来源：Reprogramming lipid metabolism and morphology engineering in Yarrowia lipolytica for algae-free, high-titer production of esterified astaxanthin（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
虾青素酯因优异的稳定性和生物利用度在化妆品、营养保健品和水产养殖领域备受青睐，但工业供给高度依赖雨生红球藻培养，受制于地理和气候条件。本研究在解脂耶氏酵母中开发了首套系统的代谢工程策略，鉴定出裂殖壶菌来源的二酰甘油酰基转移酶ScDGAT2-1兼具虾青素酯化与三酰甘油合成功能，通过脂质代谢重编程、酶亚细胞定位优化及形态工程改造，最终在5-L生物反应器中实现1137.2 mg/L虾青素酯和1613.5 mg/L总虾青素产量，创下异源虾青素酯生产的最高滴度记录。
研究背景
虾青素因其强抗氧化能力被广泛用于护肤和保健产品，其抗氧化活性是维生素E的100–500倍。虾青素在C3和C3'位含有不对称中心，其中3S,3'S构型生物利用度最高。虾青素还以酯化和非酯化形式存在——酯化虾青素在清除活性氧和缓解氧化应激方面优于游离形式，具有更优的热稳定性和光稳定性，且肠道吸收和生物利用度更高。从工业角度看，酯化虾青素的热稳定性和氧化稳定性可减少干燥、提取等严苛下游操作及长期储存中的降解损失，简化制剂要求并减少对复杂包封策略的依赖。目前商业化的天然虾青素主要来源为雨生红球藻（主要产酯化虾青素）和法夫酵母（仅合成游离形式），但藻类培养受限于特定地理和气候条件，亟需开发不依赖藻类的高效微生物生产平台。
研究方法
2.1 质粒与菌株构建
本研究所用全部质粒和引物分别列于补充表S1和S2，详细的质粒与菌株构建过程见补充材料。转化子在生长3–5天后通过菌落PCR验证，模板使用MightyPrep DNA试剂（Takara Biomedical Technology (Beijing) Co. Ltd.）制备。采用Cre-loxP系统回收营养标记——Cre质粒转化后在5-FOA平板上涂布筛选。
【数据】菌株生长时间：3–5天；筛选平板：5-FOA平板
2.2 DNA操作
异源基因经密码子优化后由北京擎科生物科技有限公司合成。异源基因的核苷酸序列可从以下数据库条目获取：SlXES（XM_004230093）、IoXES（LC335777）、TeXES（LC335776）、HpDGAT1（MN561784）。SlXES、IoXES和TeXES的N端截短氨基酸数分别为47、31和54个。ScDGAT2-1的全长序列列于表S3。质粒提取使用质粒提取试剂盒（广州迈基生物科技有限公司）。所有DNA片段使用TransStart® FastPfu Fly DNA聚合酶（全式金生物科技有限公司）扩增，菌落PCR使用2× Rapid Taq master mix（南京诺唯赞生物科技有限公司）。构建质粒所用的限制性内切酶购自Thermo Fisher Scientific。质粒组装使用ClonExpress Ultra一步克隆试剂盒V2（诺唯赞）进行Gibson assembly。测序由北京杰里生物科技有限公司完成。
【数据】截短氨基酸数：SlXES 47个、IoXES 31个、TeXES 54个
2.3 菌株与培养条件
本研究所用工程菌株列于表1。含0.01%亮氨酸或尿嘧啶的YNB平板及含0.08%潮霉素B的YPD平板用于阳性克隆分离和CRISPR/Cas9基因组编辑转化子筛选。酵母菌落PCR验证后，含ura3标记的供体质粒在含2 g/L 5-FOA的YPD平板上消除；含leu2标记的gRNA质粒在YPD平板上消除。含0.1 g/L尿嘧啶的YNB平板用于pINA1312介导的随机整合筛选，含0.1 g/L亮氨酸的YNB平板用于pINA1269介导的随机整合筛选，含500 μg/mL潮霉素B的YPD平板用于pUB4-CRE介导的ura3标记回收。酵母细胞在30°C下培养于YPD培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）或YNB培养基（0.67%无氨基酸酵母氮碱、2%葡萄糖）中。化学感受态大肠杆菌JM109用于克隆和质粒增殖，在37°C下培养于Luria–Bertani培养基（5 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物）中，根据需要添加100 μg/mL氨苄青霉素或50 μg/mL卡那霉素。
