来源：Construction of a carbon-conserving pathway for D-allulose production by regulating the co-utilization of acetate and glucose in engineered Escherichia coli（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
D-阿洛酮糖是一种低热量稀有糖，市场前景广阔，但其生物合成长期受制于碳代谢流分配不均与乙酸溢流造成的碳损失。本研究提出"乙酸供生长、葡萄糖供合成"的双碳源发酵策略，通过代谢工程重构、自适应实验室进化与发酵条件优化，将葡萄糖得率提升至52.8%，总碳摩尔得率提高67.6%，乙酸利用率达90.6%。该策略实现了菌体生长与产物合成的时空分离，为乙酸的高值化利用提供了新范式。
研究背景
D-阿洛酮糖是天然存在的功能性稀有糖，热量低、血糖生成指数低，并具有多种潜在健康益处，在食品与功能营养领域应用前景广阔。目前其生物合成主要依赖体外酶法和全细胞催化，包括D-阿洛酮糖3-差向异构酶介导的Izumoring策略、醛缩酶介导的醇醛反应途径以及糖醇脱氢酶介导的氧化还原转化途径。然而，这些策略面临热力学限制、辅因子依赖和工艺复杂等挑战，极大制约了其工业化应用潜力。
相比之下，磷酸化-去磷酸化级联反应是大肠杆菌中天然存在且热力学有利的D-阿洛酮糖生物合成途径。与体外酶法和全细胞催化不同，发酵法能充分释放该策略的应用潜力。近年来，代谢工程大肠杆菌已实现以甘油和葡萄糖为底物的一步发酵生产D-阿洛酮糖。然而，如何减少碳损失、提高碳原子经济性仍是该领域的核心难题。乙酸可从多种生物废弃物中绿色合成，被视为可持续微生物原料，其高值化利用有助于实现碳中和目标。本研究正是基于这一背景，探索乙酸与葡萄糖协同利用的新发酵模式。
研究方法
2.1 菌株与培养基
本研究所用菌株和质粒见补充材料。E. coli DH5α用于基因克隆，E. coli BL21 (DE3)用于基因表达。重组菌株在添加了适当抗生素的LB培养基中、37°C、200 rpm条件下培养。发酵实验在改良M9培养基中进行。改良M9培养基组成如下：M9基础盐培养基（6.8 g/L Na₂HPO₄、3.0 g/L KH₂PO₄、0.5 g/L NaCl、1.0 g/L NH₄Cl）、0.24 g/L MgSO₄·7H₂O、0.04 g/L CaCl₂·2H₂O、5 g/L酵母提取物（ALE实验中不含酵母提取物）、140 mmol/L（11.5 g/L）乙酸钠。以D-葡萄糖为唯一碳源时，其浓度设为15 g/L。双碳源发酵策略中，M9培养基初始含140 mmol/L（11.5 g/L）乙酸钠，培养12 h后补加15 g/L D-葡萄糖；优化后，最终菌株E20调整为补加10 g/L D-葡萄糖。种子液先在LB培养基中预培养，再以1%接种量接种至改良M9培养基。培养条件为37°C、220 rpm，待OD₆₀₀达到0.6-0.8后，加入0.1 mmol/L异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）诱导蛋白表达，随后在30°C下继续发酵。
【数据】基础盐浓度：Na₂HPO₄ 6.8 g/L、KH₂PO₄ 3.0 g/L、NaCl 0.5 g/L、NH₄Cl 1.0 g/L；MgSO₄·7H₂O：0.24 g/L；CaCl₂·2H₂O：0.04 g/L；酵母提取物：5 g/L；乙酸钠：140 mmol/L（11.5 g/L）；D-葡萄糖：15 g/L（单碳源）或12 h后补加15 g/L（双碳源优化前）/10 g/L（优化后）；接种量：1%；培养温度：37°C（生长）/30°C（诱导后）；转速：220 rpm；IPTG浓度：0.1 mmol/L；诱导时机：OD₆₀₀ 0.6-0.8
2.2 基因克隆与质粒构建
