来源：Enhanced monensin biosynthesis in Streptomyces cinnamonensis with multigene integration and overexpression of newly identified genes（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
莫能菌素是由肉桂地链霉菌产生的一种聚醚类抗生素，其生物合成途径高度复杂，关键基因解析不足长期制约工业产量提升。本研究基于前期转录组分析，采用多基因整合策略系统改造初级代谢、前体合成、ATP供给、胁迫抗性及莫能菌素生物合成基因簇五大模块。通过共表达磷酸果糖激酶（pfk）、柠檬酸合酶（cs）、甲基丙二酰-CoA变位酶亚基β（mutB）及甲基丙二酰-CoA变位酶（mcm），莫能菌素产量从12.6 g/L提升至20.2 g/L，较原始菌株提高约60%。进一步利用新型ΦBT1整合系统pKHBT1共表达七个基因，5 L发酵罐中产量达26.2 g/L，为原始菌株的两倍以上。
研究背景
莫能菌素是肉桂地链霉菌发酵产生的聚醚类抗生素，因高效、低毒且不易产生耐药性，广泛用作兽药和饲料添加剂。然而，当前肉桂地链霉菌的莫能菌素生产效率仍难以满足畜牧业日益增长的需求。随着微生物代谢工程和合成生物学等前沿生物技术的快速发展，理性优化关键基因和代谢模块以实现莫能菌素高效生产已具备可行性。近年来，将生物合成途径中功能明确的代谢单元——如初级代谢、前体生物合成、ATP生成和胁迫抗性——作为改造靶点，已成为提高抗生素产量的有效策略。例如，Lee等人通过强化Embden–Meyerhof–Parnas（EMP）途径并重构碳代谢，促进乙酰-CoA积累，为莫能菌素等产物提供关键前体；Ryu等人则通过过表达乙酰-CoA羧化酶亚基（accA2、accB、accE）增强丙二酰-CoA生物合成，丰富了前体供给。
研究方法
2.1 菌株、质粒与材料
本研究所用菌株与质粒列于表S1。肉桂地链霉菌M6002保存于本实验室。大肠杆菌菌株在37°C的Luria-Bertani（LB）培养基中培养。大肠杆菌JM109用于分子克隆，大肠杆菌ET12567用于接合转移。阿普拉霉素（Apr）、潮霉素（Hyg）、萘啶酸购自阿拉丁（中国上海）。其他化学试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
【数据】菌株：肉桂地链霉菌M6002、大肠杆菌JM109、大肠杆菌ET12567；温度：37°C；培养基：LB
2.2 菌株构建
使用菌株基因组DNA提取试剂盒（江苏康为世纪生物科技股份有限公司）提取肉桂地链霉菌M6002基因组DNA。以肉桂地链霉菌M6002基因组DNA为模板，使用高保真2×Super Pfx MasterMix（江苏康为世纪生物科技股份有限公司）对四个目标基因片段进行PCR扩增。扩增产物经SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒（生工生物工程股份有限公司）纯化后，按照Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit（翌圣生物科技股份有限公司）说明书无缝克隆至pIB139载体。引物见表S2。重组质粒随后转化至大肠杆菌JM109。随后，将成功重组的质粒转化至大肠杆菌ET12567/pUZ8002。通过接合转移，将质粒转入肉桂地链霉菌M6002。
为构建新型整合质粒，将pSET152中的ΦC31 attP-int替换为ΦBT1 attP-int。ΦBT1 attP-int序列通过商业合成获得。以pSET152质粒为模板，使用pSET-F/pSET-R引物扩增获得线性化载体。连接转化后获得质粒pKBT1。随后，以pSH69质粒为模板，使用HYR-F/HYR-R引物扩增潮霉素片段。以pKBT1质粒为模板，使用PKBT1-F/PKBT1-R引物扩增获得线性化载体。连接转化后获得质粒pKHBT1。对新型整合质粒pKHBT1的整合效率、稳定性和拷贝数进行测试，以确保其可用性。最后，通过接合转移将质粒转入肉桂地链霉菌M6002。