【数据】YPD培养基：1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖；YNB培养基：0.67%酵母氮碱、2%葡萄糖；培养温度：30°C（酵母）/37°C（大肠杆菌）；潮霉素B浓度：0.08%（平板）/500 μg/mL（YPD平板）；5-FOA浓度：2 g/L；LB培养基：5 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物；氨苄青霉素：100 μg/mL；卡那霉素：50 μg/mL
2.4 类胡萝卜素提取与定量
类胡萝卜素通过低温研磨仪配合丙酮破碎酵母细胞提取。在2-mL EP管中加入约0.1 g氧化锆珠、25 μL发酵液和975 μL丙酮，于−20°C下研磨。细胞破碎采用5个循环的研磨（每循环30秒研磨后暂停2分钟）。上清经离心收集、过滤后，酯化虾青素使用LC-MS定性分析——UPLC（Ultimate 3000，Thermo Fisher Scientific）耦联质谱仪（Q-Exactive，Thermo Fisher Scientific），参照已报道方案。类胡萝卜素定量采用高效液相色谱（HPLC），流动相为洗脱液A（甲醇/1%磷酸水溶液，92:8）和洗脱液B（100%甲基叔丁基醚）。HPLC流速1 mL/min，梯度洗脱程序：0–15 min，15%–30%洗脱液A；15–23 min，30%–80%洗脱液A；23–27 min，80%洗脱液A；27–30 min，80%–15%洗脱液A；30–35 min，15%洗脱液A。色谱柱为YMC C30柱（250 mm × 4.6 mm内径，5-μm粒径）。报道的酯化虾青素滴度指酯化组分中虾青素部分的质量，以游离虾青素当量表示。因此，酯化虾青素通过酶促水解后测定虾青素含量来确定。酶促水解方法参照前期报道。酯化虾青素计算公式为：X_E = X_2 − X_1 × A_E，其中X_E为酯化虾青素滴度，X_2为酶促水解后游离虾青素滴度，X_1为酶促水解前游离虾青素滴度。为校正酶促水解过程中游离虾青素的降解和损失，在公式中引入游离虾青素标准品的回收系数A_E——将游离虾青素标准溶液经相同酶促水解过程处理，计算其残留峰面积比值。分析设三个平行反应。实验可靠性验证见图S1和表S4。虾青素酯标准品购自US Pharmacopeia（USP），其他标准品（角黄素、海胆酮、β-胡萝卜素）购自上海源叶生物科技有限公司。混合标准品色谱图见图S2。
【数据】研磨温度：−20°C；研磨循环：5个循环（30秒研磨+2分钟暂停）；HPLC流速：1 mL/min；色谱柱：YMC C30（250 mm × 4.6 mm，5-μm）；提取体系：25 μL发酵液 + 975 μL丙酮 + 0.1 g氧化锆珠
2.5 葡萄糖、TAG和DCW定量
葡萄糖采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定——样品或葡萄糖标准溶液与等体积DNS试剂混合，煮沸5分钟，用分光光度计在540 nm处测量吸光度进行定量。三酰甘油（TAG）使用TAG检测试剂盒（Biosharp）定量。细胞干重（DCW）测定：将1 mL发酵液转移至预先称重的EP管中，离心后弃去上清，沉淀在105°C下干燥2天后称重。
【数据】DNS法：煮沸5分钟，检测波长540 nm；DCW干燥条件：105°C、2天；样品量：1 mL发酵液
2.6 RT-qPCR
RT-qPCR工作流程、计算及ACT1作为参考基因的选择均参照前期描述进行。总RNA使用BGMG Fast RNAex Kit（宝光生物科技有限公司）通过磁珠法提取。RNA浓度使用NanoDrop 2000紫外分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）测定，纯度通过OD260/OD280比值评估。逆转录和qPCR分别使用StarScript III One-Step RT-PCR Kit和2× RealStar Fast SYBR qPCR Mix（GenStar生物科技有限公司）。热循环条件按技术手册设定，在CFX96 Touch实时PCR检测系统（Bio-Rad Laboratories, Inc.，美国）上进行。qPCR引物列于表S2。所有检测在200 μL qPCR管中进行，每个样品设三个技术重复。
