来源：Integrated fermentative process for lipid and β-carotene production from acetogenic syngas fermentation using an engineered oleaginous Yarrowia lipolytica yeast（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
合成气发酵产乙酸，再经工程化解脂耶氏酵母转化为脂质和β-胡萝卜素——这条“废弃物变高值品”的生物工艺路线，在本研究中得到了系统验证。研究团队利用 Clostridium aceticum 将合成气转化为乙酸，随后以工程菌株 Yarrowia lipolytica JMY6862 为底盘细胞，实现了两种高价值产物的同步合成。菌株表现出最高 20 g/L 的乙酸耐受浓度，摇瓶实验中脂质含量峰值达 33.7%，β-胡萝卜素浓度达 13.6 mg/g；生物反应器研究进一步确认 pH 6.0 为最优条件，脂质含量 22.9%，β-胡萝卜素含量 44 mg/g。脂质谱在各实验中保持稳定，C18:1 占比约 50%。
研究背景
《巴黎协定》与联合国气候变化框架公约推动各国转向可再生资源生产化学品、食品和燃料。利用优化单元操作或生物反应器，从可持续原料甚至污染物中生产多种高价值产品已被证明可行——这既能减少废弃物，又能改善过程经济性。脂质与β-胡萝卜素的同步合成有望将燃料用脂质成本降至与化石燃料相当的水平，使生物炼制成为可行的产业替代方案。
脂质衍生的生物柴油和喷气燃料因高能量密度和可生物降解性而备受关注。β-胡萝卜素作为一种橙色色素，目前主要依赖化学合成或天然产物的微生物发酵，异源代谢工程被视为提升产量、满足市场需求的有效策略。本研究以合成气发酵产物乙酸为碳源，利用工程化解脂耶氏酵母同时生产脂质和β-胡萝卜素，将污染物转化与高值品合成整合于同一工艺链条。
研究方法
2.1 菌株与培养基
产乙酸模式菌株 Clostridium aceticum（DSM 1496）购自德国 DSMZ，按供应商方案进行冷冻保藏。工程菌株 Y. lipolytica JMY6862（ob-CHCTEFCTEF）的构建依据 Larroude 等（2018）的方法：该菌株源自“Obese”菌株 JMY3501（Lazar 等，2014），在其中依次导入 3 个拷贝的β-胡萝卜素表达盒（Celińska 等，2017），使用前于 −80 °C 保存。
C. aceticum 培养基组成（每升蒸馏水）：酵母提取物（YE）3.00 g；NH4Cl 0.20 g；K2HPO4 8.45 g；KH2PO4 1.75 g；NaHCO3 10.00 g；MgSO4·7H2O 0.35 g；半胱氨酸-HCl 0.30 g；Na2S·9H2O 0.90 g；Na-resazurin（0.1% w/v）1.00 ml；微量元素溶液 2.00 ml；维生素溶液 2.50 ml。微量元素与维生素稀释方法参照 Arslan 等（2021）的报道。
Y. lipolytica 的培养测试了多种培养基。初始毒性试验使用含 10.0 g YE、20.0 g 蛋白胨（每升蒸馏水）的培养基，添加不同浓度乙酸。第二批摇瓶实验中，使用不含维生素的 C. aceticum 培养基，添加以下组合：5、10 和 15 g/L 乙酸（ACE）；5、10 和 15 g/L 葡萄糖（GLU）；10 g/L 乙酸 + 25% YE；10 g/L 乙酸 + 25% NH4Cl；10 g/L 乙酸 + 25% YE + 25% NH4Cl；以 10 g/L GLU + 10 g/L YE + 20 g/L 蛋白胨为对照。YE 和 NH4Cl 的百分比指相对于 C. aceticum 最适培养基中各试剂添加量的比例——若最适培养基 YE 浓度为 3 g/L，则“+25% YE”对应 0.75 g/L。搅拌釜反应器（STR）实验使用 C. aceticum 发酵后含乙酸（6.6 g/L）的培养基，以 pH 6.0 或 8.0 为测试变量。
