来源：PNA/SWCNT hybrid electrochemical platform optimized by machine learning for species-specific quantification of Bacillus cereus（Bioelectrochemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
蜡样芽孢杆菌是引发食源性疾病的常见病原菌，传统检测方法耗时长且难以区分近缘菌种。本研究首次将机器学习（ML）优化策略引入肽核酸（PNA）电化学生物传感器的开发，利用AutoGluon框架系统优化碳纳米管浓度、PNA密度、检测电位等关键参数，将开发周期大幅缩短。传感器对蜡样芽孢杆菌DNA的检出限达0.3 ng/μL，检测时间仅180秒，在饮用水和牛奶基质中回收率分别为78–105%和90–111%，展示出实际食品样本监测的潜力。
研究背景
蜡样芽孢杆菌是一种普遍存在的革兰氏阳性产孢菌，可在土壤及谷物、蔬菜、乳制品等多种食品基质中繁殖。其在食品加工和储存过程中的持续存在主要归因于适应性代谢和耐热毒素的分泌，可导致腹泻型和呕吐型综合征，对食品安全和公共卫生构成显著威胁。现有检测方法各有局限：培养法虽为“金标准”但耗时数天；PCR等分子方法需专门设备和专业人员，且常难以区分蜡样芽孢杆菌与近缘芽孢杆菌种。电化学生物传感器将高灵敏度、低成本与便携实时分析潜力集于一身，是颇具前景的替代方案。本研究在此背景下，报道了首个机器学习优化的PNA电化学生物传感器，用于蜡样芽孢杆菌的灵敏特异性检测。
研究方法
2.1 化学试剂与材料
丝网印刷碳电极（SPE）购自泰国Quasense有限公司。羧基功能化单壁碳纳米管（SWCNT-COOH），纯度>90%，CAS号99685–96-8，购自美国休斯顿US Research Nanomaterials公司。1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC）、N-羟基磺基琥珀酰亚胺（NHS）、铁氰化钾（K3[Fe(CN)6]）、亚铁氰化钾（K4[Fe(CN)6]）及磷酸盐缓冲液片剂均购自美国Sigma-Aldrich公司。BlockPro™无蛋白封闭缓冲液#BM01购自台湾Energenesis Biomedical有限公司。蜡样芽孢杆菌971株（ATCC 14579）基因组DNA购自泰国Biomedia有限公司。所有溶液均使用去离子水（DI水，美国Millipore公司，R ≥ 18.2 MΩ cm⁻¹）配制。
【数据】SWCNT纯度：>90%；水电阻：≥18.2 MΩ cm⁻¹
2.2 PNA合成
PNA按照既有方案合成，C端添加赖氨酸单元用于后续在丝网印刷电极上的固定，N端以乙酰基封端。PNA探针序列为Ac-CGAACGTTAAGCC-Lys-CONH₂。
【数据】PNA序列：Ac-CGAACGTTAAGCC-Lys-CONH₂
2.3 DNA提取
蜡样芽孢杆菌ATCC 14579在开盖前先离心，防止沉淀物损失。加入250 μL无RNase水复水DNA，4°C缓慢摇动过夜。随后将样品于65°C水浴孵育1小时，再冷却至4°C保持5分钟。使用NanoDrop分光光度计（美国Thermo Scientific公司）测定基因组DNA浓度和纯度（A260/280）。
【数据】复水体积：250 μL；温度：4°C过夜→65°C 1h→4°C 5min
2.4 电化学与表征仪器
所有电化学测量均在PalmSense 4恒电位仪（荷兰PalmSens BV公司）上进行，由PSTrace 5.9版软件控制。所有实验溶液均以0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）新鲜配制。SPE/SWCNT/PNA的表面形貌使用美国Olympus公司的激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）表征，用于分析修饰电极表面的粗糙度面积和表面积；另使用美国FEI公司Quanta 250 FEG扫描电子显微镜（SEM）进行形貌观察。
【数据】PBS浓度：0.1 M；pH：7.4
2.5 机器学习辅助参数优化
