来源：ActO, a positive cluster-situated regulator for actinomycins biosynthesis in Streptomyces antibioticus ZS（Gene）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
放线菌素是一类由链霉菌产生的环状脂肽抗生素，其中放线菌素D是治疗多种恶性肿瘤的有效临床药物。然而，其生物合成的调控机制长期未获充分阐明。本研究从深海珊瑚来源的抗生素链霉菌ZS中鉴定出一个位于放线菌素生物合成基因簇内的LmbU家族调控因子ActO，通过基因敲除与过表达实验证实其为该生物合成途径的正向调控因子。过表达actO使放线菌素D和放线菌素V产量分别提升4.4倍和2.6倍，为放线菌素高产菌株的理性改造提供了新靶点。
研究背景
链霉菌以产生丰富的次级代谢产物著称，在医药和农业领域应用广泛。放线菌素于1940年被首次发现，其分子结构特征为两个环状五肽内酯通过酰胺键与一个吩嗪酮发色团连接。这类化合物通常具有广谱抗菌活性，部分成员还具备抗病毒和抗肿瘤作用。其中，放线菌素D目前是治疗Wilms瘤、尤文肉瘤和横纹肌肉瘤等恶性肿瘤的有效药物，临床需求量持续增长。放线菌素V作为放线菌素D的结构类似物，在结直肠癌、肺癌和乳腺癌治疗中展现出潜力，且肝肾毒性低于放线菌素D。此外，两者对临床常见致病菌及结核分枝杆菌均表现出较强的抑制活性。
尽管放线菌素的化学性质、生物活性和生物合成已有大量研究，但其生物合成的调控机制仍不清楚。从深海珊瑚中分离的Streptomyces antibioticus ZS是放线菌素D和放线菌素V的产生菌株。本研究对该菌株放线菌素生物合成基因簇中的一个簇内调控因子ActO进行了功能表征，该因子属于LmbU家族。
研究方法
菌株、质粒、引物与培养条件
本研究所用菌株、质粒和引物汇总于表S1和表S2。Streptomyces antibioticus ZS作为野生型（WT）菌株，是放线菌素D和放线菌素V的天然产生菌。常规培养采用YMG固体培养基（0.4%酵母提取物、1%麦芽提取物、0.4%葡萄糖、1.5%琼脂，pH 7.3），28°C培养2天；或M2液体培养基（2%淀粉、0.5%葡萄糖、1%玉米浆、0.5%酵母提取物、0.2%CaCO₃），28°C、225 rpm振荡培养2天。放线菌素产生实验采用两步培养法：先在M2培养基中28°C、225 rpm预培养2天，再以1%接种量转接至M4培养基（2%淀粉、0.5%棉子糖、0.5%葡萄糖、0.5%玉米浆、0.5%酵母粉、0.2%CaCO₃），28°C、225 rpm发酵7天。产孢采用ISP4培养基，28°C培养2–3天。大肠杆菌在LB固体或液体培养基（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl）中37°C、225 rpm培养14–16小时；若含有温度敏感型质粒则改为30°C培养。根据需要向培养基中添加适宜浓度的抗生素。
【数据】YMG培养基：0.4%酵母提取物、1%麦芽提取物、0.4%葡萄糖、1.5%琼脂，pH 7.3；M2培养基：2%淀粉、0.5%葡萄糖、1%玉米浆、0.5%酵母提取物、0.2%CaCO₃；M4培养基：2%淀粉、0.5%棉子糖、0.5%葡萄糖、0.5%玉米浆、0.5%酵母粉、0.2%CaCO₃；培养温度：28°C；转速：225 rpm；发酵时间：7天
生物信息学分析
S. antibioticus ZS中放线菌素生物合成基因簇通过在线软件antiSMASH（https://antismash.secondarymetabolites.org/）进行预测。多序列比对使用DNAMAN软件完成。蛋白质二级结构通过在线软件SOPMA（https://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）分析。系统发育树采用MEGA 11软件中的邻接法（NJ）构建，自展值设为1000次重复。
【数据】比对软件：DNAMAN；二级结构预测：SOPMA；系统发育树：MEGA 11，NJ法，1000次bootstrap重复
基因敲除与过表达
actO敲除突变株采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建，操作参照Huang等的方法。actO的特异性单链引导RNA（sgRNA）由软件sgRNAcas9设计，以pKCcas9dO质粒为模板、sgRNA-F/R为引物进行PCR扩增获得。actO的上游同源臂（UHA）和下游同源臂（DHA）以WT菌株基因组为模板、UHA-F/R和DHA-F/R为引物扩增获得。三个DNA片段通过重叠PCR融合后，经SpeI/HindIII（NEB）双酶切，使用T4 DNA连接酶（TaKaRa）连接至pKCcas9dO载体，构建质粒pKCcasdO-actO。该质粒通过接合转移导入WT菌株。推定敲除突变株（△actO菌株）经PCR和DNA测序确认。基因敲除成功后，pKCcasdO-actO质粒在37°C无抗生素条件下培养消除。
