来源：Efficient production of Ergothioneine via an optimized allogenous assembly of the ERG synthesis pathway in Escherichia coli BL21（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
麦角硫因（ERG）是一种强效抗氧化剂，在食品、化妆品和医药领域应用广泛，但天然提取和化学合成成本高、产量低。本研究从粗糙脉孢菌、嗜热绿曲菌和耻垢分枝杆菌中筛选关键酶基因，通过截短改造、融合蛋白连接肽优化和半理性突变，在大肠杆菌BL21(DE3)中成功构建异源ERG生物合成途径。摇瓶产量从初始87.02 mg/L提升至478.79 mg/L，5升生物反应器中经53小时补料分批发酵产量达790 mg/L，生产强度14.9 mg/L/h。
研究背景
麦角硫因（ERG），又称2-巯基组氨酸三甲基甜菜碱，于1909年首次从小麦中的麦角菌中分离发现。作为一种重要的生理活性化合物，ERG凭借其强抗氧化性及抗炎、抗衰老、神经保护和氧化应激预防等多种生物功能，被广泛应用于食品、化妆品、医药等领域。ERG在自然界中主要由特定细菌和真菌合成，植物、动物和人类自身无法合成，是一种珍稀的天然手性氨基酸。目前，ERG的提取和化学合成面临产量低、成本高的瓶颈，难以满足市场需求，因此开发工程菌株与微生物发酵技术成为解决这一难题的关键方向。迄今已报道四种ERG生物合成途径，均以L-组氨酸、L-半胱氨酸和L-甲硫氨酸为前体，其中研究最深入的是细菌途径和真菌途径。
研究方法
2.1 菌株、质粒与引物
所有工程质粒和菌株详见Supporting Information 1中Tab. S1和Tab. S2。大肠杆菌DH5α用于分子构建和质粒克隆。大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌株，含有ERG前体氨基酸生物合成的上游模块。本研究所用引物列于Supporting Information 1中Tab. S3。
【数据】菌株：E. coli DH5α、E. coli BL21(DE3)；原文未详述引物序列
2.2 试剂与培养基
限制性内切酶、质粒提取和凝胶纯化试剂盒购自生工生物（上海，中国）。ERG标准品购自阿拉丁生化科技有限公司。L-Cys购自上海毕得医药科技有限公司。L-Met购自上海迈瑞尔化学技术有限公司。L-His购自上海麦克林生化科技有限公司。研究中使用的所有其他化学品均为分析级并可商业获得。引物和DNA合成及测序由生工生物（上海，中国）完成。
【数据】试剂来源：生工生物、阿拉丁、毕得、迈瑞尔、麦克林
2.3 培养基与培养条件
LB培养基（Lysogeny broth）包含5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨和10 g/L NaCl，用于种子繁殖和补料实验。
摇瓶种子液制备：将保存在甘油中的工程大肠杆菌菌株划线于固体LB培养基上，37°C过夜培养。随后，将单个菌落接种到5 mL含100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37°C、220 rpm培养10小时。
发酵培养基包含12 g/L胰蛋白胨、3 g/L NaCl、24 g/L酵母提取物、5 g/L MgSO₄·7H₂O、2 g/L K₂HPO₄、0.06 g/L柠檬酸铁铵（AFC）、30 mL/L甘油、1 g/L L-Cys、1 g/L L-His和1 g/L L-Met，用于摇瓶实验中ERG的从头合成。所有生化试剂均购自商业供应商。必要时，使用50 μg/mL氨苄青霉素筛选重组质粒。