【数据】PCR聚合酶：2×Super Pfx MasterMix；克隆试剂盒：Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit；模板：肉桂地链霉菌M6002基因组DNA；抗生素标记：阿普拉霉素、潮霉素
2.3 新型多基因整合质粒评估
2.3.1 接合转移效率评价
将基于ΦBT1的新型载体pKHBT1与广泛使用的基于ΦC31的载体pIB139的接合转移效率进行定量比较。简言之，将等量（1 μg）纯化的pKHBT1和pIB139质粒DNA分别导入供体菌大肠杆菌ET12567/pUZ8002。在相同实验条件下与肉桂地链霉菌M6002进行接合。随后将接合混合物涂布于含有相应抗生素（pKHBT1用潮霉素，pIB139用阿普拉霉素）及萘啶酸的选择性培养基上。30°C培养7天后，计数外源整合子菌落数。接合频率以每微克质粒DNA获得的菌落形成单位（CFU）计算。
【数据】质粒用量：1 μg；温度：30°C；时间：7天；抗生素：潮霉素（pKHBT1）、阿普拉霉素（pIB139）；添加物：萘啶酸
2.3.2 遗传稳定性评估
为评估整合构建体的遗传稳定性，随机选取3个携带基于ΦBT1的pKHBT1整合的菌株S26外源整合子，在不含抗生素的高氏一号培养基上连续传代培养5代。末代培养后，将细胞影印接种至含或不含潮霉素的琼脂平板上。所有测试克隆（100%）在5轮非选择培养后仍保留潮霉素抗性，证明整合DNA在染色体上稳定遗传。
【数据】传代数：5代；培养基：高氏一号（无抗生素）；稳定性：100%克隆保留潮霉素抗性
2.4 培养基与培养条件
种子培养基：葡萄糖（5 g/L）；豆饼粉（15 g/L）；糊精（20 g/L）；酵母粉（2.5 g/L）。用NaOH调pH至约6.8，随后添加CaCO₃（1 g/L）。培养条件为30°C、240 rpm、24小时。
发酵培养基：葡萄糖（36 g/L）；豆饼粉（33 g/L）；无水Na₂SO₄（2.2 g/L）；NaNO₃（2.2 g/L）；K₂HPO₄（0.075 g/L）；MnCl₂（0.33 g/L）；FeSO₄·7H₂O（0.12 g/L）；Al₂(SO₄)₃（0.7 g/L）。用NaOH调pH至约7.2，添加CaCO₃ 2.5 g/L。充分混匀后，补充大豆油至浓度45 g/L。培养条件为30°C、220 rpm、8–10天。
【数据】种子培养基：葡萄糖5 g/L、豆饼粉15 g/L、糊精20 g/L、酵母粉2.5 g/L、CaCO₃ 1 g/L，pH 6.8；种子培养：30°C、240 rpm、24 h；发酵培养基：葡萄糖36 g/L、豆饼粉33 g/L、Na₂SO₄ 2.2 g/L、NaNO₃ 2.2 g/L、K₂HPO₄ 0.075 g/L、MnCl₂ 0.33 g/L、FeSO₄·7H₂O 0.12 g/L、Al₂(SO₄)₃ 0.7 g/L、CaCO₃ 2.5 g/L、大豆油45 g/L，pH 7.2；发酵培养：30°C、220 rpm、8–10天
2.5 分析与检测技术
取10 mL发酵液，4000 ×g离心10分钟使菌丝体沉淀。沉淀菌丝体积（PMV）以沉淀体积占初始样品体积的百分比表示，作为生物量指标。莫能菌素浓度采用香草醛比色法测定。在强酸条件下，香草醛与莫能菌素反应，通过羧基脱水形成共轭双键结构，该结构在可见光谱520 nm处具有特征吸收。简言之，取发酵样品与香草醛试剂（3%，w/v，甲醇配制）及浓硫酸混合。反应混合物在65°C孵育30分钟，使粉红色至紫色显色充分发育——由于香草醛与莫能菌素内酯部分发生特异性反应，显色强度与莫能菌素浓度成正比。冷却至室温后，用分光光度计在520 nm处测定吸光度。使用纯莫能菌素标准品（Sigma-Aldrich）在0–120 μg/mL浓度范围内制备标准曲线，获得线性回归方程y = 0.0292x + 0.0393（R² = 0.9995）。所有样品适当稀释以确保测量值落在测定线性范围内。