2.2 补料策略
#### 2.2.1 乙酸摇瓶分批培养
为评估 Y. lipolytica 对乙酸的耐受性，使用 5 个 500 ml 摇瓶进行分批实验，每瓶含 50 ml 培养基，乙酸浓度 2.5–40.0 g/L，pH 调至 5.5。浓度梯度的设定依据此前关于乙酸对酵母毒性限值的研究。灭菌后，接种预先在 YPD 中培养并洗涤的 Y. lipolytica，接种量相当于每毫升培养基 OD600nm 0.5。接种后摇瓶于 32 °C、150 rpm 条件下培养，实验期间定期测定酵母生长情况。
#### 2.2.2 C. aceticum 合成培养基分批培养
为评估 Y. lipolytica 在 C. aceticum 培养基中的生长情况，另设一组 500 ml 摇瓶实验，每瓶含 50 ml 培养基，pH 调至 5.5。灭菌后，接种相当于 0.5 OD600nm 的 Y. lipolytica（预先洗涤以防止营养干扰）。接种后摇瓶于 32 °C 轨道摇床 150 rpm 培养。实验期间测定生物量增长、底物消耗、总脂质和β-胡萝卜素产量。
#### 2.2.3 搅拌釜反应器研究
在 2 L BIOFLO 120 型生物反应器（Eppendorf，德国）中进行三组实验。第一组使用 C. aceticum 在厌氧无菌环境中培养，pH 维持在 7.5，气体连续通入流速 10 ml/min（CO:CO2:H2:N2 / 30:10:20:40），温度恒定 30 °C，搅拌 250 rpm。合成气组成以 CO、CO2 和 H2 为主——它们是合成气的常见组分，部分属于温室气体，可通过 Wood-Ljungdahl 途径进行生物转化。N2 的加入是因为其为某些气化过程中的常见气体，也存在于部分工业废气中，该方案无需进一步气体分离，具有成本效益。气体比例的选择基于工业兴趣、合作关系及此前 C. aceticum 研究的积极结果（Robles-Iglesias 等，2023b）。
其余两组实验使用 C. aceticum 由合成气转化产生的富含乙酸的培养基，初始 pH 分别设为 6.0 和 8.0，并在整个发酵过程中维持。灭菌后，接种 OD600nm 0.5/ml 的菌液。两组实验均持续通入合成空气，流速 0.1 vvm，温度 32 °C，搅拌速度 250 rpm。
2.3 分析方法
#### 2.3.1 细胞增殖与生物量密度测定
C. aceticum 和 Y. lipolytica 实验中，微生物生长通过 Hitachi U-200 分光光度计在 600 nm 波长下测定，生成生长曲线。必要时对样品进行稀释以维持分光光度计精度。生物量浓度测定：培养样品离心、洗涤、冻干 48 h 后称重。
#### 2.3.2 乙酸定量与 C/N 比
乙酸产量和消耗量使用 Agilent HP1100 高效液相色谱仪（HPLC）分析，配备示差折光检测器（50 °C）。20 µl 样品注入 Hi-Plex H 色谱柱，流动相为 0.005 M H2SO4，流速 0.80 ml/min。C/N 比测定中，氨浓度按照 Calero 等（2018）的方法在 635 nm 波长下分光光度法测定，随后计算相应 C/N 比。本研究重点定量乙酸和总氮浓度以评估发酵液中生物转化效率。虽然认识到发酵液成分复杂，未鉴定营养物质可能产生影响，但全面的组成分析超出本研究范围。