【数据】LB培养基：5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl；种子培养：100 μg/mL氨苄青霉素、37°C、10 h、220 rpm；发酵培养基：12 g/L胰蛋白胨、3 g/L NaCl、24 g/L酵母提取物、5 g/L MgSO₄·7H₂O、2 g/L K₂HPO₄、0.06 g/L AFC、30 mL/L甘油、1 g/L L-Cys、1 g/L L-His、1 g/L L-Met
2.4 质粒构建
通过系统挖掘和检索NCBI数据库，鉴定出ERG生物合成途径中编码关键功能酶的基因序列。NcEgt1基因（NCBI参考序列：XP_956324.3）在第358位（甲硫氨酸残基）处进行截短，获得命名为NcEgt1–1的修饰序列，其N端保留完整的甲基转移酶结构域。同时选取两个功能性基因序列：来自嗜热绿曲菌的CtEgtB（NCBI参考序列：WP_014099806.1），编码亚砜合酶；以及来自耻垢分枝杆菌的MsEgtE（NCBI参考序列：WP_011731155.1），具有PLP依赖的C-S裂解酶活性。这些序列经密码子优化后，由通用生物（安徽，中国）分别克隆到pETDuet-1载体中。
NcEgt1–1的C端结构域通过直接连接与CtEgtB的N端区域框内融合，产生嵌合基因构建体。该融合表达盒随后克隆到经EcoR I/Afl II酶切的pETDuet-1载体中，获得重组质粒pETDuet-1-T7-NcEgt1–1-CtEgtB。随后，将MsEgtE编码序列插入线性化pETDuet-1-T7-NcEgt1–1-CtEgtB骨架的Bgl II/Xho I限制性位点，得到最终构建体pETDuet-1-T7-NcEgt1–1-CtEgtB-T7-MsEgtE。
通过全质粒PCR将连接肽插入NcEgt1–1和CtEgtB基因之间。具体而言，设计了带有CtEgtB同源臂的EAAAK上游引物（CtEgtB-EAAAK-F）和带有NcEgt1–1同源臂的EAAAK下游引物（NcEgt1–1-EAAAK-R）。这些引物随后通过全质粒PCR连接到环形质粒pETDuet-1-T7-NcEgt1–1-CtEgtB-T7-MsEgtE上，构建出pETDuet-1-T7-NcEgt1–1-(EAAAK)-CtEgtB-T7-MsEgtE。本研究中的其他连接肽质粒采用相同方法构建。
设计点突变引物，以3 μL pETDuet-1-T7-NcEgt1–1-CtEgtB-T7-MsEgtE为模板，使用KOD One™ PCR Master Mix（TOYOBO）进行全质粒PCR。随后，PCR产物用1 μL DpnI（BBI Speedy Cut）消化以去除模板。构建的质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，所得菌株用于蛋白表达或ERG生产。
【数据】NcEgt1截短位置：第358位（Met）；限制性位点：EcoR I/Afl II、Bgl II/Xho I；PCR模板量：3 μL；DpnI用量：1 μL；工具酶品牌：KOD One™ PCR Master Mix（TOYOBO）、DpnI（BBI Speedy Cut）
2.5 NcEgt1–1预测模型及NcEgt1–1和CtEgtB的热点残基预测
使用MEGA11和ESPript 3.0网站（https://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）对MsEgtD（NCBI参考序列：WP_011731156.1）、SpEgt1–1、PoEgt1–1和NcEgt1–1进行序列比对。具体而言，来自粟酒裂殖酵母的双功能酶SpEgt1（NCBI参考序列：NP_596639.2）和来自稻瘟病菌的PoEgt1（NCBI参考序列：XP_003711933.1）分别在第331位和第404位截短，获得含甲基转移酶结构域的SpEgt1–1和PoEgt1–1。