葡萄糖浓度使用生物传感分析仪测定。用配套葡萄糖标准液校准后，将发酵样品适当稀释，取25 μL稀释样品进样分析。发酵液中葡萄糖浓度由仪器读数乘以稀释倍数计算获得。
乙酰-CoA水平使用商业化乙酰辅酶A检测试剂盒（慧嘉生物，产品编号EHJ-53889x）定量。该测定基于双抗体夹心酶联免疫吸附测定（ELISA）。简言之，预包被纯化乙酰-CoA特异性抗体的微孔板作为固相。加入样品或标准品，使乙酰-CoA与固定化抗体结合。随后加入乙酰-CoA特异性的辣根过氧化物酶（HRP）标记检测抗体，形成抗体-抗原-抗体夹心复合物。洗涤去除未结合组分后，加入3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）底物。HRP催化TMB转化为蓝色产物，加入终止液后变黄。使用酶标仪在450 nm处测定吸光度，通过与每次实验生成的标准曲线（浓度范围5–60 pmol/L）比较确定乙酰-CoA浓度。
【数据】取样量：10 mL；离心：4000 ×g、10 min；检测波长：520 nm（莫能菌素）、450 nm（乙酰-CoA）；香草醛浓度：3%（w/v）；反应温度：65°C；反应时间：30 min；标准曲线：y = 0.0292x + 0.0393（R² = 0.9995），0–120 μg/mL；进样量：25 μL（葡萄糖）；乙酰-CoA标准曲线范围：5–60 pmol/L
2.6 RT-qPCR分析
采用实时荧光定量逆转录PCR（RT-qPCR）分析选定基因的转录水平。使用HiScript® Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（Vazyme，中国）将总RNA逆转录为cDNA。RT-qPCR在QuantStudio™ 5实时荧光定量PCR系统（Applied Biosystems，美国）上进行，使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，中国），按制造商说明书操作。基因特异性引物见表S3。以16S rRNA基因作为内参对目标基因表达进行归一化。相对表达水平按……（原文后续内容未提供）
【数据】仪器：QuantStudio™ 5 Real-Time PCR System；试剂：ChamQ SYBR qPCR Master Mix；内参基因：16S rRNA
研究结果
3.1 通过EMP/TCA途径优化碳通量以提高莫能菌素产量
莫能菌素的产生需要大量乙酰-CoA作为关键前体。EMP途径是肉桂地链霉菌中乙酰-CoA生成的主要途径。基于转录组分析，鉴定了EMP途径中的四个关键调控节点：葡萄糖激酶（glk）、磷酸果糖激酶（pfk）、磷酸葡萄糖异构酶（pgi）和丙酮酸脱氢酶（pdh），均为该途径的关键基因（图1A）。随后，将这些关键基因分别过表达，构建相应的整合质粒并通过接合转移导入链霉菌，成功获得菌株S1、S2、S3和S4（图1B）。
其中，葡萄糖激酶（glk）催化葡萄糖的初始磷酸化，是调控葡萄糖进入EMP途径的主要控制点；磷酸葡萄糖异构酶（pgi）介导葡萄糖-6-磷酸与果糖-6-磷酸之间的可逆互变，直接影响EMP途径与磷酸戊糖途径之间的碳通量分配。磷酸果糖激酶（pfk）是EMP途径中最关键的限速酶，催化果糖-6-磷酸不可逆转化为果糖-1,6-二磷酸，驱动碳通量向下游代谢流动。丙酮酸脱氢酶（pdh）通过催化丙酮酸氧化脱羧生成乙酰-CoA，占据连接EMP途径与三羧酸循环的中心位置，从而将碳源完全导向能量代谢和合成前体供给。
结果表明，四种工程菌株的莫能菌素效价分别达到14.7 g/L、15.7 g/L、13.3 g/L和13.2 g/L，较对照分别提高14.8%、22.6%、3.9%和3.8%。其中，工程菌株S2（pfk）表现出优异的生长性能，PMV较对照提高4.9%（图1C）。
为进一步探究莫能菌素产量提高的因素，定量检测了四种工程菌株的胞内乙酰-CoA水平。结果表明，四种菌株的乙酰-CoA水平均高于对照，分别提高28.3%、15.2%、26.4%和30.4%。值得注意的是，菌株S2的乙酰-CoA浓度为71.3 pmol/L，并非工程菌株中最高（图1D）。这一观察结果表明，菌株S2中的乙酰-CoA被优先导向莫能菌素生物合成而非胞内积累，从而实现了更高的莫能菌素生产效率。
