来源：Chalcone isomerase-like (CHIL) impedes the lactone shunt and modulates flux partitioning in isoflavonoid biosynthesis（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
异黄酮是大豆等豆科植物特有的苯丙烷类次生代谢产物，具有多种药理活性。在微生物宿主中重构异黄酮生物合成途径常受限于非天然环境下代谢通量的流失。本研究系统表征了非催化性辅助蛋白——查尔酮异构酶类似蛋白（CHIL）在异黄酮途径中的作用，发现其不仅能抑制查尔酮合酶（CHS）的"内酯分流"副反应，还能意外地促进代谢通量向6′-脱氧分支倾斜，使最终产物大豆苷元产量提升33%。该发现拓展了CHIL作为代谢工程辅助蛋白的应用潜力。
研究背景
查尔酮骨架是陆生植物中数千种（异）黄酮类化合物的共同前体。黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎和抗癌等特性，而异黄酮作为豆科植物的特征代谢物，在植物-微生物共生信号传导和病原防御中发挥关键生理作用。在微生物底盘细胞中重构（异）黄酮合成途径，可实现更高效的生产和纯化，并可通过引入新天然衍生物拓展植物化学空间。然而，高效生物生产需要完整解析生物合成途径，并制定通量增强策略以缓解瓶颈、避免不良分流。
苯丙烷途径的起始步骤由苯丙氨酸解氨酶（PAL）和III型聚酮合酶——查尔酮合酶（CHS）催化。CHS的底物混杂性会导致副产物对香豆酰三乙酸内酯（CTAL）的生成。查尔酮异构酶类似蛋白（CHIL）是一种非催化蛋白，已知可作为CHS的伴侣蛋白，纠正其混杂活性并抑制副产物形成。本研究将CHIL的功能分析拓展至豆科特征的异黄酮途径，考察其在分支途径中的通量分配调控作用。
研究方法
4.1 植物材料
大豆（Glycine max L. Merr. var DH410）在人工气候室中培养六周，条件为16小时光照/8小时黑暗，昼温22°C、夜温20°C，昼夜湿度分别为50%和40%。每两周施肥一次（4 g/L Green Flag® 通用水溶性肥料）。叶片组织收获后液氮速冻，保存于−80°C。
【数据】植物材料：大豆DH410；光照周期：16h光/8h暗；温度：22°C昼/20°C夜；湿度：50–40%；施肥：4 g/L，每2周一次；储存温度：−80°C
4.2 化学试剂
体外实验所用分析级和测定级标准品包括：对香豆酸（≥98%，Cayman Chemical，目录号20929）、对香豆酰辅酶A（MicroCombiChem，目录号MCC6907）、丙二酰辅酶A（Sigma Aldrich，目录号M4263）、柚皮素查尔酮（≥95%，Phytolab，经Sigma Aldrich购入，目录号PHL83877）、柚皮素（>93%，TCI America，目录号N0072）、异甘草素（≥97%，Sigma Aldrich，目录号38986）、甘草素（≥98%，Cayman Chemical，目录号28823）、染料木素（≥99%，Thermo Fisher Scientific，目录号J63241.MC）、大豆苷元（≥97%，Thermo Fisher Scientific，目录号B22877）、β-NADPH四钠盐（95%，BioShop，目录号NAD004）以及荧光素钠盐（≥97.5%，Sigma-Aldrich，目录号30181）。代谢物以冻干粉末形式或溶于DMSO后于−20°C保存。
【数据】标准品纯度：对香豆酸≥98%、柚皮素查尔酮≥95%、柚皮素>93%、异甘草素≥97%、甘草素≥98%、染料木素≥99%、大豆苷元≥97%、β-NADPH 95%、荧光素钠≥97.5%；储存温度：−20°C
4.3 多序列比对与同源建模
