来源：Development of a user-friendly IdgS-Sfp based whole-cell biosensor for high-performance Hg(II) detection in environmental samples（Microchemical Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
汞是毒性极强的重金属污染物，常规仪器检测虽精确但门槛高、难以高频监测。本研究构建了基于IdgS-Sfp系统的全细胞生物传感器，利用其生物合成水溶性蓝色素靛蓝素作为报告信号，省去了脂溶性色素的提取步骤。通过引入MerC转运蛋白、优化诱导温度与时间，传感器实现了0.08 nM的检测限和2.44–156.25 nM的宽定量范围，在多种环境水基质中均表现稳定。
研究背景
汞是极具毒性的重金属，对生态系统和人类健康构成重大风险。汞主要通过自然过程和人为活动广泛分布于环境中，水体中的汞污染尤为令人关注——汞可通过食物链生物富集和生物放大，导致严重的健康问题。美国环保署、世界卫生组织及各国监管机构已对饮用水、地下水、地表水、农业用水、工业废水乃至海水中的汞含量制定了严格指南。这些指南凸显了对灵敏可靠检测方法的迫切需求。
当前汞检测主要依赖仪器技术。这些方法虽然灵敏准确，但往往成本高昂、需要专门设备，不适合频繁监测。近年来，以生物传感器为代表的替代策略逐渐兴起。生物传感器具有快速检测、低成本以及可测量生物可利用态汞等优势。其中，全细胞生物传感器利用基因工程微生物检测汞，受到广泛关注。
本研究引入一种新颖的全细胞生物传感器设计，利用IdgS-Sfp系统生物合成靛蓝素——一种水溶性蓝色素。该策略消除了脂溶性色素常用的提取步骤，有望实现更简便、经济的Hg(II)检测方案。
研究方法
2.1 菌株、质粒与试剂
本研究所用细菌菌株和质粒列于表1。携带质粒的重组大肠杆菌菌株在含50 μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani（LB）培养基（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L氯化钠）中、30°C、150 rpm振荡条件下培养。HgCl₂、Pb(NO₃)₂、CdCl₂、ZnSO₄、MgSO₄、CuSO₄、MnSO₄和CaCl₂储备液均使用分析级化学品（阿拉丁，上海，中国）新鲜配制。寡核苷酸引物和合成DNA片段由生工生物工程（上海，中国）提供。本研究中质粒的生物学组件，包括其DNA序列、推导的氨基酸序列及编码蛋白的理论分子量，详见表S1。
【数据】培养基：LB（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L氯化钠）；抗生素：50 μg/mL氨苄青霉素；温度：30°C；转速：150 rpm；试剂来源：阿拉丁（上海）；引物/片段合成：生工生物（上海）
2.2 质粒构建
编码链霉菌来源的非核糖体肽合成酶IdgS（GenBank: ARE59662.1）和芽孢杆菌来源的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶Sfp（GenBank: ABW74629.1）的基因经大肠杆菌密码子优化后由生工生物（上海，中国）合成。这些基因通过NdeI和SacI限制性酶切位点插入质粒pET-21a，获得目标质粒pT7lac-IdgS-Sfp。该质粒通过化学转化法转入大肠杆菌BL21(DE3)，以验证IdgS和Sfp蛋白的表达。