NcEgt1–1模型使用Swiss-Model（https://swissmodel.expasy.org/）生成，Model ID为AF-F7VRW9-F1。NcEgt1–1和CtEgtB的"热点"残基使用HotSpot Wizard网站（https://loschmidt.chemi.muni.cz/hotspotWizard/）预测。所有模型均使用PyMOL 2.5.0进行可视化。
【数据】序列比对工具：MEGA11、ESPript 3.0；SpEgt1截短位点：331；PoEgt1截短位点：404；建模工具：Swiss-Model；热点预测：HotSpot Wizard；可视化：PyMOL 2.5.0
2.6 ERG生产
将能够合成ERG的细菌接种到5 mL含氨苄青霉素（100 μg/mL）的LB液体培养基中，37°C培养10小时。随后，以2%接种量将25 mL培养基转移至250 mL锥形瓶中，37°C培养2.5小时。然后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.2 mM。细菌在20°C下继续发酵48小时。甘油单独灭菌，接种前加入培养基中。使用高效液相色谱（HPLC）测定ERG浓度。
【数据】种子培养：5 mL LB + 100 μg/mL氨苄青霉素、37°C、10 h；接种量：2%；摇瓶体积：25 mL/250 mL；诱导前培养：37°C、2.5 h；IPTG浓度：0.2 mM；发酵条件：20°C、48 h
2.7 分析方法
使用紫外-可见分光光度计测量细胞密度，以OD600值表示。为准确测定ERG含量，在48小时后收集发酵培养液。取1 mL发酵培养液置于1.5 mL Eppendorf管中，12,000 ×g离心10分钟，取50 μL上清液稀释20倍。最终上清液经0.22 μm滤膜过滤。样品使用SHIMADZU SPD-20A HPLC系统分析，配备Waters Symmetry® 5 μm C18色谱柱（250 × 4.6 mm），检测波长设定为257 nm。
发酵产生的代谢物使用梯度洗脱程序洗脱。具体而言，以水（溶剂A）和纯乙腈（溶剂B）作为洗脱液，流速为0.7 mL/min。洗脱程序如下：100% A（0–4分钟），100% B（4–20分钟），100% A（20–35分钟）。ERG标准品溶解于纯水中制备标准曲线。
【数据】离心：12,000 ×g、10 min；上清液用量：50 μL；稀释倍数：20倍；滤膜：0.22 μm；HPLC系统：SHIMADZU SPD-20A；色谱柱：Waters Symmetry® 5 μm C18 (250 × 4.6 mm)；检测波长：257 nm；流速：0.7 mL/min；洗脱程序：100% A (0–4 min)、100% B (4–20 min)、100% A (20–35 min)
2.8 补料分批发酵种子液制备
将一级种子液以2%浓度转移至含100 μg/mL氨苄青霉素的250 mL锥形瓶中，37°C、220 rpm振荡培养10小时，获得发酵种子液。将种子培养物以10%浓度转入含2 L培养基的5 L生物反应器中进行补料分批发酵。温度控制在37°C，通气量维持在2 L/min。使用25%氨水将发酵液pH自动维持在约7.0。通过调节搅拌速度和通气量将发酵液中的溶解氧水平调整至约35%。当OD600值达到25且温度降至20°C时，向发酵液中加入IPTG（0.2 mM）。发酵过程中逐步添加400 g/L葡萄糖溶液以向微生物补充营养。
【数据】接种量：10%；反应器：5 L生物反应器含2 L培养基；温度：37°C；通气量：2 L/min；pH：约7.0（25%氨水调节）；溶解氧：约35%；诱导条件：OD600 = 25、20°C、IPTG 0.2 mM；补料：400 g/L葡萄糖溶液
研究结果
3.1 ERG生产菌株的构建