基于上述发现，我们推测EMP途径关键基因的过表达促进了乙酰-CoA积累，使链霉菌能够更高效地合成莫能菌素。为验证这些关键基因的过表达是否确实促进莫能菌素生物合成增强，对菌株S1–S4进行了RT-qPCR分析。结果显示，所有目标基因的转录水平均显著上调（图1F），从而支持了我们的假设。
莫能菌素的生物合成需要大量ATP和还原力。三羧酸循环（TCA）作为细胞碳分配和能量转换的中心调控网络，对其关键节点酶活性的精准调控可显著增强代谢通量，从而为莫能菌素等次级代谢产物的合成提供充足的ATP和还原当量。本研究将三羧酸循环内调控乙酰-CoA代谢的四个关键酶编码基因——柠檬酸合酶（cs）、异柠檬酸脱氢酶（idh）、乌头酸酶（aco）和琥珀酸脱氢酶（trfA）（图1A）——分别过表达。构建相应的整合质粒并通过接合转移导入链霉菌，成功获得菌株S5–S8（图1B）。
其中，柠檬酸合酶（cs）催化乙酰-CoA与草酰乙酸缩合生成柠檬酸，是TCA循环中的关键限速酶。异柠檬酸脱氢酶（idh）催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸，调控碳通量向下游α-酮戊二酸方向分配并产生NADH。琥珀酸脱氢酶（trfA）催化琥珀酸氧化为延胡索酸，同时将氢原子转移至FAD生成FADH₂。这些酶共同为莫能菌素生物合成提供必需的能量和还原力。
结果显示，四种工程菌株的莫能菌素效价分别达到14.5 g/L、14.3 g/L、14.6 g/L和14.2 g/L。四个关键基因的过表达仅使莫能菌素产量获得适度提升，较对照菌株提高约8.6%（图1E）。其中，菌株S7（cs）的PMV最高，达48.2%，超过其他工程菌株，较对照提高7.1%。
为进一步阐明关键基因过表达在莫能菌素生产中的作用，对菌株S5–S8进行了RT-qPCR分析。结果表明，所有过表达基因（cs、idh、aco和trfA）的转录水平均显著升高（图1F）。Inigo等人也证实了TCA循环在葡萄糖代谢中的关键作用及其调节生产速率的能力。因此，这些发现表明，提高TCA循环关键基因的表达有助于增强莫能菌素积累和改善生物量形成。
【数据】菌株S1–S4莫能菌素效价：14.7、15.7、13.3、13.2 g/L；较对照提高：14.8%、22.6%、3.9%、3.8%；S2的PMV较对照提高4.9%；乙酰-CoA水平较对照提高：28.3%、15.2%、26.4%、30.4%；S2乙酰-CoA浓度：71.3 pmol/L；菌株S5–S8莫能菌素效价：14.5、14.3、14.6、14.2 g/L；较对照提高约8.6%；S7的PMV：48.2%，较对照提高7.1%
3.2 增强前体供给以提高莫能菌素产量
莫能菌素由五分子丙二酰-CoA、一分子乙基丙二酰-CoA和七分子甲基丙二酰-CoA通过一系列缩合和修饰反应组装而成。鉴于对甲基丙二酰-CoA的高需求，本研究提出了三种代谢工程策略以进一步提高其胞内可用性：（1）过表达β-羟基丁酰-CoA脱水酶（bhbA）和异丁酰-CoA变位酶（icm），促进异丁酰-CoA向甲基丙二酰-CoA的多步氧化过程；（2）过表达甲基丙二酰-CoA变位酶（mcm），增强琥珀酰-CoA向甲基丙二酰-CoA的异构化，从而加强其与中心代谢（TCA循环）的偶联；（3）过表达甲基丙二酰-CoA变位酶亚基β（mutB），促进（2R）-甲基丙二酰-CoA向（2S）-甲基丙二酰-CoA的高效转化——后者是莫能菌素合酶所需的底物，从而确保正确构型前体的直接生物合成利用（图2A）。
基于上述策略，成功构建了分别过表达相应目标基因的重组菌株S9、S10、S11和S12。发酵结果表明，过表达甲基丙二酰-CoA变位酶基因（mcm）和甲基丙二酰-CoA变位酶亚基β基因（mutB）的菌株S11和S12表现最佳，莫能菌素效价分别为15.5 g/L和15.8 g/L，较对照菌株分别提高21.1%和23.5%（图2C）。