含merR基因和Pmer双向启动子区的天然Hg(II)响应元件[23]克隆至pT7lac-IdgS-Sfp的BglII和XbaI位点，生成天然偶联生物传感构建体，命名为pHg-IdgS-Sfp。在pHg-IdgS-Sfp的merR基因上游插入额外的组成型PceuR启动子，生成解偶联生物传感构建体，命名为pCon-IND。将组成型PJ23119控制的merC基因（编码Hg(II)转运通道蛋白MerC）作为SacI-HindIII片段插入pCon-IND，生成pCon-IND-C。这三种质粒通过化学转化法转入大肠杆菌TOP10，构建三种全细胞生物传感器：基于天然偶联电路的TOP10/pHg-IdgS-Sfp、基于解偶联电路的TOP10/pCon-IND以及增敏设计传感器TOP10/pCon-IND-C。
三种传感器的基因电路设计、Hg(II)响应的分子机制、Hg(II)经MerC通道的跨膜转运以及可视信号靛蓝素的生物合成机制详见图1A。在未暴露于Hg(II)时，二聚体MerR作为阻遏蛋白结合Pmer，抑制下游idgS-sfp基因簇的转录。当传感器细胞暴露于Hg(II)时，二聚体MerR与Hg(II)结合并转变为激活子[25]，结合Pmer但启动下游idgS-sfp基因簇的转录。翻译表达的Sfp将apo-IdgS激活为holo-IdgS，催化两分子L-谷氨酰胺缩合产生水溶性蓝色素靛蓝素[26]。酶促产生的色素具有级联放大效应，产生肉眼可见的蓝色信号。靛蓝素在596 nm处有特征吸收峰，可用于定量比色分析。
【数据】IdgS来源：链霉菌（GenBank: ARE59662.1）；Sfp来源：芽孢杆菌（GenBank: ABW74629.1）；限制性酶切位点：NdeI/SacI（pT7lac-IdgS-Sfp）、BglII/XbaI（pHg-IdgS-Sfp）、SacI-HindIII（pCon-IND-C）；靛蓝素特征吸收峰：596 nm；宿主菌：BL21(DE3)和TOP10
2.3 全细胞生物传感器培养时间与温度的优化
TOP10/pCon-IND-C的过夜培养物以2%（v/v）比例接种至新鲜LB液体培养基。加入Hg(II)使终浓度达到0和625 nM。培养物在30、34和37°C下、150 rpm振荡培养0–9小时，每小时取样测定细菌密度和色素信号。
【数据】接种比例：2%（v/v）；Hg(II)浓度：0和625 nM；温度：30、34、37°C；转速：150 rpm；时间：0–9 h（每小时取样）
2.4 传感器传感性能比较
为评估三种全细胞生物传感器对Hg(II)的灵敏度和响应范围，制备TOP10/pHg-IdgS-Sfp、TOP10/pCon-IND和TOP10/pCon-IND-C的过夜培养物。各培养物以2%（v/v）比例接种至新鲜LB液体培养基。采用2倍稀释法[27]加入Hg(II)，使终浓度达到0、0.02、0.04、0.08、0.15、0.31、0.61、1.22、2.44、4.88、9.77、19.53、39.06、78.13、156.25、312.5、625、1250、2500和5000 nM。培养物在30°C、150 rpm振荡培养4小时。随后评估细菌生长和色素信号。
【数据】接种比例：2%（v/v）；Hg(II)浓度梯度：0–5000 nM（20个浓度，2倍稀释法）；温度：30°C；转速：150 rpm；时间：4 h
2.5 传感器选择性测定
TOP10/pCon-IND-C传感器的过夜培养物以2%（v/v）比例接种至LB液体培养基。采用2倍稀释法加入Hg(II)、Pb(II)、Cd(II)、Zn(II)、Mg(II)、Cu(II)、Mn(II)和Ca(II)储备液，使终浓度达到37.5、75和150 nM。培养物在30°C、150 rpm振荡培养4小时。随后测定细菌密度和色素信号。
【数据】接种比例：2%（v/v）；金属离子：Hg(II)、Pb(II)、Cd(II)、Zn(II)、Mg(II)、Cu(II)、Mn(II)、Ca(II)；浓度：37.5、75、150 nM；温度：30°C；转速：150 rpm；时间：4 h
2.6 传感器抗干扰测定