#### 2.3.3 脂质与脂肪酸甲酯（FAMEs）测定
用于生物量浓度测定的冻干样品同时进行 FAMEs 分析。脂质使用含硫酸的甲醇溶液提取（Robles-Iglesias 等，2021），随后使用配备火焰离子化检测器的 Thermo Fisher 气相色谱仪和 Agilent vf-23 ms 色谱柱进行鉴定和定量。载气为氦气，流速 2.2 ml/min。FAMEs 通过与已知稀释液比较进行鉴定，并使用商业 C12:0 转化为 FAME 的内标技术进行定量。
#### 2.3.4 β-胡萝卜素测定
β-胡萝卜素使用己烷、乙酸乙酯和丁基羟基甲苯溶液从培养基中提取。涡旋和离心后收集上清液，直至样品脱色。随后使用分光光度计在 448 nm 波长下测定吸光度，β-胡萝卜素浓度根据校准曲线确定。
#### 2.3.5 统计分析
采用线性回归分析评估底物浓度在 pH 6 和 pH 8 两种条件下对β-胡萝卜素产量的影响。分析使用 R 统计软件，调用 lm() 函数拟合线性模型。提取截距、底物浓度系数、p 值、R² 和 F 统计量等关键指标以评估模型拟合度和显著性。所有统计检验的显著性水平设定为 α = 0.05。
【数据】菌株：C. aceticum DSM 1496、Y. lipolytica JMY6862；培养基组分：YE 3.00 g/L，NH4Cl 0.20 g/L，K2HPO4 8.45 g/L，KH2PO4 1.75 g/L，NaHCO3 10.00 g/L，MgSO4·7H2O 0.35 g/L，半胱氨酸-HCl 0.30 g/L，Na2S·9H2O 0.90 g/L；乙酸浓度梯度：2.5–40.0 g/L；pH：5.5（摇瓶）、6.0/8.0（STR）；温度：32 °C（Y. lipolytica）、30 °C（C. aceticum）；转速：150 rpm（摇瓶）、250 rpm（STR）；接种量：OD600nm 0.5/ml；合成气配比：CO:CO2:H2:N2 / 30:10:20:40；气体流速：10 ml/min；STR 通气量：0.1 vvm；HPLC 条件：20 µl 进样，0.005 M H2SO4 流动相，0.80 ml/min；FAME 载气流速：2.2 ml/min；β-胡萝卜素检测波长：448 nm；氨检测波长：635 nm；冻干时间：48 h；显著性水平：α = 0.05
研究结果
3.1 乙酸对 Y. lipolytica 菌株的毒性
本部分主要目的是通过监测 OD600nm 考察 Y. lipolytica 菌株对不同乙酸浓度的敏感性和耐受性。图1显示了 Y. lipolytica 在不同初始乙酸浓度下的生长情况。
乙酸浓度为 2.5 和 5 g/L 时未观察到抑制效应，OD600nm 值较高（118 h 时 OD600nm 分别为 20.6 和 18.8）。10 g/L 时生长初期延迟，但最终达到相近的 OD600nm 值（118 h 时 OD600nm 为 23.9）。20 g/L 及以上浓度严重抑制生长，118 h 后 OD600nm 值接近零。
这些结果与现有文献一致——乙酸毒性受培养基酸度影响，并随乙酸浓度升高而增强（Abbott 等，2008；Verduyn 等，1992）。Gao 等（2020）和 Liu 等（2017）强调，酵母菌株在碱性条件下通常对乙酸表现出更高的耐受性，这归因于酸解离形式的减少，从而减轻了胞质酸化效应。基于这些发现可以推断，未来实验中碱性 pH 可能有助于提高耐受性，进而提升脂质和β-胡萝卜素产量。
菌株差异性是另一个不容忽视的方面。文献报道即使在同属不同菌株之间，乙酸耐受性也存在差异（Fontanille 等，2012；Gao 等，2017；Y. K. Park 等，2021a）。例如，Fontanille 等（2012）观察到 Y. lipolytica 菌株 MUCL 28849 可耐受高达 4 g/L 的乙酸浓度而无明显抑制效应。相比之下，本研究的工程化 Y. lipolytica 菌株在 10 g/L 浓度下表现出显著耐受性，凸显了菌株特异性评估对工业应用的重要性。