从Phytozome v.13.0数据库中，通过关键词和序列相似性搜索检索大豆基因组中代表性的type 1（GmCHI2；Glyma.20G241700）、type 2（GmCHI1A；Glyma.20G241500）和type 4（GmCHI4A；Glyma.06G143000）CHI折叠氨基酸序列。以这些大豆序列为查询序列，对Phytozome中所有可用基因组进行BLASTP搜索。每个查询的前500个命中结果经去重处理以获得非冗余数据集。筛选后的序列使用Kalign进行比对，并在Jalview 2.11.4.1版本中查看。使用WebLogo生成序列标志图以可视化目标残基的趋势。从AlphaFold蛋白质结构数据库（DeepMind）获取GmCHIL（Q53B72）、OsCHIL（Q2RBC7）、SmCHIL（D8QX37）和MpCHIL（A0A2R6W2F7）的模型。模型在PyMol 3.1.1中与AtCHIL（PDB：4DOK）和结合NAR的holo-MsCHI-II（PDB：1EYQ）参考结构进行比对。多序列比对中鉴定的目标残基相对于MsCHI-II晶体结构中的NAR分子进行可视化。
【数据】数据库：Phytozome v.13.0；比对软件：Kalign、Jalview 2.11.4.1、WebLogo；结构模型：AlphaFold；比对软件：PyMol 3.1.1；参考结构：AtCHIL PDB:4DOK、holo-MsCHI-II PDB:1EYQ
4.4 RNA提取与cDNA合成
从约70至100 mg大豆叶片组织中提取总RNA，使用Qiagen Tissue Lyser II®（Qiagen，德国）匀浆，每管加入五颗2.8 mm陶瓷珠（OMNI International，GA，USA）。组织匀浆在Rneasy® Plant Mini Kit（Qiagen）提供的RLC缓冲液中进行。RNA提取按试剂盒说明书操作，最终获得30 μL RNA样品。使用NanoPhotometer® NP80（Implen，CA，USA）对总RNA进行定量。取0.2 μg RNA在含1%（v/v）漂白剂的1%（w/v）琼脂糖凝胶（1x TAE缓冲液）上进行电泳，确认浓度和完整性，凝胶用GelRed®（Sigma Aldrich）核酸染色液和Trackit™ CyanOrange上样缓冲液（Invitrogen）染色。以1 μg RNA为模板，使用All-In-One 5X RT MasterMix（ABM，BC，Canada）合成cDNA（该试剂含基因组DNA去除步骤），最终浓度为50 ng/μL。制备的cDNA用作Gm4CL2和GmIFS2克隆的模板。
【数据】RNA提取量：70–100 mg叶片组织；RNA洗脱体积：30 μL；电泳上样量：0.2 μg RNA；凝胶：1%琼脂糖+1%漂白剂；cDNA合成模板量：1 μg RNA；cDNA终浓度：50 ng/μL
4.5 克隆与微生物菌株
本研究所用质粒来源如下。用于大肠杆菌重组蛋白纯化的质粒：pET28α(+)-GmCHIL（Azenta Life Sciences，MA，USA）、pET28α(+)-MpCHIL、pET28α(+)-SmCHIL和pET28α(+)-OsCHIL均为合成生产并经大肠杆菌密码子优化（Twist Bioscience，CA，USA）（补充表3）。含有大豆途径生物合成酶基因的载体获赠自Sangeeta Dhaubhadel教授，包括pET160-DEST-GmCHR14A、pET32α(+)-GmCHS8和pDONR™/221-GmCHI1B2。此外还使用了以下空载体：pET28α(+)（Novagen，德国）、pET160-DEST（Invitrogen，MA，USA）和pDONR™/Zeo（Invitrogen）。大肠杆菌NEB10β菌株用于质粒DNA生产（New England Biolabs（NEB）；MA，USA），BL21（DE3）用于重组蛋白表达。
为构建酵母菌株，使用pESC酵母表达载体（Agilent Technologies，CA，USA），通过限制性酶切克隆将最多两个目的基因插入由反向启动子pGAL1和pGAL10控制的两个多克隆位点（MCS）。目的基因包括用于大肠杆菌异源表达的相同靶标，另添加从大豆叶片cDNA克隆的Gm4CL2和GmIFS2，以及合成产生的经酵母表达密码子优化的At4CL1（Twist Bioscience）。所有靶标均按指示进行C端标签标记，并组装至以下构建体中：pESC-His-GAL1:CHS-myc-GAL10:4CL-FLAG、pESC-Ura-GAL1:CHI-myc、pESC-Ura-GAL1:CHI-myc-GAL10:GmCHIL-FLAG、pESC-Ura-GAL1:CHI-myc-GAL10:OsCHIL-FLAG、pESC-Ura-GAL1:CHI-myc-GAL10:SmCHIL-FLAG、pESC-Ura-GAL1:CHI-myc-GAL10:MpCHIL-FLAG、pESC-Trp-GAL1:CHR-myc、pESC-Leu2d-GAL1:IFS-myc-GAL10:CrCPR-FLAG。