融合酶通过在基因或蛋白质水平上将多种酶串联而成，形成能够驱动级联反应的多功能单分子催化剂。与单个酶相比，这种无支架策略通过最小化生物催化模块之间的空间距离来增强催化活性，能够快速捕获反应中间体，同时通过底物通道效应防止其中间体的分解和扩散，从而加速整体反应动力学。例如，在香叶醇生产中，法尼基二磷酸合酶（FPPS）和橙花叔醇合酶（NES）的融合显著提高了香叶醇产量。
在本研究中，我们实现了NcEgt1–1和CtEgtB的直接融合，NcEgt1–1与CtEgtB之间的紧密相互作用最小化了它们的物理距离，增强了生物合成途径的效率，从而促进了它们的催化活性。这种紧密耦合尤为关键，因为这两种酶都参与了生物合成途径的关键步骤，受益于优化后的酶间相互作用。相比之下，催化途径最后一步的MsEgtE未与其他酶融合，而是单独表达，以确保Cys-HER完全转化为ERG而不受前步反应的干扰。
NcEgt1是一种双功能酶，兼具甲基转移酶和亚砜合酶活性。研究表明，NcEgt1因其分子量大、表达水平低而影响ERG合成。因此，本研究将NcEgt1在第358位氨基酸（Met）处截短，产生含完整推定甲基转移酶结构域的C端截短蛋白NcEgt1–1。CtEgtB作为亚砜合酶，将HER和L-Cys转化为Cys-HER。最后，MsEgtE作为PLP依赖的C-S裂解酶，将Cys-HER转化为产物ERG（图1A）。
为构建能够合成ERG的重组菌株，将NcEgt1–1/CtEgtB和MsEgtE基因克隆到pETDuet-1载体中，随后转化至大肠杆菌BL21(DE3)。NcEgt1–1/CtEgtB和MsEgtE的转录由独立的T7启动子控制（图1B）。SDS-PAGE分析显示，密码子优化的NcEgt1–1/CtEgtB和MsEgtE操纵子在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达。89 kDa和39 kDa位置的电泳条带分别代表NcEgt1–1/CtEgtB和MsEgtE的表达产物，与理论值一致。这些结果表明T7启动子可有效驱动NcEgt1–1/CtEgtB和MsEgtE操纵子的表达（图1C）。
随后，摇瓶发酵证明ERG在大肠杆菌BL21(DE3)中成功异源合成（图1D），培养48小时后达到87.02 mg/L（图1E）。尽管通过微生物发酵获得的ERG产量和产率不高，但外源酶的组装路线对ERG生产而言是成功且合理的。
【数据】ERG产量：87.02 mg/L（48 h）；蛋白条带：89 kDa（NcEgt1–1/CtEgtB）、39 kDa（MsEgtE）；启动子：T7
3.2 通过引入柔性或刚性连接肽优化NcEgt1–1/CtEgtB融合蛋白表达模块
融合酶技术已成功应用于异源合成途径的构建，研究表明其能显著提高异源合成化合物的产量。Chen等人观察到，在二酮辅酶A合酶和姜黄素合酶融合酶之间引入(GGGGS)₃连接肽后，姜黄素产量大幅增加，72小时内达到26.8 ± 0.6 mg/L。Pei等人报道，在重组菌株中使用刚性连接肽（TPTP和EAAAK）可使山柰酚产量显著提高124%。已有研究表明，插入连接肽有助于减少中间体积累并促进产物合成。
为进一步提高NcEgt1–1/CtEgtB的催化效率，使用三种最广泛应用的连接肽序列(GGGGS)n、(EAAAK)n和(TPTP)n构建了九种融合酶，其中连接肽长度通过改变拷贝数"n"来调节（图2）。
结果表明，在NcEgt1–1和CtEgtB两种酶之间引入连接肽通常会导致ERG产量增加。值得注意的是，引入EAAAK刚性连接肽的E1-L1在48小时时ERG产量达到144.06 ± 0.8 mg/L（图2C），是E1的1.65倍。此外，引入(GGGGS)₃柔性连接肽的E1-L9在48小时时ERG产量达到123.6 ± 0.5 mg/L（图2C），是E1（对照组）的1.47倍。