此外，10 g/L 初始浓度下观察到的延迟生长可能表明 Y. lipolytica 菌株经历了一个适应阶段以适应有毒环境。Gao 等报道了类似现象——乙酸浓度高于 10 g/L 时观察到更长的延滞期（Gao 等，2017）。这表明虽然高浓度可能在初期阻碍生长，但一段适应期后酵母可能恢复代谢活性。
【数据】菌株：Y. lipolytica JMY6862；乙酸浓度：2.5、5、10、20、40 g/L；OD600nm（118 h）：20.6（2.5 g/L）、18.8（5 g/L）、23.9（10 g/L）、接近 0（≥20 g/L）；培养温度：32 °C；转速：150 rpm
3.2 Y. lipolytica 在 C. aceticum 合成培养基上的培养
#### 3.2.1 生长与毒性
本实验测试了 Y. lipolytica 在 C. aceticum 最适培养基上、添加不同浓度乙酸、葡萄糖、YE 和 NH4Cl 时的毒性耐受性。测试浓度见 2.1 节。如图 2A 所示，除最高乙酸浓度（15 g/L）外，Y. lipolytica 均表现出良好的生长。5 g/L 乙酸时未观察到抑制，10 g/L 时延滞期延长。表1显示，10 g/L 乙酸的延滞期比 5 g/L 高 66%。
葡萄糖浓度增加促进了细胞生长。这一结果符合预期——葡萄糖对某些微生物仅在超过 40 g/L 的高浓度时才表现出一定抑制（Park 等，2017）。
在不同 % YE、NH4Cl 和 10 g/L 乙酸的摇瓶中，含 25% NH4Cl 和标准 YE 浓度的摇瓶生长最佳，其生物量甚至超过 5 g/L 葡萄糖的摇瓶。另外两个改变 YE 和 NH4Cl 的摇瓶达到了较低的生物量浓度。
图 2B 显示了底物消耗情况——除 15 g/L 乙酸外，所有条件下底物均被代谢。除 YE 和 NH4Cl 比例变化的摇瓶（25% YE 和 25% YE + 25% NH4Cl）外，所有摇瓶均实现了完全底物消耗。这可能是因为 YE 中的营养物质和氨基酸更好地支持了酵母生长和乙酸同化。
表1显示了最大底物消耗速率，5 和 10 g/L 乙酸摇瓶的值最低。然而，10 g/L 乙酸 + 不同 YE 和 NH4Cl 的摇瓶与初始试剂比例不变的摇瓶相比，表现出较高的最大消耗速率。与其他以酸为底物的 Y. lipolytica 研究相比，本实验的消耗值偏高。例如，Llamas 等报道的最大乙酸消耗速率为 0.035 g/L·h，而本研究的最小值为 0.066 g/L·h，尽管该参照研究的初始乙酸浓度不超过 2 g/L（Llamas 等，2020）。本实验中更快更好的乙酸同化可能源于工程酵母的增强效率。
【数据】乙酸浓度：5、10、15 g/L；葡萄糖浓度：5、10、15 g/L；延滞期差异：10 g/L 比 5 g/L 高 66%；最大乙酸消耗速率：≥0.066 g/L·h（本研究最小值），对照文献 0.035 g/L·h
#### 3.2.2 脂质生产
脂质相关结果见表2，脂质组成见图3。初始碳氮比（C/N）作为脂质生产的关键因素，对每个实验进行了计算。适当的 C/N 比允许生物量构建和碳储备用于脂质合成（Karamerou 等，2017）。高 C/N 比因氮缺乏诱导微生物应激，激活从头合成代谢途径，从而高效生产脂质或单细胞油（SCOs）（Mathiazhakan 等，2016）。然而，需要平衡的 C/N 比以确保充足的生物量生产（Sarantou 等，2021）。
本研究中 C/N 比范围为 2 至 50，发现较低的 C/N 比产生较高的生物量。例如，C/N = 3 的对照实验产生了最高生物量浓度 6.18 g/L。10 g/L 乙酸 + 25% YE 的实验达到最高脂质含量 33.67%（g/g 干生物量），对应初始 C/N 比为 40。另一个高 C/N 比（C/N = 50）的摇瓶脂质含量为 24.96% g/g。尽管 C/N 更高但脂质含量下降，可能归因于营养缺乏——该实验对应 25% YE 和标准 NH4Cl。最低脂质含量 16.59% g/g 出现在 5 g/L 葡萄糖的摇瓶中。