最后一个构建体由Yang Qu教授（新不伦瑞克大学）惠赠，含有来自长春花（Catharanthus roseus）的细胞色素P450还原酶。构建体依次转化至酿酒酵母BY4741-OS菌株（MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 trp1Δ0），该菌株由Codruta Ignea教授（麦吉尔大学）惠赠（补充图4A和补充表1）。该菌株通过CRISPR/Cas9在BY4741（MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0）中敲除TRP1获得，所用gRNA靶向TRP1编码序列，无标记供体DNA含有TRP1编码序列的5′和3′侧翼融合区域，通过电穿孔转化导入。
【数据】大肠杆菌菌株：NEB10β（质粒生产）、BL21(DE3)（蛋白表达）；酵母菌株：BY4741-OS（MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 trp1Δ0）；表达载体：pESC系列（pGAL1/pGAL10双向启动子）
4.6 重组蛋白生产
大肠杆菌BL21（DE3）菌株在LB培养基中于37°C、225 rpm振荡培养至OD600达到0.5。加入1 mM异丙基1-硫代-β-半乳糖苷（IPTG）（VWR International，Radnor，PA，USA）诱导蛋白表达，随后在25°C继续培养4小时。诱导细胞以1000×g离心收集，然后按1:10（w/v）重悬于缓冲液A（20 mM Tris-HCl pH 8.0，300 mM NaCl，10%（v/v）甘油）。细胞在冰上使用微探头超声液体处理器（Misonix，NY，USA）进行超声破碎，条件为60 Hz，工作5秒、停5秒，共5分钟。粗可溶组分通过14,000×g离心30分钟与细胞碎片分离。His标签蛋白通过批式/重力流纯化：将澄清的蛋白提取液与TALON® Superflow™树脂（Cytiva，瑞典）在4°C温和搅拌孵育1小时。将树脂/样品混合物装入一次性聚丙烯柱（Thermo Fisher Scientific，MA，USA），用5倍柱床体积的含5 mM咪唑的缓冲液A洗涤。目标蛋白用10倍柱床体积的缓冲液B（20 mM Tris-HCl pH 8.0，300 mM NaCl，150 mM咪唑，10%（v/v）甘油）洗脱，最终洗脱液使用Vivaspin®离心过滤装置（10 kDa MWCO）（Sartorius，德国）浓缩。蛋白浓度使用比色Bradford蛋白测定染料（Bio-Rad，CA，USA）以牛血清白蛋白标准品（Bio-Rad，CA，USA）进行定量。所有离心步骤均在4°C进行，最终纯化蛋白速冻后于−80°C保存至使用。
【数据】培养条件：LB培养基、37°C、225 rpm、OD600 0.5；诱导：1 mM IPTG、25°C、4h；离心：1000×g收集、14,000×g 30min分离；纯化：TALON树脂、4°C孵育1h、5 mM咪唑洗涤、150 mM咪唑洗脱；浓缩：10 kDa MWCO；定量：Bradford法
4.7 体外酶活测定
体外测定按先前方案略作修改进行。反应体系含50 mM HEPES-NaOH缓冲液（pH 7.5）、100 μM对香豆酰辅酶A和200 μM丙二酰辅酶A，总体积50 μL。加入CHS（3 μg）单独或CHS联合CHIL直系同源物（4 μg）启动反应。使用变性（煮沸）的CHIL作为对照。
【数据】缓冲液：50 mM HEPES-NaOH pH 7.5；底物：100 μM对香豆酰辅酶A、200 μM丙二酰辅酶A；反应体积：50 μL；酶量：CHS 3 μg、CHIL 4 μg；CHIL与CHS摩尔比：4:1
研究结果
2.1 植物CHI折叠蛋白的比较序列分析
以大豆中各亚型CHI为查询序列，在Phytozome数据库中搜索不同植物门类的查尔酮异构酶折叠蛋白氨基酸序列，共获得262条type 1、55条type 2和220条type 4 CHI折叠直系同源序列，并对已知对type 1或type 2催化活性或配体结合重要的残基进行比对（图2A和补充图1）。基础苔藓/石松类type 2 CHI序列因该分支中已验证活性酶数量较少而未纳入分析。