过表达质粒pIB139-actO的构建过程如下：以WT菌株基因组为模板、actO-F/R为引物扩增actO片段，将actO片段与经NdeI/XbaI（NEB）酶切的线性化pIB139载体组装。所得质粒pIB139-actO通过接合转移导入WT菌株，推定过表达菌株（::actO菌株）经PCR和DNA测序确认。
【数据】CRISPR/Cas9基因编辑；sgRNA设计软件：sgRNAcas9；限制性内切酶：SpeI/HindIII（NEB）、NdeI/XbaI（NEB）；连接酶：T4 DNA Ligase（TaKaRa）；接合转移导入；质粒消除条件：37°C无抗生素
放线菌素产量与菌株生长分析
为分析WT、△actO和::actO菌株放线菌素产量的差异，对放线菌素D和放线菌素V的产量进行检测。发酵期间分别于第1、3、5和7天取样，取2 mL发酵液离心，上清液保存于4°C。向沉淀中加入2 mL丙酮，重悬后在室温避光放置24小时。将丙酮层与上清液混合，用乙酸乙酯萃取三次。乙酸乙酯经旋转蒸发后，残留物用甲醇溶解，进行超高效液相色谱（UPLC）分析。UPLC分析采用C18色谱柱（4 μm，250 × 4.6 mm，Thermo），流动相为乙腈线性梯度50%至55%，洗脱60分钟。流速为0.3 mL/min，紫外检测波长为254 nm和442 nm。
细菌生长分析通过测定发酵期间WT、△actO和::actO菌株的生物量并观察其生长表型完成。生物量以细胞干重（DCW）表示，发酵期间每24小时间隔取样。生长表型观察方法为：将孢子接种于YMG固体培养基，28°C培养5天。
【数据】取样时间点：第1、3、5、7天；样品量：2 mL；丙酮用量：2 mL；萃取：乙酸乙酯×3次；UPLC色谱柱：C18（4 μm，250 × 4.6 mm）；梯度：50–55%乙腈，60 min；流速：0.3 mL/min；检测波长：254 nm和442 nm；DCW取样间隔：24 h；YMG固体培养基28°C培养5天
共转录与转录水平分析
发酵5天后，使用RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit（TIANGEN）提取WT、△actO和::actO菌株的总RNA。使用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）（Vazyme）从总RNA合成互补DNA。WT菌株基因组DNA使用HiPure Bacterial DNA Kit（Magen）提取。
共转录分析用于确定act基因簇中的操纵子结构。以WT菌株的gDNA和cDNA为模板，通过PCR扩增act基因簇中相邻基因的间隔区。若以gDNA和cDNA为模板均能检测到跨越间隔区的PCR产物，则表明两个相邻基因位于同一操纵子中。
RT-qPCR用于分析基因簇内基因的转录水平。以rpoD的转录水平作为内参对测试基因的转录水平进行归一化，采用2^(−△△CT)法计算各基因的相对转录水平。
【数据】总RNA提取试剂盒：RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit（TIANGEN）；cDNA合成：HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Vazyme）；gDNA提取：HiPure Bacterial DNA Kit（Magen）；内参基因：rpoD；计算方法：2^(−△△CT)法
His₆标记重组蛋白的表达与纯化
为构建用于His₆-ActO表达的pET28a-actO质粒，以WT菌株基因组为模板、ActO-F/R为引物扩增actO片段，将actO片段与经NdeI/EcoRI（NEB）酶切的线性化pET28a载体组装。所得质粒pET28a-actO转化至E. coli BL21（DE3）中。
His₆-ActO的表达条件为：E. coli BL21（DE3）/pET28a-actO在液体LB培养基中37°C、225 rpm培养至OD₆₀₀达到0.6，然后加入0.15 mmol/L IPTG，在16°C、120 rpm条件下诱导12小时。培养结束后收集菌体，用缓冲液（137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na₂HPO₄、2 mmol/L KH₂PO₄、2 μmol/L PMSF，pH 7.3）重悬，超声破碎，离心收集含可溶性蛋白的上清液。His₆-ActO通过镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）琼脂糖柱系统（Qiagen）纯化，并经PD-10脱盐柱系统（GE Healthcare Life Sciences）脱盐。纯化的His₆-ActO保存于脱盐缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl、0.2 mmol/L DTT、10%甘油，pH 7.4）中。SDS-PAGE和Bradford法用于评估蛋白纯度与浓度。