【数据】RNA纯度评估：OD260/OD280比值；技术重复：3个/样品
2.7 脂肪酶活性测定
脂肪酶活性测定参照前期报道。胞内脂肪酶活性测定：100 mg细胞经离心收集（4630 ×g，5分钟，4°C），用蒸馏水和MOPS缓冲液（pH 7.0）洗涤。细胞沉淀重悬于1 mL MOPS缓冲液中，加入0.1 g氧化锆珠。细胞破碎在−20°C下进行，3个循环的30秒研磨，循环间暂停2分钟。裂解液在13,000 ×g、4°C离心5分钟，上清作为粗胞内脂肪酶提取物。脂肪酶活性通过测定对硝基苯基月桂酸酯（pNP-月桂酸酯）的水解来评估。反应体系含0.1 mL酶提取物和1.9 mL底物溶液（560 μM pNP-月桂酸酯溶于50 mM磷酸钾缓冲液，pH 7.0，含1% v/v DMSO）。反应在25°C下用BioMate 3S分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）在410 nm处监测10分钟。
【数据】细胞离心：4630 ×g、5分钟、4°C；破碎温度：−20°C；研磨循环：3个循环（30秒研磨+2分钟暂停）；裂解液离心：13,000 ×g、5分钟、4°C；底物浓度：560 μM pNP-月桂酸酯；缓冲液：50 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0，含1% v/v DMSO）；反应温度：25°C；检测波长：410 nm；监测时间：10分钟
研究结果
3.1 酯化酶筛选与表征
为筛选萜烯酯化的最佳生物催化剂，本研究选取了两类与酯形成反应相关的酶：(i)植物来源的叶黄素酯酶（XES），包括番茄（SlXES）、万寿菊（TeXES）和番薯（IoXES）的叶黄素酯酶；(ii)雨生红球藻（HpDGAT）和裂殖壶菌（ScDGAT2-1）来源的二酰甘油酰基转移酶（DGAT）。系统发育分析（图S3）显示三种植物来源的XES彼此紧密聚类，但与DGAT在进化上距离较远，支持它们属于不同的催化谱系。
为研究各酶对虾青素酯化的活性，将每种酶分别导入前期报道的产虾青素解脂耶氏酵母菌株DN20。由于DeepLoc1.0预测SlXES、TeXES和IoXES含有推定的叶绿体转运肽，因此构建并测试了全长和N端截短两种变体，以减轻酵母中潜在的错误定位和折叠限制。如图2a所示，仅含ScDGAT2-1的菌株YAE1表现出显著的虾青素酯化活性，与前期发现一致。菌株YAE1产33.7 mg/L酯化虾青素（1.89 mg/g DCW），占总虾青素的38.4%。据作者所知，这是微生物细胞工厂中报道的最高酯化虾青素滴度和含量。
这一结论通过比较体外酶促水解前后类胡萝卜素提取物的色谱图得到进一步支持（图2b）。菌株YA1的提取物在水解后略有下降，归因于样品处理及体外反应过程中的不可避免损失。相比之下，YAE1提取物水解后游离虾青素的峰面积显著增加，表明酯化虾青素被定量转化为游离形式。值得注意的是，ScDGAT2-1的表达还使总虾青素产量相对于YA1提高了13.9%，而上游类胡萝卜素——红移虾青素（phoenicoxanthin）、角黄素、海胆酮和β-胡萝卜素的峰面积分别下降了27.2%、56.7%、47.5%和37.1%（图S4）。这些趋势表明虾青素酯化可增强通路通量向虾青素方向流动，可能通过改善其溶解性和储存能力实现。
YAE1中虾青素酯的LC-MS分析揭示六种脂肪酸酰基取代基，包括饱和（C16:0、C18:0）、单不饱和（C16:1、C18:1）和多不饱和（C18:2、C18:3）脂肪酸（图S5）。这种酯化模式与解脂耶氏酵母内源脂肪酸谱高度吻合，与前期观察一致。
为深入表征ScDGAT2-1，作者使用AlphaFold2进行同源建模，并使用AutoDock Vina进行分子对接（图S6）。虾青素、红移虾青素和玉米黄质的预测结合亲和力分别为−13.73、−14.927和−14.482 kcal/mol。一般而言，结合能低于−8 kcal/mol被认为可靠，表明三种底物理论上均能与ScDGAT2-1结合。实验上，ScDGAT2-1确实对红移虾青素（比虾青素少一个羟基）表现出酯化活性，产生酯化红移虾青素，其中42.9%以酯化形式存在（图2b–d）。相反，将ScDGAT2-1整合到产玉米黄质菌株YZ1中生成菌株YZE1后，未检测到特征性酯峰（图2e）。综上，ScDGAT2-1的催化活性对含酮基的羟基类胡萝卜素具有底物选择性，且催化酯化严格依赖类胡萝卜素的羰基基团。因此，ScDGAT2-1被鉴定为筛选中最高效的酶，酯化效率达38.4%。