上述发现表明，连接肽整合是提高ERG产量的可行方法，与先前研究结果一致，但功能性连接肽种类有所不同。这种差异可能源于刚性和柔性连接肽在结构和功能上的显著差异，从而导致对异源生物合成效率的调节具有情境依赖性。刚性连接肽可能通过实现酶间底物通道或促进活性位点紧密靠近来增强蛋白质-蛋白质相互作用，从而增强单个酶的催化活性并促进重组菌株中的ERG生物合成。相比之下，柔性连接肽在确保酶稳定性和功能性方面效果有限，导致其对ERG产量的提升不如EAAAK等刚性连接肽显著。
【数据】E1-L1（EAAAK刚性连接肽）ERG产量：144.06 ± 0.8 mg/L（48 h），为E1的1.65倍；E1-L9（(GGGGS)₃柔性连接肽）ERG产量：123.6 ± 0.5 mg/L（48 h），为E1的1.47倍
3.3 通过甲基转移酶NcEgt1–1的改造提高ERG产量
为鉴定NcEgt1–1催化功能的关键残基，将NcEgt1–1的序列与MsEgtD（来自耻垢分枝杆菌的甲基转移酶）、PoEgt1–1（来自稻瘟病菌的甲基转移酶）和SpEgt1–1（来自粟酒裂殖酵母的甲基转移酶）进行比对。比较结果显示，NcEgt1–1与细菌MsEgtD的同源性为22.6%，与PoEgt1–1为53.3%，与SpEgt1–1为31.5%。NcEgt1–1的底物结合位点高度保守，表明NcEgt1–1和MsEgtD的活性位点具有高度相似性（图3A）。只有第173位的天冬氨酸、第174位的苯丙氨酸和第316位的谷氨酰胺表现出非保守特征。
使用Pymol显示，NcEgt1–1的第173、174和316位氨基酸位于活性口袋通道附近。将这三种氨基酸突变为与MsEgtD的活性氨基酸一致，可增加NcEgt1–1的组胺甲基转移酶活性倾向（图3B）。
为提高ERG产量，将T173D、Y174F和Q316V突变分别引入大肠杆菌BL21(DE3)的E1中，获得组合突变菌株M1、M2和M3。值得注意的是，在三种突变中，M2和M3的ERG产量较E1提高了58.8%–60%（图3C）。
使用AutoDock Vina进行分子对接，并在Discovery Studio中分析野生型（WT）和突变体与底物的对接结果，以检查复合物中配体与受体蛋白之间的相互作用。与L-His对接时，WT和突变体的结合能均为−5.0 kcal/mol。与SAM对接时，WT和突变体Q316V、T173D、Y174F的结合能分别为−6.5 kcal/mol、−6.4 kcal/mol、−6.5 kcal/mol和−6.3 kcal/mol。
【数据】同源性：NcEgt1–1与MsEgtD 22.6%、与PoEgt1–1 53.3%、与SpEgt1–1 31.5%；突变菌株M2和M3的ERG产量较E1提高58.8%–60%；L-His对接结合能：−5.0 kcal/mol（WT及突变体）；SAM对接结合能：WT −6.5 kcal/mol、Q316V −6.4 kcal/mol、T173D −6.5 kcal/mol、Y174F −6.3 kcal/mol
3.4 基于T173D和Y174F突变体进一步改造NcEgt1–1酶以提升ERG产量
基于上述结果，以T173D和Y174F为模板进行进一步的半理性改造。使用Hotspot Wizard网站预测NcEgt1–1的六个催化热点（图5A）。基于T173D突变体，衍生出11个突变体；基于Y174F突变体，同样衍生出11个突变体。摇瓶发酵结果显示，M3–02（携带T173D/Y174F双突变）的ERG产量最高，达到325 mg/L（图5B）。这一结果与分子对接分析一致——T173D和Y174F突变的组合可能通过优化底物通道和增强SAM结合来协同提升催化效率。
【数据】M3–02（T173D/Y174F）ERG产量：325 mg/L
3.5 突变体Y174F/E51M与底物相互作用的分子对接分析
通过分子对接和二维相互作用图谱分析，解析了NcEgt1–1野生型及突变体Y174F/E51M与底物L-His和SAM的结合模式。图6展示了WT与L-His和SAM的二维相互作用示意图（图6A和6C），以及突变体Y174F/E51M与L-His和SAM的二维相互作用示意图（图6B和6D）。这些相互作用图谱揭示了突变残基如何改变底物结合口袋的化学环境，从而影响催化效率。