【数据】表达菌株：E. coli BL21（DE3）；诱导条件：0.15 mmol/L IPTG，16°C，120 rpm，12 h；裂解缓冲液：137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na₂HPO₄、2 mmol/L KH₂PO₄、2 μmol/L PMSF，pH 7.3；纯化：Ni-NTA（Qiagen）；脱盐：PD-10（GE Healthcare Life Sciences）；保存缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl、0.2 mmol/L DTT、10%甘油，pH 7.4
凝胶迁移率变动分析（EMSA）
用于EMSA的探针以WT菌株基因组为模板、对应引物（见表S2）扩增获得。非竞争性探针的序列来源于actO的编码序列。EMSA使用EMSA Kit（Beyotime）完成。每个10 μL反应体系包含2.5 ng生物素标记探针和不同浓度（1 μmol/L、2 μmol/L和3 μmol/L）的纯化His₆-ActO蛋白。此外，加入250 ng未标记的竞争性或非竞争性探针（标记探针的100倍量）作为竞争者以确认结合特异性。结合反应在25°C进行30分钟，反应混合物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至尼龙膜，最后在紫外光（254 nm）下固定。条带检测按照EMSA Kit说明书执行。
【数据】探针用量：2.5 ng生物素标记；蛋白浓度：1、2、3 μmol/L；竞争性探针：250 ng（100倍）；结合条件：25°C，30 min；固定：UV 254 nm
研究结果
ActO——S. antibioticus ZS的act基因簇中一个潜在的LmbU家族调控因子
通过antiSMASH预测了S. antibioticus ZS中放线菌素的生物合成基因簇（act基因簇），actO（GenBank登录号PP502937）是位于act基因簇中的一个推定调控基因。该基因由648个核苷酸组成，编码一个含215个氨基酸的蛋白质，预测分子量为24.7 kDa。ActO（GenBank登录号WXH65816.1）的Blastp分析显示其属于LmbU家族。在已研究的LmbU家族调控因子中，ActO与来自S. costaricanus SCSIO ZS0073的AcnO一致性为73.21%，与来自S. lincolnensis的LmbU一致性为46.78%。进一步分析ActO的二级结构发现，其中间区域含有一个HTH DNA结合结构域，这与许多LmbU家族调控因子相似。LmbU家族成员通常正向调控抗生素的产生，提示ActO可能具有类似功能。
【数据】actO基因：648个核苷酸；编码蛋白：215个氨基酸；预测分子量：24.7 kDa；与AcnO一致性：73.21%；与LmbU一致性：46.78%；结构域：HTH DNA结合结构域（中间区域）
actO敲除突变株与过表达菌株的成功构建
△actO菌株通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建。::actO菌株通过将actO整合至染色体attB位点构建，actO由启动子ermE*p控制。菌株构建的验证结果如图2B和图2D所示，条带均符合预期。上述结果表明，actO在△actO菌株中被成功敲除，并成功整合至::actO菌株的染色体中。
【数据】敲除方法：CRISPR/Cas9；整合位点：attB；启动子：ermE*p；验证方法：PCR（WT扩增产物2844 bp，△actO扩增产物2262 bp）
ActO正向调控放线菌素的产生
为明确ActO在放线菌素产生中的作用，检测了WT、△actO和::actO菌株中放线菌素D和放线菌素V的产量。在四个时间点（第1、3、5和7天）收集培养物进行UPLC分析。结果显示，△actO菌株无法产生放线菌素D和放线菌素V。同时，::actO菌株中放线菌素D和放线菌素V的产量显著高于WT菌株，第7天时分别增加了4.4倍和2.6倍（放线菌素D从8.05 ± 0.62 mg/L增至35.81 ± 1.91 mg/L；放线菌素V从42.11 ± 2.67 mg/L增至111.96 ± 7.67 mg/L）。为确认产量差异是否由细胞生长变化引起，测定了发酵期间的生物量并观察了YMG固体培养基上的生长表型，结果显示三者之间无显著差异。以上结果表明，ActO可能作为S. antibioticus ZS中放线菌素产生的正向调控因子。
【数据】放线菌素D产量：WT为8.05 ± 0.62 mg/L，::actO为35.81 ± 1.91 mg/L（7天）；放线菌素V产量：WT为42.11 ± 2.67 mg/L，::actO为111.96 ± 7.67 mg/L（7天）；提升倍数：放线菌素D 4.4倍，放线菌素V 2.6倍；△actO产量：未检出；生物量：无显著差异