就脂质浓度（g/L）而言，对照摇瓶的最高值为 1.79 g/L，尽管其并非脂质含量最高的实验。原因在于对照摇瓶产生的生物量几乎是 10 g/L 乙酸 + 25% YE 摇瓶的三倍。表2显示了相对于消耗底物的生物量和脂质产量，分别记为 Y(X/S) 和 Y(L/S)。以葡萄糖为底物时的生物量产率高于乙酸。然而，两种底物的脂质产率相似，唯对照摇瓶的脂质产率最高，Y(L/S) = 0.179。
图3概述了各实验的脂质组成。虽然各测试间组成基本一致，但油酸（C18:1）是主要化合物，其次是棕榈酸（C16:0）和亚油酸（C18:2）。棕榈油酸（C16:1）和硬脂酸（C18:0）含量较低。Y. lipolytica 在乙酸与葡萄糖上生长时脂质谱出现差异——以乙酸为碳源时 C18:2 化合物的比例更高。
酵母的脂质谱与实验条件和酵母菌株密切相关（Hansson 和 Dostálek，1986），通常 C18:1 酸占主导地位，最高可达总脂质的 66%（Manzoor，2017）。例如，Carsanba 等表明，即使同一物种的不同酵母之间也可能存在差异（Carsanba 等，2020）。本实验中，C18:1 最大值来自 15 g/L 葡萄糖，为 51.1%（表2）。将该脂质谱与类似研究比较，本研究结果基本一致。
【数据】C/N 比范围：2–50；最高生物量：6.18 g/L（C/N = 3 对照）；最高脂质含量：33.67% g/g（10 g/L 乙酸 + 25% YE，C/N = 40）；高 C/N 脂质含量：24.96% g/g（C/N = 50）；最低脂质含量：16.59% g/g（5 g/L 葡萄糖）；最高脂质浓度：1.79 g/L（对照）；最高脂质产率：Y(L/S) = 0.179（对照）；C18:1 最大值：51.1%（15 g/L 葡萄糖）
讨论与解读
本研究证实了适应富含乙酸培养基的 Y. lipolytica 能够以合成气来源的羧酸为底物同步生产脂质和β-胡萝卜素。菌株的乙酸耐受性是决定其生长和生产力的关键因素。通过优化实验参数，该工艺有望进一步提升。获得的脂质谱中 C18:1 占比接近 50%，对生物柴油生产具有重要意义，为合成气的高效经济转化提供了一条可行路径。
编译者解读
该研究的意义在于打通了“合成气→乙酸→脂质+β-胡萝卜素”的完整生物转化链条，以 Clostridium aceticum 与工程化 Y. lipolytica 的分步偶联规避了合成气直接发酵中气液传质与产物抑制的难题。方法上，基于 C/N 比调控脂质积累的策略成熟可靠，但乙酸耐受性实验显示 20 g/L 即为抑制阈值，这对工业级高浓度底物进料构成限制。pH 6.0 下 β-胡萝卜素含量达 44 mg/g 的结果值得关注，提示 pH 调控可作为产物合成的有效杠杆。未来若能在菌株耐受性进化或原位产物萃取方面取得突破，该工艺的经济性将进一步提升。
参考来源
Robles-Iglesias R, et al. Integrated fermentative process for lipid and β-carotene production from acetogenic syngas fermentation using an engineered oleaginous Yarrowia lipolytica yeast. Bioresource Technology, 2023. DOI: 10.1016/j.biortech.2023.129815
DOI: 10.1016/j.biortech.2023.129815