【数据】原文未详述具体结合能数值
3.6 通过关键酶CtEgtB的改造提高ERG产量
为进一步提升ERG产量，对途径中第二个关键酶CtEgtB进行了半理性改造。使用Hotspot Wizard网站预测了CtEgtB的催化热点（图7A-B）。对CtEgtB催化热点的所有突变体进行ERG产量测定（图7C）。在第417位点的16个饱和突变体中，P417L突变体的ERG产量最高，达到478 mg/L（图7D）。对P417L突变体的分析进一步确认了该位点对酶活性的重要贡献（图7E）。
【数据】CtEgtB P417L突变体ERG产量：478 mg/L
3.7 CtEgtB野生型与P417L突变体的构象分析
通过分子对接和二维相互作用图谱，比较了CtEgtB野生型和P417L突变体与底物L-Cys的结合模式。图8A展示了CtEgtB野生型与底物L-Cys之间的二维相互作用示意图，图8B展示了CtEgtB P417L突变体与底物L-Cys之间的二维相互作用示意图。构象分析揭示了P417L突变如何通过改变底物结合口袋的几何结构来增强酶与底物的亲和力，从而提升整体催化效率。
【数据】原文未详述具体结合能数值
3.8 突变菌株M3–02和M3–02P417L的补料分批发酵
在5升生物反应器中进行了补料分批发酵实验，以评估工程菌株的ERG生产能力。图9A展示了工程菌株M3–02在5升发酵罐中生产ERG的补料分批发酵过程。图9B展示了工程菌株M3–02P417L在补料分批培养中的ERG产量。M3–02P417L在5升生物反应器中经53小时发酵，ERG产量达到790 mg/L，生产强度为14.9 mg/L/h。
【数据】M3–02P417L：ERG产量790 mg/L（53 h）；生产强度14.9 mg/L/h；反应器：5 L生物反应器
讨论与解读
本研究首次将来自粗糙脉孢菌、嗜热绿曲菌和耻垢分枝杆菌等多个来源的基因整合到大肠杆菌BL21(DE3)中，成功构建了细菌-真菌杂合ERG生物合成途径。通过柔性或刚性连接肽融合优化关键酶NcEgt1–1与CtEgtB之间的相互作用，随后对NcEgt1–1和CtEgtB进行半理性改造以提高其催化效率。这些策略将ERG产量从87.02 mg/L显著提升至478.79 mg/L，增幅达457.1%。分子对接研究和活性位点预测阐明了关键酶催化效率提升的机制，为ERG产量增加提供了理论依据。最终，在5升生物反应器中进行53小时补料分批发酵，ERG产量达到790 mg/L，生产强度为14.9 mg/L/h。
编译者解读：该研究展示了典型的合成生物学"设计-构建-测试-学习"循环——从途径设计、模块优化到酶工程改造，每一步都有清晰的数据支撑。截短双功能酶NcEgt1以解决大分子量蛋白表达难题、通过连接肽优化融合酶空间排布、基于序列比对和热点预测进行半理性突变，这些策略的组合使用使产量提升了5.5倍。值得注意的是，M3–02P417L在摇瓶（478 mg/L）和反应器（790 mg/L）中的产量差异提示发酵工艺仍有优化空间。该工作为麦角硫因的工业化微生物生产提供了可行的菌株平台，其多策略递进式优化的思路对其它天然产物的异源合成也具有参考价值。
参考来源
Liang Li. Efficient production of Ergothioneine via an optimized allogenous assembly of the ERG synthesis pathway in Escherichia coli BL21. Journal of Biotechnology, 2025.
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2025.06.009
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2025.06.009