本研究所用引物序列见补充材料。葡萄糖激酶基因（glk）、磷酸葡萄糖异构酶基因（pgi）、D-阿洛酮糖-6-磷酸3-差向异构酶基因（alsE）、乙酰辅酶A合成酶基因（acs）和柠檬酸合酶基因（gltA）均从E. coli BL21 (DE3)基因组DNA中扩增获得。来源于脆弱拟杆菌NCTC 9343的D-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶基因（a6pp）由上海生工合成并进行密码子优化。质粒pCDFDuet-1、pRSFDuet-1和pETDuet-1使用限制性内切酶进行双酶切。重组质粒通过无缝克隆构建，连接产物直接转化至感受态E. coli DH5α细胞中。阳性转化子经筛选后测序验证。测序结果正确的重组质粒被导入E. coli BL21 (DE3)及其衍生突变株中。
【数据】扩增基因：glk、pgi、alsE、acs、gltA（来源：E. coli BL21 (DE3)基因组）；a6pp（来源：Bacteroides fragilis NCTC 9343，密码子优化合成）；载体：pCDFDuet-1、pRSFDuet-1、pETDuet-1；克隆宿主：E. coli DH5α；表达宿主：E. coli BL21 (DE3)
2.3 基因组编辑
基因组编辑采用CRISPR-Cas9基因编辑系统。敲除目标基因时，使用两对引物扩增目标基因上下游两侧的同源臂。靶向目标基因的单 guide RNA（sgRNA）通过在线工具（https://chopchop.cbu.uib.no/）预测，以pTarget为模板进行反向PCR以替换质粒上的N20区域。上述PCR产物经无缝克隆后转化至E. coli DH5α细胞中，构建重组pTarget质粒（在含10 mmol/L鼠李糖的液体培养基中进行质粒消除）。质粒经测序验证后用于后续相应靶基因的敲除。经验证的重组pTarget质粒被导入表达Cas9的菌株中实现靶基因敲除，以5 mmol/L阿拉伯糖作为Cas9表达的诱导剂。最终，靶基因缺失突变体通过PCR筛选并经测序确认。
【数据】CRISPR-Cas9系统；sgRNA设计工具：CHOPCHOP在线工具；诱导剂：5 mmol/L阿拉伯糖（Cas9表达）；质粒消除：10 mmol/L鼠李糖
2.4 乙酸耐受性自适应实验室进化（ALE）
突变株的乙酸ALE实验使用微生物微滴培养（MMC）系统（无锡Tmaxtree生物技术有限公司）进行。该系统可自动生成独立微滴供微生物生长，并实时监测其生长（OD₆₀₀）。ALE实验期间，将E04培养至对数中后期作为种子液，稀释至OD₆₀₀为0.2后加入系统培养管中。共生成50个独立微滴，在MMC系统的ALE模式下培养，每代乙酸浓度递增20 mmol/L。在37°C下进行连续传代培养，每代培养至对数中后期（约8 h）。10天培养共完成30代传代，获得了能够耐受160 mmol/L乙酸的微滴。以OD₆₀₀为核心筛选标准，选择传代性能稳定的微滴，涂布于含160 mmol/L乙酸的琼脂平板上培养。最后，从筛选平板上挑取单菌落接种至摇瓶中，测试最终的乙酸耐受性和乙酸同化能力。
【数据】ALE系统：MMC微滴培养系统；初始OD₆₀₀：0.2；微滴数：50个；乙酸递增幅度：20 mmol/L/代；培养温度：37°C；每代培养时间：约8 h；总传代次数：30代；总培养时间：10天；最终乙酸耐受浓度：160 mmol/L
2.5 转录组测序与分析
按照制造商方案，使用CTAB法从细菌细胞中提取总RNA。去除基因组DNA后，按照Illumina® Stranded mRNA Prep, Ligation（San Diego, CA）方案，使用总RNA制备RNA-seq转录组文库。双端RNA-seq由上海美吉生物医药科技有限公司使用Illumina NovaSeq 6000平台完成。基因表达水平通过RSEM（https://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/）计算，并归一化为Transcripts Per Million（TPM）进行比较分析以评估基因表达水平。样本间基因差异表达分析使用DESeq2（http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html）进行。
【数据】RNA提取方法：CTAB法；测序平台：Illumina NovaSeq 6000；文库制备：Illumina® Stranded mRNA Prep, Ligation；表达定量：RSEM（TPM归一化）；差异表达分析：DESeq2