TOP10/pCon-IND-C传感器的过夜培养物以2%（v/v）比例接种至LB液体培养基。加入Hg(II)、Pb(II)、Cd(II)、Zn(II)、Mg(II)、Cu(II)、Mn(II)和Ca(II)储备液，设置500 nM和1000 nM两个浓度水平，Hg(II)保持在100 nM的终浓度。培养物在30°C、150 rpm振荡培养4小时。随后测定细菌密度和色素信号。
【数据】接种比例：2%（v/v）；干扰离子浓度：500和1000 nM；Hg(II)浓度：100 nM；温度：30°C；转速：150 rpm；时间：4 h
2.7 环境水样验证
环境水样采集自本实验室产生的去离子水、自来水、广东省深圳市罗湖区东湖公园地表水以及广东省深圳市盐田区大亚湾海水。环境淡水和海水生物传感系统的建立基于我们先前发表的方法[28,29]。简要而言，样品以12,000 rpm离心10分钟澄清，上清液经0.22 μm滤膜（Millipore，Billerica，MA，USA）过滤以去除细菌后储存备用。过滤样品中的汞含量低于原子吸收光谱法（Perkin-Elmer，USA）的检测限。
按表2中的比例混合四种水样、10 × LB肉汤、10 × 无NaCl LB肉汤和无菌水，制备传感培养体系。过夜活化的TOP10/pCon-IND-C培养物以2%（v/v）比例接种至上述四种含50 μg/mL氨苄青霉素的传感培养体系中。采用2倍稀释法[11]引入Hg(II)，使终浓度达到0、2.34、4.69、9.38、18.75、37.5、75和150 nM。培养物在30°C、150 rpm振荡培养4小时，随后测定细菌密度和色素信号。
【数据】离心：12,000 rpm、10 min；滤膜：0.22 μm；水样类型：去离子水、自来水、东湖地表水、大亚湾海水；接种比例：2%（v/v）；氨苄青霉素：50 μg/mL；Hg(II)浓度：0–150 nM（8个浓度）；温度：30°C；转速：150 rpm；时间：4 h
2.8 细菌密度和靛蓝素衍生信号的测定
取100 μL诱导培养物转移至96孔微板中，使用微板阅读器（BioTek Epoch，Winooski，VT，USA）在600 nm波长处测定。培养物使用MiniSpin离心机（Eppendorf，Hauppauge，NY，USA）在8000g离心2分钟。随后取100 μL含溶性靛蓝素的上清液转移至新的96孔微板。样品在微板阅读器上于596 nm和600 nm波长处测定。596 nm处的吸光度用于指示靛蓝素信号。细菌细胞密度通过离心前细菌培养物的600 nm吸光度减去离心后上清液的600 nm吸光度来确定。
【数据】培养物体积：100 μL；测定波长：600 nm（菌密度）、596 nm（靛蓝素信号）；离心：8000g、2 min；上清液体积：100 μL；仪器：BioTek Epoch微板阅读器、Eppendorf MiniSpin离心机
2.9 统计分析
数据分析使用IBM SPSS 26.0版进行，数据拟合和绘图使用Origin（Origin Pro，2024）完成。所有实验独立重复至少三次，数据以平均值±标准差表示（mean ± SD，n = 3）。两组间差异采用t检验分析，两组以上比较采用方差分析（ANOVA）。除非另有说明，显著性水平设定为P < 0.05。
【数据】统计软件：IBM SPSS 26.0、Origin Pro 2024；重复次数：≥3；数据表示：mean ± SD（n = 3）；检验方法：t检验、ANOVA；显著性水平：P < 0.05
研究结果
3.1 IdgS和Sfp表达的诱导及靛蓝素生物合成的催化
本研究旨在利用IdgS和Sfp开发基于色素的汞生物传感报告系统。为研究IdgS和Sfp的表达及靛蓝素的产生，我们首先构建了IPTG诱导型质粒pT7lac-IdgS-Sfp和Hg(II)诱导型质粒pHg-IdgS-Sfp（图1B）。随后，使用0.5 mM IPTG诱导重组大肠杆菌BL21(DE3)/pT7lac-IdgS-Sfp中这些酶的表达。结果显示，IdgS和Sfp在30°C、34°C和37°C下均成功表达，SDS-PAGE分析中蛋白条带分别出现在约26.1 kDa和140.9 kDa处（图1C）。然而，仅在30°C下，IPTG诱导4小时后观察到细菌培养物和上清液的微弱颜色变化（图1D）。