全局氨基酸分析揭示，与FAP的非极性空腔相比，辅助性CHIL和催化性CHI中极性和带正电荷残基的分布呈进化性增加趋势。值得注意的是，Tyr106（基于苜蓿MsCHI-II残基编号）在所有type 1、2和4 CHI折叠序列中高度保守。与预期一致，与type 2活性相关的关键残基（即Gly95、Lys97、Thr190和Met191）在豆科type 2序列中高度保守。豆科type 1序列保留Met191，而非豆科植物在此位置为Ile。
CHIL比较序列分析揭示了豆科与其他被子植物（真双子叶植物和单子叶植物）之间配体结合口袋的差异。豆科CHIL中的Tyr48、Leu95和Ala113与其他植物物种CHIL不同——后者主要分别被Thr/Asn、Val/Ile和Ser/Ala取代。
基于以上调查，选取了四个跨越不同植物谱系的CHIL代表：来自大豆（Glycine max，GmCHIL；豆科）、水稻（Oryza sativa，OsCHIL；单子叶植物）、卷柏（Selaginella moellendorffii，SmCHIL；石松类）和地钱（Marchantia polymorpha，MpCHIL；苔藓植物）。这四个异构体具有相似的初级结构，长度为205至229个氨基酸，序列同一性约为37–60%（补充图2）。
为便于进一步结构分析，生成了这四个蛋白的同源模型并与AtCHIL晶体结构（PDB：4DOK）进行比对（图2B）。结构比较显示CHI折叠高度保守，相对于AtCHIL的均方根偏差（RMSD）值较低：GmCHIL为0.745 Å，OsCHIL为0.755 Å，SmCHIL为0.943 Å，MpCHIL为1.057 Å。
有趣的是，将CHIL结合 cleft 与type 2和type 1 CHI的活性位点——holo-MsCHI-II（PDB：1EYQ；图2C）和holo-MtCHI-I（蒺藜苜蓿；PDB：6MS8；图2D）——进行比较，发现CHIL cleft 内的关键取代可能显著限制底物进入。将底物NAR分子以典型CHI结合方向分别建模至各CHIL的结合空腔中，以研究这些关键残基与潜在分子之间的相互作用（图2E-I）。
与CHI相比，CHIL的结合cleft表现出若干显著结构差异。其中鉴定出两个 bulky 取代：CHI中的Thr/Ser190在CHIL中被Trp取代，而Met191在SmCHIL中被Ile取代，或在其余目标CHIL中被Tyr取代。这些取代可能在cleft中引入空间位阻，改变与NAR的相互作用并成为其容纳的显著障碍。此外，CHI中的催化Lys109在本研究涉及的植物异构体中被Gln取代，这可能进一步限制配体进入结合位点。在GmCHIL空腔中，Tyr48预计会进一步增加空间位阻，可能特别限制豆科CHIL的结合口袋。对本文鉴定的残基进行定向诱变可进一步阐明CHIL的功能和机制；然而此类研究超出本工作范围，应在未来研究中开展。
【数据】序列分析规模：262条type 1、55条type 2、220条type 4 CHI-fold序列；CHIL长度：205–229 aa；序列同一性：37–60%；RMSD值：GmCHIL 0.745 Å、OsCHIL 0.755 Å、SmCHIL 0.943 Å、MpCHIL 1.057 Å
2.2 CHIL直系同源物差异性抑制内酯分流
将纯化的重组GmCHIL、OsCHIL、SmCHIL和MpCHIL分别与GmCHS8组合测定，评估其抑制CTAL生成并促进通量流向NC和NAR的能力（图3A）。测定中，将p-coumaroyl-CoA和malonyl-CoA与单独CHS或CHS联合CHIL异构体孵育，CHIL与CHS的摩尔比为4:1以促进蛋白-蛋白相互作用。两个峰（m/z [271]⁻）被鉴定为NAR和CTAL（图3G）。NAR使用真实标准品定量，而CTAL因不稳定无标准品可用，故以相对峰面积（强度）表示。
添加GmCHIL显著提高了NAR产量（增加2.3倍；图3A）。与单独CHS相比，所有CHIL均使相对CTAL水平降低29–42%（图3D）。如预期，查尔酮中间体NC在孵育期间自发异构化为NAR。与先前CHS表征报道一致，未检测到BNY，可能因其不稳定性。