为解决实验条件限制并减少生物传感器优化过程中昂贵的试剂消耗，采用AutoGluon自动化机器学习框架（版本1.4.0）实现数据驱动建模方法。优化工作流程采用系统化方法确定最佳制备和操作参数。鉴于实验数据集有限（n=60个观测值），使用自助法（bootstrapping with replacement）进行数据增强，生成扩充训练集，同时保留实验测量的底层统计分布。增强后的数据集通过分层随机抽样划分为训练集（80%）和测试集（20%），确保两组中响应值的代表性分布。AutoGluon自动回归流程配置了多种机器学习算法评估，包括梯度提升机、随机森林和神经网络，通过贝叶斯优化进行超参数调优（5折交叉验证，时限1小时）。模型性能使用决定系数（R²）和均方根误差（RMSE）在留出测试集上严格评估。最终模型使用SHapley Additive exPlanations（SHAP）进行解释，量化特征重要性和对电化学响应的方向性影响，为参数选择提供可解释的指导，避免依赖启发式试错方法。
【数据】数据集规模：n=60；训练/测试分割：80%/20%；交叉验证：5折；时限：1小时
2.6 PNA生物传感器的制备与电化学检测步骤
PNA生物传感器的制备步骤较先前报道有所改进。具体流程如下：
1. 将羧基化单壁碳纳米管（SWCNT-COOH）超声处理30分钟后，滴涂于丝网印刷碳电极（SPE）表面。
2. 采用EDC/NHS活化羧基：将0.1 M EDC水溶液与0.4 M NHS水溶液按1:1混合，取20 μL加至工作电极（WE）区域。EDC/NHS的交联时间经优化（见支撑信息图S2）。
3. 功能化传感器用去离子水冲洗两次，加入4 μL浓度为10 μM的PNA，置于冰箱中4°C过夜。SPE/SWCNT/PNA生物传感器保存至使用前。
4. SPE/SWCNT/PNA生物传感器制备完成后，进行封闭步骤以尽量减少干扰。取20 μL封闭试剂滴加在工作电极上，等待3分钟，然后用PBS缓冲液冲洗两次，干燥数秒。
5. 在此过程中，蜡样芽孢杆菌基因组DNA经沸水浴变性10分钟，立即置于冰浴冷却3分钟，然后滴涂到SPE/SWCNT/PNA生物传感器上。杂交时间经优化选定为30–45分钟。
6. 采用间接氧化还原指示剂策略：加入100 μL浓度为5 mM的[Fe(CN)6]³⁻/⁴⁻覆盖全部三个电极，在施加电位+0.3 V（vs Ag/AgCl）下记录计时电流信号180秒。
关于5 mM氧化还原指示剂浓度的选择依据：本系统的电流响应根本上取决于氧化还原物种向电极表面的通量。低浓度时，由于氧化还原活性分子有限，产生的电流信号较弱，限制了灵敏度并增加了基线噪声的相对影响。反之，过高浓度会导致高背景电流并可能使传感界面饱和。在“信号关闭”型杂交传感器中，氧化还原探针浓度过高会降低信号对比度（ΔI），因为高载流子密度可能掩盖目标DNA引起的界面电阻细微变化。5 mM被广泛认为是电分析生物传感中的最优标准浓度。在此浓度下，系统实现高信噪比，维持稳定、扩散控制的氧化还原动力学，且不引起显著电极污染或过度背景干扰。
【数据】SWCNT超声时间：30min；EDC浓度：0.1M；NHS浓度：0.4M；混合比：1:1；EDC/NHS用量：20μL；PNA浓度：10μM；PNA用量：4μL；固定温度/时间：4°C过夜；封闭时间：3min；DNA变性：沸水浴10min+冰浴3min；杂交时间：30–45min；[Fe(CN)6]³⁻/⁴⁻浓度：5mM；用量：100μL；施加电位：+0.3V vs Ag/AgCl；检测时间：180s
2.7 实际样品分析
过期牛奶使用前离心（10,000 rpm，10分钟），牛奶分为三层，从第二层收集上清作为样品溶液。天然饮用水购自当地超市，含天然雨水。实际样品中添加5 ng/μL（约10⁸ CFU/mL理论当量）蜡样芽孢杆菌基因组DNA，然后于100°C水浴煮沸10分钟使双链DNA解链。冰浴冷却3分钟后，将样品滴加到SPE/SWCNT/PNA电极上（4 μL），孵育约30–40分钟完成杂交，随后用PBS缓冲液冲洗。使用氧化还原指示剂溶液（5 mM [Fe(CN)6]³⁻/⁴⁻，50 μL）在施加电位+0.3 V（vs Ag/AgCl）下测量信号响应180秒，计算回收率百分比。所有实验均在高压灭菌的缓冲液和去离子水中进行。