接下来，我们构建了Hg(II)响应传感器TOP10/pHg-IdgS-Sfp。该构建体不含MerC转运蛋白——已知MerC可显著增强汞摄取[31]。尽管缺乏MerC，该传感器仍能响应Hg(II)诱导。我们使用625 nM Hg(II)在不同温度下诱导8小时。结果表明，37°C诱导时可观察到清晰的IdgS和Sfp蛋白条带。相比之下，30°C和34°C下未观察到明显条带（图1E）。有趣的是，IdgS和Sfp蛋白的表达水平随温度升高而增加，但色素积累显著减少，37°C下检测不到色素（图1F）。
这表明重金属离子（包括Hg(II)）仍可通过被动扩散或其他未知转运机制进入细胞[3,9,10,32]，使传感器在缺乏MerC的情况下也能检测Hg(II)。重组大肠杆菌BL21(DE3)/pT7lac-IdgS-Sfp中IdgS和Sfp的成功表达及其催化靛蓝素生物合成的能力，凸显了这些酶在汞生物传感中的应用潜力。观察到的温度依赖性表达和色素产生表明，较低温度（如30°C）最适合靛蓝素合成，这可能是由于NRPS酶稳定性增强和靛蓝素氧化降解减少。这与先前表明靛蓝素生物合成对环境条件敏感的研究一致[22,33,34]。
我们的结果还表明，虽然T7lac启动子驱动IdgS和Sfp的高水平表达，但强转录活性可能对细胞施加代谢压力，导致色素表达较弱。相比之下，Hg(II)响应启动子Pmer即使在较低蛋白水平下也能促进靛蓝素合成所需酶的适度且充足的表达。先前研究表明，使用其他色素报告系统（如紫色杆菌素和类胡萝卜素）时，弱金属响应启动子通常比强T7lac启动子诱导更强的色素信号[18,35]。这表明表达水平、催化条件和细胞代谢状态之间的平衡对于高效色素生产至关重要。
因此，我们的发现强调了开发基于色素的全细胞生物传感器的关键原则：最佳诱导策略本质上与启动子的选择相关。强T7lac启动子尽管蛋白表达强劲，却未能产生显著的靛蓝素，表明代谢负担可超越表达水平的影响。相比之下，经优化的汞响应Pmer启动子系统所取得的成功证明，天然金属诱导启动子提供了更合适的基础。其适中的强度和与细胞应激反应的内在偶联，似乎将宿主细胞的生理状态维持在适合复杂次级代谢产物生产的窗口内。因此，对于环境重金属检测，未来可视化生物传感器的优化应优先考虑特定金属响应启动子的工程化和适配，而非试图强行适配不相容的过强组成型或诱导型系统。
【数据】IPTG浓度：0.5 mM；蛋白条带：约26.1 kDa（Sfp）和140.9 kDa（IdgS）；Hg(II)诱导浓度：625 nM；诱导时间：8 h；温度：30、34、37°C；色素积累：37°C下检测不到
3.2 温度对生物传感的影响
重组大肠杆菌BL21(DE3)/pT7lac-IdgS-Sfp在30°C、34°C和37°C下用0.5 mM IPTG诱导0–9小时。如图S1所示，所有温度下细菌密度在8小时内持续增加。然而，34°C和37°C下未观察到色素积累。在30°C下经IPTG诱导，上清液在596 nm处的吸光度（A596）略有增加，但微弱的色素积累肉眼不可见。基于商业pET-21a质粒，我们如上所述构建了IdgS和Sfp的IPTG诱导表达质粒。遗憾的是，尽管IdgS和Sfp在三种温度下均有表达（图1C），IPTG诱导下靛蓝素的合成和积累均不理想。
随后，我们组装了基于增敏设计pCon-IND-C质粒的Hg(II)响应传感器TOP10/pCon-IND-C（图2A）。当TOP10/pCon-IND-C传感器在30°C、34°C和37°C下暴露于625 nM Hg(II)时，37°C下培养4小时后的细菌密度显著高于30°C和34°C（P < 0.05），并随时间持续增加（图2B）。34°C和37°C的培养物在1小时内略微变蓝。然而，随着诱导时间延长，未观察到蓝色进一步加深（图2C）。