CHIL纠正CHS底物混杂性的功能已有报道，但其对ISO（6′-脱氧查尔酮）分支的影响此前尚未确定。为评估该分支的影响，在含或不含CHIL的条件下向CHS补充GmCHR14A和NADPH。CHS-CHR偶联反应产生CTAL、NAR和ISO三个 distinct 峰。总体而言，GmCHIL存在时总目标产物水平增加，而GmCHIL、OsCHIL和SmCHIL使相对CTAL峰强度降低（GmCHIL最高降低33%）（图3B、E）。
NC可自发重排为NAR，而ISO的异构化被描述为固有受阻。ISO含有高能分子内CO···H−O键，排除了自环化的显著发生，需要type 2 CHI形式的催化剂。向测定中补充GmCHI1B2以高效转化ISO为(2S)-LIQ，同时催化(2S)-NAR的立体选择性形成。与前述测定一致，CHS、CHR和CHI反应产生CTAL峰。但在这种情况下，仅添加OsCHIL使总产物水平升高，且未观察到相对CTAL强度的统计学显著降低（图3C、F）。
【数据】NAR产量提升：2.3倍（GmCHIL）；CTAL抑制率：29–42%（各CHIL vs CHS单独）；CTAL降低：GmCHIL最高33%（CHS-CHR体系）；CHIL:CHS摩尔比：4:1
2.3 酵母生物转化对香豆酸生成柚皮素
工程化酿酒酵母菌株采用基于质粒的半乳糖诱导pESC载体系统。通过引入4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL；EC 6.2.1.12）将途径向上游延伸一步。该方法以对香豆酸为饲喂底物——比对香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A更稳定且成本更低。生物转化测定通过共表达4CL和CHS进行，菌株与底物孵育48小时，并按指示添加额外质粒。
在第一轮菌株开发中，选择从大豆叶片cDNA克隆的Gm4CL2提供4CL功能。携带pESC-His-CHS-Gm4CL2的菌株（H1）表现出CHS强表达但Gm4CL2弱表达（图4A）。值得注意的是，FLAG标签Gm4CL2的推定条带（约100 kDa，预期大小62 kDa）被确认为内源酵母蛋白的伪影性免疫反应条带——该条带在未诱导和非转化BY4741-OS菌株中同样存在（补充图3）。H1菌株产生痕量终产物NAR，除副产物CTAL外无中间体积累。与体外测定观察一致，该方法不检测p-coumaroyl-CoA，NC自发异构化为NAR。这些结果表明Gm4CL2的弱表达限制了第一步的底物转化。
为缓解这一瓶颈，将Gm4CL2替换为合成的密码子优化的At4CL1。
【数据】发酵时间：48h；底物：对香豆酸；H1菌株蛋白表达：CHS强、Gm4CL2弱；Gm4CL2表观分子量：~100 kDa（预期62 kDa）
讨论与解读
本研究通过体外酶活测定和工程酵母系统表征了辅助蛋白CHIL在完整异黄酮生物合成途径中的功能。除已知的纠正CHS底物混杂性功能外，还发现了CHIL在分支（异）黄酮途径中调控通量分配的新作用。在酵母中联合表达CHIL与不同途径组件组合时，CHIL与CHI和IFS协同驱动代谢通量流向分支途径的脱氧分支，使终产物大豆苷元产量提升33%。该发现强调了非催化组分及功能互作在生物合成途径中的作用，以及它们在植物外代谢工程中的应用潜力。
CHIL执行此功能的机制尚不清楚，但先前研究提示其与CHS存在蛋白-蛋白互作并可能形成代谢通道复合体。CHIL是CHI折叠超家族中唯一能通过抑制内酯分流来纠正CHS底物混杂性的成员。与先前报道一致，本研究明确证明真正的CHI不能抑制内酯（即CTAL）积累。此外，下游酶如CHR和IFS也不能赋予CHS查尔酮生产的保真性。
编译者解读：本研究通过体外与体内双层验证，将CHIL从"黄酮途径纠错因子"拓展为异黄酮分支通量的"分配开关"，方法学上值得借鉴——先用多序列比对和结构建模锁定候选残基，再以纯化蛋白体外验证，最后在酵母中重构全途径验证。非催化蛋白作为代谢通路"分子伴侣"的工程应用策略，为优化异源生物合成提供了一条不依赖酶催化改造的替代路径。后续若能在植物体内验证该调控机制，或将为豆科作物代谢工程提供新靶点。
参考来源
期刊：Biochemical Engineering Journal, 2025
DOI: 10.1016/j.bej.2025.109853
DOI: 10.1016/j.bej.2025.109853