【数据】牛奶离心：10,000rpm，10min；加标浓度：5ng/μL（~10⁸ CFU/mL）；煮沸：100°C，10min；冰浴：3min；样品用量：4μL；杂交时间：30–40min；指示剂体积：50μL；电位：+0.3V vs Ag/AgCl；检测时间：180s
研究结果
3.1 表面形貌与EIS表征
PNA生物传感器的制备是实现捕获目标蜡样芽孢杆菌DNA特异性的关键步骤。通过滴涂法将SWCNT-COOH修饰到商业丝网印刷碳电极（SPE）上，利用EDC/NHS活化-COOH基团，随后通过酰胺键形成实现PNA固定。电极表面形貌使用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）和扫描电子显微镜（SEM）进行表征。
LSCM图像确认了未修饰和修饰电极的三维形貌，提供三维轮廓粗糙度（Sa）信息。相对于裸SPE，SWCNT和PNA修饰后Sa值依次增加，表明探针固定成功。SEM图像（5000×放大倍数）显示，裸SPE表面光滑；SWCNT修饰电极呈现纤维状结构，表面粗糙度增加；PNA固定后，表面变得更致密、纤维感减少，证实探针成功附着。
电极的逐步修饰过程通过电化学阻抗谱（EIS）和循环伏安法（CV）严格表征，监测[Fe(CN)₆]³⁻/⁴⁻氧化还原探针的电子转移动力学。EIS数据拟合至Randles等效电路，显示电荷转移电阻（Rct）的清晰变化。裸SPE呈现高Rct（约450 Ω），SWCNT修饰后大幅降至约130 Ω，证实形成了促进电子转移的高导电网络。PNA探针固定后Rct升高，表明生物分子层的附着作为氧化还原反应的动力学屏障。Rct的这种变化序列——高（裸电极）、低（SWCNT）、升高（PNA）——证实了生物传感界面的成功构建。与目标DNA成功杂交后CV峰电流相应降低，与形成的PNA-DNA双链体增加的空间位阻和静电阻碍一致。
【数据】裸SPE的Rct：~450Ω；SWCNT修饰后Rct：~130Ω
3.2 机器学习辅助的参数优化
为实现PNA生物传感器检测蜡样芽孢杆菌的最佳性能，变化可能影响测试效率的参数并使用机器学习模型进行计算。采用随机森林（RF）回归架构优化生物传感器的多维参数空间，以解释非线性相互作用。电极制备的关键参数包括SWCNT和PNA浓度，以及电位和杂交时间测量值，作为ML训练模型的输入特征。DNA杂交前后的信号响应如图所示。传感器性能通过从DNA杂交后的信号（红色迹线）中减去空白信号（蓝色迹线）来考察，得到Δ电流（ΔI），以条形图显示。关键制备和检测参数通过ML辅助分析进行优化，以减少参数选择中的偏差，包括SHAP分析和力绘图。
#### 3.2.1 SWCNT浓度
由于SWCNT层在导电性和增大表面积方面起关键作用，SWCNT的分布可能影响有无DNA杂交之间的Δ电流（ΔI）。SWCNT浓度从0.25至5 mg/mL变化。PNA探针的验证在5 ng/μL蜡样芽孢杆菌DNA、施加电位+0.3 V（vs Ag/AgCl）、180秒条件下进行，电流响应减去特定SWCNT浓度下的空白值。结果显示，响应随SWCNT浓度增加至1 mg/mL而升高，此后过量SWCNT负载导致聚集并降低响应。因此，选择1 mg/mL作为最佳浓度。
【数据】SWCNT浓度范围：0.25–5mg/mL；最佳浓度：1mg/mL；DNA浓度：5ng/μL；电位：+0.3V vs Ag/AgCl；时间：180s
#### 3.2.2 PNA浓度
PNA是决定生物传感器特异性的关键组分。电极制备过程中，固定PNA的量可能影响DNA杂交能力。实现最佳固定PNA量需要考虑PNA浓度。在检测电位+0.3 V（vs Ag/AgCl）、180秒、5 ng/μL DNA条件下，研究了2.5 μM至50 μM的PNA浓度范围。最佳PNA浓度为10 μM，产生最高Δ电流。超过10 μM的更高PNA负载使信号降低，可能归因于空间位阻和电极表面的绝缘效应。因此，10 μM PNA探针浓度下目标DNA杂交后获得的信号最佳。此外，PNA对蜡样芽孢杆菌的特异性已在先前工作中报道。
【数据】PNA浓度范围：2.5–50μM；最佳浓度：10μM；DNA浓度：5ng/μL；电位：+0.3V vs Ag/AgCl；时间：180s