从培养上清液靛蓝素信号A596的变化来看（图2D），34°C和37°C下Hg(II)诱导的色素信号较弱。此外，在37°C下，A596在培养2小时后开始波动下降，伴随上清液逐渐变黄（图2E）。如文献先前报道，靛蓝素具有强还原性，其氧化变黄过程在较高温度下加速[22,36]。
有趣的是，在30°C下，Hg(II)诱导产生的蓝色素在细菌培养物（图2C）和上清液（图2E）中均非常明显。而且，随着Hg(II)暴露时间的延长，色素信号持续增强（图2D）。在9小时观察结束时，上清液中未观察到变黄现象（图2E）。尽管色素信号在4小时后仍在增加，但4小时诱导后产生的蓝色素强度已足以满足肉眼检查和可见光分光光度法检测。由于需要加快结果输出且4小时时的色素强度已令人满意，我们确定未来汞传感实验的最佳诱导条件为30°C下4小时。但如果需要更强的色素信号，未来研究可延长诱导时间。
如图1所示，在三种温度下经IPTG诱导，强T7lac启动子均导致SDS-PAGE中可检测到IdgS和Sfp的表达。同样，在37°C下经Hg(II)诱导，SDS-PAGE也观察到IdgS和Sfp的表达。然而，在这些条件下均未检测到显著的靛蓝素合成或积累（图S1和图2）。温度优化实验表明，虽然较高温度（37°C）促进细菌生长，但靛蓝素的最佳产量出现在30°C。这一发现表明温度显著影响酶活性和色素稳定性。较高温度下色素产量降低可能归因于靛蓝素的加速氧化降解——靛蓝素极易被氧化[37,38]。将生物传感器维持在30°C可确保细菌生长和色素稳定性之间的平衡，增强Hg(II)检测的灵敏度和可靠性。
【数据】IPTG浓度：0.5 mM；Hg(II)诱导浓度：625 nM；温度：30、34、37°C；时间：0–9 h；37°C下4 h菌密度显著高于30°C和34°C（P < 0.05）；37°C下A596在2 h后波动下降；最佳诱导条件：30°C、4 h
3.3 三种传感器的剂量-响应与定量分析
（此部分原文节选未完整提供，根据图表清单和上下文推断包含剂量-响应曲线和回归分析内容）
【数据】原文未详述
3.4 金属离子选择性与抗干扰性能
【数据】原文未详述
3.5 环境水基质中汞检测的验证
【数据】原文未详述
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究利用IdgS-Sfp系统生物合成靛蓝素作为可视化报告系统，开发了高灵敏、高选择性的Hg(II)全细胞生物传感器。基因电路设计——特别是引入MerC转运蛋白——显著增强了传感器性能，实现了0.08 nM的低检测限和2.44–156.25 nM的宽定量范围。传感器表现出高选择性和抗干扰能力，在多种金属离子共存时仅响应Hg(II)。其在包括淡水和海水在内的多种环境水基质中的稳健性，凸显了其广泛适用性和实际环境监测潜力。靛蓝素色素提供的无背景信号和清晰视觉读数进一步增强了传感器的可靠性和易用性。这些特性使其特别适合需要快速、简便检测的现场应用。未来工作将优化遗传组件和调控元件，以改善生物传感器的动态范围和稳健性。
编译者解读
该研究以水溶性靛蓝素替代传统脂溶性色素作为报告信号，巧妙规避了有机溶剂提取步骤，这是合成生物学报告系统设计中的务实改进。引入MerC汞转运蛋白增强底物摄取、采用解偶联电路优化调控架构，体现了"从天然元件到工程优化"的典型合成生物学改造逻辑。30°C下4小时的最佳诱导条件兼顾了酶活性与色素稳定性，说明该团队注重实际应用的可靠性。局限在于当前传感器仍依赖实验室常用的大肠杆菌宿主，向真实环境样本的原位监测过渡尚需进一步验证。未来若能将此报告模块移植至环境耐受性更强的宿主菌株，或可拓展其现场部署能力。
DOI: 10.1016/j.microc.2025.116100