2.6 分析方法
细胞密度通过分光光度计测定OD₆₀₀值。D-葡萄糖和D-阿洛酮糖浓度使用高效液相色谱（HPLC）测定，配备Aminex HPX-87C色谱柱（7.8 mm × 300 mm，Bio-Rad，Hercules，CA，USA）。流动相为超纯水，柱温80°C，流速0.6 mL/min，进样量20 μL。乙酸浓度使用HPLC测定，配备Aminex HPX-87H色谱柱（7.8 mm × 300 mm，Bio-Rad，Hercules，CA，USA）。流动相为5 mmol/L H₂SO₄，柱温50°C，流速0.6 mL/min，进样量5 μL。葡萄糖得率（%）按产生的D-阿洛酮糖与消耗的D-葡萄糖之比计算。总碳摩尔得率（%）按公式(1)计算，其中n代表相应物质的摩尔量。
(1) C mol% = (n_D-allulose × 6) / (n_glucose, consumed × 6 + n_acetate, consumed × 2) × 100%
【数据】D-葡萄糖/D-阿洛酮糖检测：HPLC，Aminex HPX-87C柱，流动相超纯水，柱温80°C，流速0.6 mL/min，进样量20 μL；乙酸检测：HPLC，Aminex HPX-87H柱，流动相5 mmol/L H₂SO₄，柱温50°C，流速0.6 mL/min，进样量5 μL
2.7 统计分析
所有实验均进行三次重复，所有数据以平均值±标准差（SD）表示。使用SPSS 22进行统计分析，采用单因素和双因素方差分析（ANOVA），随后根据情况使用Tukey's HSD或Games-Howell事后检验。统计显著性设为P < 0.05，不同小写字母表示组间差异显著。数据处理和图表绘制使用Origin 2026完成。
【数据】重复次数：3次；统计方法：单因素/双因素ANOVA + Tukey's HSD或Games-Howell事后检验；显著性阈值：P < 0.05
研究结果
3.1 D-阿洛酮糖生物合成途径的构建与碳通量优化
D-阿洛酮糖可通过磷酸化-去磷酸化级联反应从D-葡萄糖生物合成，该途径在大肠杆菌中代谢可行且热力学有利。然而，在实际发酵条件下，该途径的合成效率仍受到中心碳代谢通量分布的显著制约——尤其是果糖-6-磷酸（F6P）在Embden–Meyerhof–Parnas（EMP）途径与产物生物合成途径之间的竞争性分流。因此，有必要通过代谢工程手段对关键通量节点进行系统性重塑。
为增强F6P上游碳通量的供应能力，在E. coli BL21(DE3)中过表达葡萄糖激酶（GLK）和磷酸葡萄糖异构酶（PGI），以增强D-葡萄糖向F6P的转化；同时引入D-阿洛酮糖-6-磷酸3-差向异构酶（ALSE）和D-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶（A6PP），构建完整的D-阿洛酮糖生物合成模块，获得重组菌株BL-Z。在72 h发酵条件下，以15 g/L D-葡萄糖为底物，BL-Z产D-阿洛酮糖2.46 ± 0.13 g/L，总碳摩尔得率为17.9%，对应葡萄糖得率为18.1%。这一结果表明该生物合成途径在大肠杆菌中具备基本的D-阿洛酮糖生产潜力。
尽管该途径整体具有热力学优势，但ALSE催化的F6P向D-阿洛酮糖-6-磷酸（A6P）的转化具有可逆性，其反应平衡易受胞内F6P浓度变化的影响。因此，提高F6P的有效胞内可用性被认为是驱动碳通量向目标产物转向的关键策略。基于上述考虑，分别敲除了编码F6P进入EMP途径的酶的pfkA和pfkB基因，构建了单基因敲除菌株E01（ΔpfkA）和双基因敲除菌株E02（ΔpfkA ΔpfkB），以减少EMP途径对F6P的竞争。在72 h发酵终点，E01和E02的D-阿洛酮糖产量分别提升至3.32 ± 0.24 g/L和3.82 ± 0.15 g/L，对应葡萄糖得率达到22.1%和25.4%。其中，E02的D-阿洛酮糖产量提升最为显著。尽管其生物量（OD₆₀₀ = 9.4）略低于E01和BL-Z，但整体碳通量更大幅度地转向了目标生物合成途径。