Reeves等人将包含调控甲基丙二酰-CoA代谢的mutA和mutB的DNA片段整合至红霉素产生菌的染色体中。在以油基培养基进行的发酵条件下，红霉素产量……（原文后续内容未完整提供）
【数据】菌株S11莫能菌素效价：15.5 g/L，较对照提高21.1%；菌株S12莫能菌素效价：15.8 g/L，较对照提高23.5%
3.3 工程化ATP供给与胁迫抗性以提高莫能菌素产量
（原文此处内容未完整提供，但从图表清单可推断该部分涉及ATP合酶β亚基（assβ）、真菌硫醇偶联酶（mac）、细胞色素c氧化酶（coxI）等基因的过表达研究）
【数据】原文未详述
3.4 莫能菌素生物合成基因簇（BGC）内基因的过表达
（原文此处内容未完整提供，从图表清单可推断该部分涉及莫能菌素BGC内关键基因如monE的单独过表达研究）
【数据】原文未详述
3.5 组合模块工程菌株的摇瓶发酵性能
（原文此处内容未完整提供。从摘要可知：共表达pfk、cs、mutB、mcm使莫能菌素效价从12.6 g/L提升至20.2 g/L，较原始菌株提高约60%；共表达assβ、mac、monE使产量从12.6 g/L提升至19.4 g/L，提高约50%。从图表清单推断S24为EMP/TCA/前体基因组合（pfk、cs、mcm、mutB），S25为ATP/胁迫/BGC基因组合（assβ、mac、monE），S26为S25相同组合但通过新型ΦBT1系统整合）
【数据】S24（pfk、cs、mcm、mutB组合）莫能菌素效价：20.2 g/L（较原始菌株12.6 g/L提高约60%）；S25（assβ、mac、monE组合）莫能菌素效价：19.4 g/L（较原始菌株12.6 g/L提高约50%）
3.6 5 L发酵罐中原始菌株与工程菌株S27的批次发酵曲线
（原文此处内容未完整提供。从摘要可知：使用新型pKHBT1系统同时共表达七个基因，在5 L发酵罐中莫能菌素效价提高至26.2 g/L，为原始菌株的两倍以上）
【数据】5 L发酵罐中S27莫能菌素效价：26.2 g/L，为原始菌株（12.6 g/L）的两倍以上
讨论与解读
本研究通过多基因整合系统成功代谢工程改造了一株高效的莫能菌素产生菌。首先强化初级代谢和前体供给模块，有效将中心碳通量导向莫能菌素生物合成途径；随后引入ATP供给、胁迫抗性和莫能菌素生物合成模块，进一步增强了发酵稳健性和菌株的生物合成能力。此外，通过开发新型多位点整合系统，实现了跨越全部五个模块的关键基因高效共整合。最终，工程菌株S27在5 L发酵罐中莫能菌素效价达到26.2 g/L。
尽管摇瓶发酵取得了显著改善，但将工程菌株放大至5 L发酵罐引入了额外挑战——效价增幅较摇瓶条件下降至18%。这一结果强调，代谢工程菌株在放大、受控环境中的表现受复杂的物理化学和操作因素制约，而非仅由遗传修饰决定。这些发现也为进一步优化发酵条件以实现高效规模化生产提供了重要指导。总之，本研究证明基于功能单元的逐步整合策略构成了链霉菌代谢工程的有力框架。
编译者解读
本研究最值得借鉴之处在于将"组学数据指导靶点选择"与"多模块逐步整合"有机结合——从转录组中锁定关键基因，再按代谢逻辑分层装配，避免了盲目过表达带来的代谢负担。新型ΦBT1整合系统的开发解决了多基因共整合的位点限制问题，为放线菌多基因代谢工程提供了通用工具。值得注意的是，摇瓶到发酵罐的放大过程中产量增幅明显收窄（从60%降至18%），提示发酵工艺优化需与菌株改造同步推进——这是工业菌株开发中常被低估的瓶颈。后续研究若能结合动态调控策略平衡各模块基因的表达强度，有望进一步释放该菌株的生产潜力。
参考来源
Xing H. Enhanced monensin biosynthesis in Streptomyces cinnamonensis with multigene integration and overexpression of newly identified genes. Biochemical Engineering Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.bej.2026.110118
DOI: 10.1016/j.bej.2026.110118