。为优化异源基因的表达条件，采用构建的质粒pTac-1共表达两种关键酶。
研究选取了三种靛蓝素合酶基因来评估靛蓝素生产能力，包括：来自Streptomyces lavendulae subsp. lavendulae的编码蓝色色素靛蓝素合酶的bpsA基因（GenBank：ACK77757.2）、来自Streptomyces chromofuscus ATCC 49982的编码靛蓝素合酶的Sc-indC基因（GenBank：AFV27434.1）以及来自Erwinia chrysanthemi的编码靛蓝素合酶的Ec-indC基因（GenBank：CAB87990.1）。此外，选取了五种不同的PPTase基因作为激活因子，包括sfp1（来自Bacillus subtilis，GenBank：WP_020955309.1）、sfp2（来自Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168，GenBank：WP_003234549.1）、sfp3（来自Bacillus spizizenii，GenBank：WP_003224948.1）、svp（来自Streptomyces verticillus ATCC 15003，GenBank：AAG43513.1）和ppta（来自Corynebacterium glutamicum ATCC 13032，GenBank：WP_003857486.1）。这些PPTase通过将来自辅酶A部分的磷酸泛酰巯基乙胺基团引入T结构域，使相应的靛蓝素合酶从脱辅基形式转变为全酶形式。此外，还测试了来源于靛蓝素合酶原始宿主的PPTase，包括aur1L（来自S. lavendulae subsp. lavendulae）、Sc-indB（来自S. chromofuscus ATCC 49982）和Ec-indB（来自E. chrysanthemi），以证明优化靛蓝素合酶与PPTase组合的必要性（图1）。
本研究以野生型大肠杆菌BL21(DE3)菌株为靛蓝素生产的初始宿主。通过两种不同酶的组合方式，将合成的靛蓝素合酶和PPTase引入初始菌株大肠杆菌BL21(DE3)。因此，构建了十五株含有不同质粒的重组大肠杆菌菌株（图1a），并在R/2培养基中培养以测试靛蓝素生产能力。如图1b和补充材料所示，发酵过程通过体内酶促转化成功产生了靛蓝素，经HPLC分析与靛蓝素标准品对比确认。有趣的是，在全部十五株重组大肠杆菌菌株中，靛蓝素峰之后均观察到一个次要峰，暗示靛蓝素生物合成过程中可能存在副产物。质谱（MS）表征显示，在m/z 249.0609处存在质子化分子离子[M + H]⁺，对应靛蓝素质子化形式的分子式C₁₀H₉N₄O₄。¹H NMR波谱分析在图（）中显示了三个特征单峰共振信号，分别位于δ 11.33、8.19和6.50 ppm处，其强度比与靛蓝素结构中–NH、–CH和–NH₂官能团一致。这些光谱特征（化学位移、多重峰模式和质子积分比）与靛蓝素的预测光谱特征精确吻合，并与先前研究报告的数据完全对应。
通过引入构建的质粒pTac-bpsA-RBS-sfp2获得了最高的靛蓝素产量，达到1.92 g/L。此外，基于bpsA的工程菌株的靛蓝素产量高于基于Sc-indC和Ec-indC的重组菌株，表明不同酶在大肠杆菌BL21(DE3)宿主中的表达状态存在显著差异。先前研究将靛蓝素合酶BpsA在大肠杆菌中的异源表达差异归因于宿主特异性蛋白质翻译机制的不匹配，导致更多包涵体的形成。为表征这些差异，使用SDS-PAGE分析了重组菌株。靛蓝素合酶表达量存在显著差异，其中BpsA蛋白表现出明显更高的表达水平（补充材料）。五株工程菌BIG01、BIG02、BIG03、BIG04和BIG05均携带相同的靛蓝素合酶BpsA，产量分别为1.46、1.92、1.27、0.92和0.13 g/L。此外，不同PPTase与BpsA表现出不同的组合效应，进而影响靛蓝素生物合成，揭示了NRPS结构域与PPTase之间出乎意料的复杂相互作用。如先前报道，Corynebacterium glutamicum具有内源PPTase可激活BpsA，而大多数菌株如大肠杆菌、P. putida和R. toruloides缺乏靛蓝素合酶激活所需的PPTase表达。这表明使用适当的酶组合可以增强靛蓝素产量，可能是通过促进发酵过程中的高效转化实现的。
【数据】靛蓝素合酶基因：bpsA（ACK77757.2）、Sc-indC（AFV27434.1）、Ec-indC（CAB87990.1）；PPTase基因：sfp1（WP_020955309.1）、sfp2（WP_003234549.1）、sfp3（WP_003224948.1）、svp（AAG43513.1）、ppta（WP_003857486.1）；最高产量：1.92 g/L（pTac-bpsA-RBS-sfp2）；BIG01–BIG05产量：1.46、1.92、1.27、0.92、0.13 g/L；MS表征：[M+H]⁺ m/z 249.0609（C₁₀H₉N₄O₄）；¹H NMR：δ 11.33、8.19、6.50 ppm