发酵过程中底物和乙酸的动态分析显示，尽管D-葡萄糖在72 h内几乎被完全消耗，但整体转化效率仍然有限，同时观察到培养基明显酸化。这一现象表明菌体仍遭受显著的通量溢流和碳损失。值得注意的是，随着pfkA和pfkB的依次敲除，乙酸积累水平呈下降趋势，且E02菌株在发酵24 h后出现了乙酸浓度下降的拐点。同时，pfkA和pfkB的缺失会减缓糖酵解速率、减少乙酸积累，并增强工程菌株后续乙酸再同化的内在能力。上述结果表明，在低糖酵解通量条件下，乙酸可被重新同化，作为细胞代谢的潜在替代碳源。以上结果证明，乙酸在该系统中扮演着"代谢负担"和"潜在碳源"的双重角色，为后续乙酸代谢重构和双碳源发酵策略的提出奠定了实验基础。
【数据】BL-Z产量：2.46 ± 0.13 g/L（72 h）；BL-Z总碳摩尔得率：17.9%；BL-Z葡萄糖得率：18.1%；E01产量：3.32 ± 0.24 g/L；E02产量：3.82 ± 0.15 g/L；E01葡萄糖得率：22.1%；E02葡萄糖得率：25.4%；E02生物量：OD₆₀₀ = 9.4；发酵时间：72 h；D-葡萄糖初始浓度：15 g/L
3.2 产物合成阶段的乙酸代谢调控
以D-葡萄糖为唯一碳源发酵时，好氧条件下高葡萄糖摄取速率会触发溢流代谢，通过丙酮酸氧化酶（poxB）和磷酸转乙酰酶-乙酸激酶（pta-ackA）途径导致乙酸积累。基于上述乙酸积累的代谢机制，本研究以E02为起始菌株，对乙酸合成的两条核心途径进行组合敲除，构建了重组菌株E03（ΔpoxB）、E04（ΔpoxB ΔackA）、E05（ΔpoxB Δpta）和E06（ΔpoxB ΔackA Δpta）。该工作旨在通过重构乙酸代谢网络来减少乙酸积累和碳通量损失。
72 h发酵结果显示，poxB基因的单敲除对乙酸积累表现出显著的抑制效果。菌株E03在发酵12 h时达到峰值乙酸积累50.4 ± 0.6 mmol/L，随后逐渐下降，发酵终点最终乙酸积累为24.6 ± 1.6 mmol/L——与起始菌株E02（72.1 ± 0.5 mmol/L）相比降低了65.9%。额外敲除ackA的菌株E04在24 h时达到峰值乙酸积累42.9 ± 2.2 mmol/L，其最终乙酸积累进一步降至13.2 ± 0.9 mmol/L，降幅达81.7%，表明对乙酸积累具有更显著的抑制效果。与E03和E04形成鲜明对比的是，额外敲除pta的菌株E05和E06在整个发酵周期中几乎未观察到明显的乙酸积累，发酵12 h时乙酸峰值仅为8.0 ± 0.5 mmol/L和7.5 ± 0.3 mmol/L。
然而值得注意的是，pta基因敲除导致E05和E06菌株严重生物量损失，其发酵终点OD₆₀₀仅达到2.5和2.7；D-阿洛酮糖产量仅为1.80 ± 0.10 g/L和1.43 ± 0.23 g/L，远低于E03和E04菌株的4.18 ± 0.09 g/L和4.14 ± 0.12 g/L。这一表型差异源于它们不同的代谢角色：pta缺失阻断了乙酰辅酶A向乙酰磷酸的转化，破坏了辅酶A池稳态；而ackA缺失仅中断了末端乙酸生成步骤。基于观察到的表型特征和已有研究，推测pta基因缺失导致胞内乙酰辅酶A大量积累。已有研究证实，乙酰辅酶A的过度积累与中心碳代谢关键酶（如柠檬酸合酶gltA）的抑制相关，破坏中心碳代谢稳态，最终引发生长缺陷。
综上，上述结果表明单纯追求完全抑制乙酸并不等同于代谢优化。尽管pta敲除能最大程度地消除乙酸积累，但其对乙酰辅酶A代谢平衡的破坏带来了相当大的生理代价。这一现象表明，在针对乙酸代谢调控的工程设计中，维持乙酰辅酶A相关通路的代谢灵活性和稳态对于实现高效产物生物合成更为关键。
【数据】E03峰值乙酸：50.4 ± 0.6 mmol/L（12 h）；E03终点乙酸：24.6 ± 1.6 mmol/L（较E02降65.9%）；E04峰值乙酸：42.9 ± 2.2 mmol/L（24 h）；E04终点乙酸：13.2 ± 0.9 mmol/L（较E02降81.7%）；E05峰值乙酸：8.0 ± 0.5 mmol/L（12 h）；E06峰值乙酸：7.5 ± 0.3 mmol/L（12 h）；E02终点乙酸：72.1 ± 0.5 mmol/L；E05生物量：OD₆₀₀ = 2.5；E06生物量：OD₆₀₀ = 2.7；E05产量：1.80 ± 0.10 g/L；E06产量：1.43 ± 0.23 g/L；E03产量：4.18 ± 0.09 g/L；E04产量：4.14 ± 0.12 g/L；发酵时间：72 h
3.3 乙酸自适应实验室进化与双碳源发酵策略评估