#### 3.2.3 检测施加电位
SPE/SWCNT/PNA生物传感制备优化后，考察检测电位。结果显示，施加电位为0和+0.1 V（vs Ag/AgCl）时，有无DNA杂交之间无信号差异。+0.3 V（vs Ag/AgCl）之后的信号响应提供电流响应且差异显著。因此，选择+0.3 V（vs Ag/AgCl）作为最佳检测电位，因为该电位也是[Fe(CN)6]³⁻/⁴⁻氧化还原对反应的最强电流响应。
【数据】考察电位：0、+0.1、+0.3V vs Ag/AgCl；最佳电位：+0.3V vs Ag/AgCl
#### 3.2.4 杂交时间
孵育时间（即杂交时间）可能关系到PNA-DNA杂交效率，直接影响生物传感器信号。将蜡样芽孢杆菌DNA溶液在双链DNA解链后滴加至SPE/SWCNT/PNA探针上，在环境条件下保持杂交，盖上盖子防止污染。从15分钟至90分钟考察孵育时间的影响。结果显示，孵育时间的影响可忽略不计。然而60分钟后，因过度拥挤或部分降解导致的电流响应下降，降低了电子转移并降低了测量信号。在延长杂交时间时观察到的电流差（ΔI）下降主要归因于表面过度拥挤和界面空间位阻。由于PNA探针的中性肽骨架，探针与DNA靶标之间的静电排斥被最小化，导致极高的杂交效率。虽然这对灵敏度有利，但过长的杂交时间可导致大片段未断裂基因组DNA在传感界面积累。当这些庞大的带负电DNA双链体的表面密度超过最佳阈值时，会形成致密、空间拥挤的分子层。
【数据】杂交时间范围：15–90min；最佳范围：30–45min（方法部分确定）
#### 3.2.5 ML模型训练
使用AutoGluon包对优化参数进行多变量分析，以建模制备变量（输入：SWCNT浓度、PNA浓度、施加电位、杂交时间）与所得电流响应之间的复杂关系。AutoGluon使用其自动化排行榜系统评估了20多种ML算法，模型性能使用决定系数（R²）和均方根误差（RMSE）评估。图4A展示了使用原始实验数据集从排行榜中识别出的最佳模型的奇偶校验图，图4B展示了相同建模方法应用于增强数据集后的性能。通过自助法进行数据增强显著提高了模型鲁棒性，表现为更高的相关系数（R² = 0.868）和更低的预测误差。
【数据】原始数据模型：R²=0.808，RMSE=1.017；增强数据模型：R²=0.868，RMSE=0.845
3.3 PNA生物传感器的分析性能
【数据】线性范围：至20ng/μL；R²=0.9646；回归方程：y=−0.2926x+11.485；检出限：0.3ng/μL；稳定性：2周
讨论与解读
本研究成功构建了机器学习优化的PNA电化学生物传感器平台。SWCNT与PNA在丝网印刷电极上的协同整合，实现了增强的电导率和优异的核酸亲和力。该设计获得低至0.3 ng/μL的检出限，覆盖了监管阈值范围。机器学习策略系统优化了制备参数与分析条件，大幅简化开发流程并降低时间和成本。传感器展现出优异的重复性和两周内的显著稳定性，在实际加标食品和水基质中表现出可靠的回收率。与已发表的其他传感器相比，本原型在设计性能与ML应用方面具有明显特色。据作者所知，这是机器学习引导的PNA电化学生物传感器用于病原体检测的首次报道。
编译者解读
从合成生物学应用视角看，本研究的核心价值在于将“试错式”传感器开发转变为“数据驱动式”优化——AutoGluon框架在仅60个实验数据点的情况下，借助自助法增强和SHAP可解释分析，既找到了最优参数组合，又厘清了各因素对信号的贡献方向。这种“少实验+强计算”的范式对生物传感器领域的快速迭代具有方法论启示。PNA探针的中性骨架赋予其超越DNA探针的杂交效率和特异性，与纳米材料增敏策略形成良好互补。局限在于目前检测对象仅为纯培养基因组DNA，面向实际食品样本中活菌定量仍需整合前处理与信号放大策略；此外，ML模型的外部泛化能力尚需更多批间数据验证。该平台若与微流控或便携式恒电位仪整合，有望成为现场食品安全监测的实用工具。
参考来源
Sakdaphetsiri K. PNA/SWCNT hybrid electrochemical platform optimized by machine learning for species-specific quantification of Bacillus cereus. Bioelectrochemistry, 2026. DOI: 10.1016/j.bioelechem.2026.109306
DOI: 10.1016/j.bioelechem.2026.109306