ActO正向调控act基因簇中所有基因的转录
为进一步探究ActO的调控机制，采用RT-qPCR确定ActO在act基因簇中的靶基因。由于原核生物中一个启动子通常可启动多个基因的转录，研究计划通过检测每个操纵子中第一个基因的转录水平来反映整个操纵子的转录情况。首先通过PCR确定act基因簇的操纵子结构，以WT菌株的基因组DNA和互补DNA为模板分别扩增act基因簇中相邻基因的间隔区。共转录分析结果显示，所有间隔区均被检测到，表明act基因簇中存在四个操纵子，分别命名为operon 1/2/3/4（actE/D/C/B/A、actF/G/H/I/J/K/L/M、actP/O/N和actQ/R/S/T）。随后，通过RT-qPCR检测每个操纵子的第一个基因（actE/actF/actP/actQ）以及actO的转录水平。与WT菌株相比，△actO菌株中这五个基因的转录水平大幅下降，而在::actO菌株中则有所上升。上述结果表明，ActO的靶基因涵盖act基因簇中的所有基因，且ActO能够激活它们的转录。
【数据】操纵子结构：4个操纵子（operon 1：actE/D/C/B/A；operon 2：actF/G/H/I/J/K/L/M；operon 3：actP/O/N；operon 4：actQ/R/S/T）；检测基因：actE、actF、actP、actQ、actO；结果：△actO中5个基因转录水平大幅下降，::actO中上升
未观察到His₆-ActO与靶基因启动子的特异性结合
为观察ActO与靶基因启动子之间的相互作用，进行了EMSA实验。实验中，启动子预测通过在线软件BPROM和BDGP完成，His₆-ActO蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中表达并经Ni螯合亲和层析纯化。探针EF和探针PQ分别包含operon 1/2和operon 3/4的启动子区域。EMSA结果显示，His₆-ActO能够与探针EF和探针PQ结合，且结合程度随蛋白浓度的增加而增强。然而，当加入竞争性冷探针或非竞争性冷探针时，两条结合条带均消失，表明His₆-ActO与探针EF和探针PQ的结合是非特异性的。
【数据】His₆-ActO蛋白分子量：27.4 kD（SDS-PAGE）；蛋白浓度梯度：1、2、3 μmol/L；探针：EF（含operon 1/2启动子）、PQ（含operon 3/4启动子）；竞争实验：250 ng冷探针（100倍）；结果：非特异性结合
讨论与解读
放线菌素是由链霉菌产生的一类环状脂肽抗生素，因其丰富的生物活性具有巨大的应用潜力。其中，放线菌素D是治疗多种恶性肿瘤的有效药物，临床需求量大。以往放线菌素产量优化主要依赖发酵工艺优化和诱变育种。随着对各种抗生素生物合成及调控网络认知的深入，合理利用调控因子已被证明是产量优化的新策略。然而，放线菌素生物合成的调控机制研究仍然有限。本研究从深海珊瑚来源的S. antibioticus ZS出发，通过antiSMASH分析预测了放线菌素生物合成基因簇并筛选到潜在调控基因actO。进一步分析表明ActO属于LmbU家族。有趣的是，所有已知的放线菌素生物合成基因簇均含有LmbU家族调控因子。
基因敲除实验证实ActO是放线菌素生物合成所必需的正向调控因子——敲除actO完全阻断放线菌素合成，过表达则使放线菌素D和放线菌素V产量分别提高4.4倍和2.6倍。RT-qPCR显示ActO激活act基因簇中所有基因的转录。但EMSA未能证实ActO与靶基因启动子的特异性结合，提示ActO可能通过间接机制或其他辅助因子介导的方式发挥调控作用。过表达actO为提高放线菌素产量提供了一种新策略。
编译者解读：该研究从深海珊瑚来源菌株中鉴定出LmbU家族调控因子ActO，并证实其正向调控放线菌素生物合成。从合成生物学应用角度看，簇内调控因子的过表达是激活或提升天然产物产量的常用且有效手段——本研究4.4倍和2.6倍的产量提升幅度颇具工业应用潜力。值得注意的是，ActO能激活整个基因簇所有基因的转录，这种全局性调控特征使其成为异源表达体系中共表达以驱动完整生物合成通路的理想候选元件。EMSA未能检测到特异性DNA结合这一"负面"结果同样具有科学价值，提示ActO可能通过蛋白-蛋白互作或间接调控发挥作用，为后续机制研究指明了方向。本研究的局限在于未阐明ActO的上游信号感知机制及其在放线菌素生物合成与细胞生理之间的整合角色。
参考来源
Liang Y. ActO, a positive cluster-situated regulator for actinomycins biosynthesis in Streptomyces antibioticus ZS. Gene, 2025. DOI: 10.1016/j.gene.2024.148962
DOI: 10.1016/j.gene.2024.148962