尽管先前的代谢工程改造已有效控制了菌株发酵过程中的乙酸积累，但要实现"乙酸供生长、D-葡萄糖供合成"的双碳源发酵目标，仍需进一步增强菌株的乙酸耐受性和同化效率。为此，以E04为起始菌株，利用微生物微滴培养（MMC）系统进行乙酸自适应实验室进化（ALE）。经过30代连续传代培养，获得了能够耐受160 mmol/L乙酸的进化菌株。以OD₆₀₀为核心筛选标准，选取传代稳定性优异的5株菌进行后续表征。
将进化菌株接种于含140 mmol/L乙酸的培养基中培养，12 h生长曲线显示进化菌株的生长性能显著优于亲本菌株E04。其中表现最优的菌株E11在12 h时的OD₆₀₀达到5.8，而亲本菌株E04仅为2.1。同时，E11在12 h内对乙酸的同化速率也明显加快，残余乙酸浓度显著低于E04。基于E11的优良表型，进一步对其进行了转录组学分析，以解析乙酸耐受和同化的分子机制。
以E04为对照，对E11在140 mmol/L乙酸条件下的转录组进行分析。KEGG富集分析显示，乙酸胁迫下差异表达基因显著富集于三羧酸循环、乙醛酸循环、氨基酸代谢以及ABC转运蛋白等通路。进一步比较乙酸同化相关基因的表达水平发现，E11中乙酰辅酶A合成酶基因acs、柠檬酸合酶基因gltA以及乙醛酸循环关键基因aceA、aceB的表达均显著上调。基于转录组结果，在E11中过表达acs和gltA基因，以增强乙酸同化途径的碳通量，构建了菌株E20。在含140 mmol/L乙酸的培养基中，E20的乙酸利用能力和生长性能进一步提升。在双碳源发酵条件下，E20展现出优异的D-阿洛酮糖合成性能。经发酵条件优化后，E20的D-阿洛酮糖产量达到5.28 ± 0.22 g/L，葡萄糖得率提升至52.8%，总碳摩尔得率较初始菌株BL-Z提高了67.6%，乙酸利用率达到90.6%。
【数据】ALE进化代数：30代；乙酸耐受浓度：160 mmol/L；E11的12 h OD₆₀₀：5.8（E04为2.1）；乙酸浓度：140 mmol/L；E20产量：5.28 ± 0.22 g/L；葡萄糖得率：52.8%；总碳摩尔得率提升：67.6%；乙酸利用率：90.6%；D-葡萄糖补加量（优化后）：10 g/L
讨论与解读
本研究构建了一种通过乙酸与D-葡萄糖协同利用实现D-阿洛酮糖生物合成的双碳源发酵策略。通过核心碳代谢途径重构和乙酸自适应进化，构建了以乙酸支持细胞生长、D-葡萄糖专用于产物生物合成的高效微生物细胞工厂。在摇瓶发酵中，总碳摩尔得率提高了67.6%，葡萄糖得率达到52.8%，乙酸利用率达到90.6%。该策略实现了菌体生长与产物生物合成的时空分离，有效缓解了传统发酵模式中生物量积累与产物合成之间的碳通量竞争。同时，该研究也凸显了乙酸作为可持续原料用于微生物生产高值糖醇的潜力。然而，放大至工业生物反应器仍需系统优化溶解氧、pH和补料策略，以协调双碳源利用实现稳定的工业应用。此外，转录组分析深入阐明了乙酸耐受与同化的分子机制，有望推动未来开发更精准的调控策略，促进乙酸在工业生物制造中的规模化应用。
【编译者解读】该研究最值得借鉴之处在于将"废物"乙酸转化为功能性碳源——通过阻断合成、解除抑制、进化驯化、强化同化四步递进式改造，实现了碳原子的"应收尽收"。双碳源时空分离策略巧妙回避了生长与产物合成争夺碳通量的固有矛盾，对其他以葡萄糖为底物的稀有糖或糖醇生产体系具有直接迁移价值。但摇瓶数据与工业放大之间仍有相当距离，溶解氧、pH控制及补料策略的系统优化是产业化前的必经之路。乙酸作为工业废弃物，其利用成本与纯化能耗也需纳入全流程经济性评估。
参考来源
Zhao, L. Construction of a carbon-conserving pathway for D-allulose production by regulating the co-utilization of acetate and glucose in engineered Escherichia coli. Food Bioscience, 2026. DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109211
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109211