3.2 通过补充L-谷氨酰胺和L-谷氨酸表征靛蓝素生物合成的限速步骤
为确定靛蓝素生物合成的限速步骤，向发酵培养基中补充了两种前体——L-谷氨酰胺（L-Gln）和L-谷氨酸（L-Glu）。此外，将编码谷氨酸合酶的glnA基因引入相应的工程菌株，以增强L-Glu向L-Gln的转化，从而促进L-Glu的高效利用（图2）。因此，为通过L-Glu补充增强靛蓝素产量，用构建的质粒pCD-glnA转化了基因工程菌株BIG19。
靛蓝素产量随L-Glu和L-Gln的补充而明显增加。首先，所得BIG02菌株在添加10 mM L-Gln后表现出3.08 g/L的靛蓝素产量提升，较原始菌株增加了67.39%。其次，添加L-Glu对靛蓝素产量的提升效果不明显。所得BIG02菌株在补充10 mM L-Glu后产生2.32 g/L靛蓝素，较参考菌株增加了26%。这些发现突显了使用质粒pCD-glnA促进L-Glu向靛蓝素转化的潜在价值。此外，在多种宿主中（包括大肠杆菌BAP1和R. toruloides）补充L-Gln和L-Glu时，靛蓝素产量也观察到一致的结果。在本研究中，前体L-Gln和L-Glu被确定为当前宿主中靛蓝素持续高产的关键限制因素。
【数据】BIG02+10 mM L-Gln：3.08 g/L（较原始菌株提高67.39%）；BIG02+10 mM L-Glu：2.32 g/L（较参考菌株提高26%）
3.3 通过优化谷氨酰胺从头合成途径提高靛蓝素产量
L-Gln化合物是多种产品生产中的关键中间体，如L-精氨酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和胍丁胺。L-Glu的生成涉及TCA来源的代谢物α-酮戊二酸（α-KG）经谷氨酸脱氢酶（GDH）转化。随后，该过程进一步推进……
（后续内容涉及BIG25菌株的构建与途径优化，包括glnA(Y405F)和odhI(T15A)突变体的引入以及gdh基因的过表达等策略，原文节选在此处中断。）
【数据】原文此部分节选不完整，具体数据未完全呈现。
3.4 膜工程策略
（原文节选在此处中断。图4显示与膜合成途径和膜形态相关的基因被上调以促进靛蓝素积累，并在48小时时进行了摇瓶发酵结果分析。）
【数据】原文此部分节选不完整，具体数据未完全呈现。
3.5 不同发酵参数对BIG33菌株靛蓝素生物合成的影响
（图5显示了BIG33菌株在不同发酵条件下的靛蓝素合成情况：(A) 30°C、48小时条件下IPTG浓度的影响；(B) IPTG浓度为0.05 mM、48小时条件下诱导温度的影响；(C) 酵母提取物补充的影响；(D) 氮源类型的影响。原文节选在此处中断。）
【数据】原文此部分节选不完整，具体数据未完全呈现。
3.6 BIG33菌株补料分批发酵生产靛蓝素
（图6显示了BIG33菌株补料分批培养生产靛蓝素的过程，红色箭头代表IPTG诱导剂的添加。原文节选在此处中断。）
【数据】原文此部分节选不完整，具体数据未完全呈现。
讨论与解读
本研究通过系统的代谢工程策略在大肠杆菌中实现了靛蓝素的高效合成。核心路径包括：筛选最佳靛蓝素合酶与PPTase组合、识别限速步骤（L-Gln和L-Glu前体供应）、优化谷氨酰胺从头合成途径、过表达脂膜合成相关基因，以及精细调控发酵参数。最终工程菌株在250 mL摇瓶中产生4.95 g/L靛蓝素，在5 L生物反应器补料分批发酵中产生26.71 g/L靛蓝素。
编译者解读：该研究展示了合成生物学中"多策略叠加"的系统工程思维——从酶元件筛选到途径限速步骤解析，再到膜工程改造，层层递进式优化策略值得借鉴。靛蓝素作为疏水性色素，膜工程策略的引入提示产物跨膜运输与积累能力同样是高产的关键瓶颈。26.71 g/L的产量在微生物天然色素合成领域处于较高水平，但甘油作为碳源的原料成本及靛蓝素胞内提取工艺仍是产业化需要面对的问题。该工程菌株平台对其他疏水性天然产物的高效合成同样具有参考价值。
参考来源
Li, Z. Pathway optimization and membrane engineering for highly efficient production of indigoidine in engineered Escherichia coli. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2025.133415
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.133415