机制上，ScDGAT2-1被预测为膜定位蛋白，而XES为可溶性酶（图S7）。整合膜DGAT相较于可溶性植物XES的优越性能与其天然定位一致——DGAT的膜嵌入活性位点可直接接触亲脂性类胡萝卜素和二酰甘油底物，疏水环境有利于底物分配、结合和产物释放。ScDGAT2-1在解脂耶氏酵母中的出色表现可能源于其与细胞环境的兼容性——裂殖壶菌和解脂耶氏酵母均为具有旺盛脂质代谢的产油微生物，解脂耶氏酵母的内质网可能为ScDGAT2-1提供有利的膜环境、辅因子和理化条件。相反，植物来源XES的活性可能受限于酵母中不理想的蛋白质折叠或辅因子不兼容性。
3.2 脂质代谢重编程增强酯化虾青素生产
通过ScDGAT2-1过表达来提高酯化虾青素产量的尝试产生了出乎意料的结果。额外添加一个基因拷贝（菌株YAE2）使酯化虾青素产量从1.89 mg/g DCW（33.7 mg/L）降至0.88 mg/g DCW（16.4 mg/L），三个拷贝时（菌株YAE3）进一步降至0.42 mg/g DCW（7.9 mg/L）（图3a）。相反，DCW从17.8 g/L（YAE1）增加至18.6 g/L（YAE2）和19.2 g/L（YAE3）（图3b）。
由于ScDGAT2-1作为双功能二酰甘油酰基转移酶，可能在解脂耶氏酵母中催化TAG合成。对菌株YAE1–3的TAG含量分析证实，TAG含量随ScDGAT2-1拷贝数增加而比例增加（图3b）。这种行为与底物丰度效应一致：解脂耶氏酵母中DAG和酰基-CoA的浓度远高于游离虾青素，当ScDGAT2-1过表达时，TAG合成在动力学上更受青睐。过量ScDGAT2-1表达将酰基供体库（酰基-CoA）从虾青素酯化方向重新分配。因此，酯化虾青素的形成与脂质代谢内在耦联，因为两个过程竞争重叠的酰基-CoA并共享相同的疏水胞内环境。
虽然TAG积累被认为是增加解脂耶氏酵母中游离虾青素合成的有效手段，但过量TAG将碳通量导向细胞生长，进一步阻碍了总虾青素的生物合成。为重新平衡脂质-类胡萝卜素通量，作者通过删除内源二酰甘油酰基转移酶基因DGA1（菌株YAE4）或过表达胞内脂肪酶基因TGL4（菌株YAE5）来重编程内源脂质代谢。如图3c所示，DGA1缺失使酯化虾青素产量提高至2.61 mg/g DCW和34.4 mg/L，相比亲本菌株YAE1分别提高38.1%和2.1%。这表明DGA1敲除可能减少了竞争性内源TAG合成，缓解了酰基供体汇，保留酰基-CoA用于类胡萝卜素酯化，从而提高酯化虾青素产量。然而，TGL4过表达未达到预期效果，菌株YAE5中酯化虾青素产量显著降至0.21 mg/g DCW和3.7 mg/L。有趣的是，菌株YAE5的总虾青素产量保持不变，因为游离虾青素产量增加至4.16 mg/g DCW（73.7 mg/L），强烈表明TGL4参与了酯化虾青素的水解。
讨论与解读
本研究系统性地在解脂耶氏酵母中建立了异源酯化虾青素合成平台。裂殖壶菌来源的二酰甘油酰基转移酶ScDGAT2-1能酯化红移虾青素和虾青素但不能酯化玉米黄质，表明其催化严格依赖羰基官能团。转化ScDGAT2-1的菌株YAE1产33.7 mg/L酯化虾青素。但进一步增加ScDGAT2-1拷贝数将碳通量导向TAG而非酯化虾青素，表现为DCW增加而酯化虾青素产量下降。删除DGA1和PAH1基因将碳通量重新导向酯化虾青素并释放乙酰-CoA用于类胡萝卜素生物合成，使酯化虾青素产量提高至40.5 mg/L。将ScDGAT2-1靶向脂滴减少了中间产物积累，增强了产物分配。MHY1敲除增强了某些发酵特性并稳定了酯化虾青素积累，其缺失提高了整体类胡萝卜素合成，表明形态工程对发酵过程的有益影响。这是首次在解脂耶氏酵母中进行异源酯化虾青素合成的系统性代谢工程研究。
编译者解读
该研究最值得借鉴之处在于揭示了酯化虾青素合成与脂质代谢的内在耦联关系——ScDGAT2-1的双功能特性既是优势也是瓶颈，单纯过表达反而因底物竞争而适得其反。通过删除内源DGA1和PAH1来"疏导"而非"堵塞"脂质通量，体现了代谢工程中平衡思维的价值。将酶靶向脂滴实现空间解耦联的策略尤具巧思，为其他亲脂性天然产物的酯化修饰提供了可迁移的设计范式。5-L发酵验证的1137.2 mg/L酯化虾青素滴度标志着该平台已具备工业转化潜力，但藻源生产在成本上仍有优势，未来需在发酵工艺放大和提取纯化环节持续验证经济可行性。
DOI: 10.1016/j.cej.2026.174273