来源：Sensitivity studies and optimization of an impedance-based biosensor for point-of-care applications（Biosensors and Bioelectronics: X）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
COVID-19大流行凸显了即时检测（POC）生物传感器的重要性。本研究系统探讨了叉指电极（IDE）间距与阻抗生物传感器灵敏度之间的关系，通过三维COMSOL模型仿真发现电极内间隙与灵敏度呈单一线性相关，并据此制备了3 μm、4 μm和5 μm三种电极间隙的原型芯片。实验以人抗SARS-CoV-2单克隆抗体为模型，验证了3 μm间隙设计可检测低至50 ng/mL的抗体浓度，为通过电极几何优化提升生物传感器检测限提供了基础方法。
研究背景
COVID-19大流行凸显了开发用于疾病检测的即时检测（POC）生物传感器的重要性。基于电化学、光学和机械方法的生物传感器已在细胞计数、生物分子捕获、抗原检测和DNA测序等多个领域得到应用。尽管机械和光学类生物传感器具备超高灵敏度，但制造难度大、环境操作条件苛刻、组件昂贵等缺点限制了其在POC检测中的应用。先进芯片实验室技术的发展为低成本、快速、现场电化学生物传感提供了契机。大多数电化学生物传感器基于电极环境性质的变化——靶标生物分子的存在、化学反应或电场扰动会与外部电场相互作用，引起电流、电位、阻抗和电荷的偏移，这些变化可通过不同类型的电分析方法进行测量。
研究方法
2.1 实验材料
磷酸盐缓冲液（PBS 10X，pH = 7.4）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、4-吗啉乙磺酸（MES）、巯基十一烷酸（MUA）、三水合氯化金（III）、二水合柠檬酸三钠、聚乙二醇甲基醚硫醇（PEG）和乙基碳二亚胺（EDC）购自Sigma-Aldrich。(3-氨丙基)三乙氧基硅烷、人抗SARS-CoV-2单克隆抗体和重组蛋白G购自Thermo Fisher Scientific。聚乙烯醇（PVA）购自Alfa Aesar。SYLGARD™ 184硅弹性体套件购自Dow。SARS-CoV-2刺突蛋白由加拿大食品检验局国家外来动物疾病中心（加拿大温尼伯）提供。阳性和阴性COVID-19血清样本由加拿大阿尔伯塔省埃德蒙顿的Alberta Precision Laboratories提供。
【数据】PBS浓度：10X；pH：7.4；GNP直径：约18 nm；刺突蛋白浓度：0.1 mg/mL
2.2 仪器设备
Evolution™ 60S紫外-可见分光光度计（Thermo Fisher Scientific）；Zetasizer Ultra光散射系统（Malvern Panalytical）；MFIA 500kHz/5 MHz阻抗分析仪精密LCR表（Zurich Instruments）；SP-200便携式恒电位仪电化学工作站（BioLogic）。
【数据】阻抗分析仪频率范围：500kHz/5 MHz；原文未详述更多仪器参数
2.3 芯片制备
IDE芯片在硼硅酸盐玻璃基底上加工，基底直径为4英寸、厚度为1 mm。采用双层剥离图案化工艺，通过精密光刻工艺图案化金电极。基底先在新鲜的食人鱼溶液（硫酸与过氧化氢体积比3:1）中清洗15分钟。随后，通过500 rpm旋涂10秒、随后3000 rpm旋涂40秒的方式将LOR 5B光刻胶（MicroChem Corp.）涂布到基底上，最后在150 °C下烘烤5分钟。第二层光刻胶AZ 1512（EMD Performance Materials Corp.）重复上述流程——先在500 rpm下旋涂10秒，再升至5000 rpm旋涂40秒，随后在100 °C下烘烤90秒。之后，基底使用先进的Heidelberg MLA150无掩模光刻机（Heidelberg Instruments）在405 nm波长、105 mJ/cm²强度下曝光。光刻胶层随后在AZ显影液1:1（EMD Performance Materials Corp.）和MF-319（Kayaku Advanced Materials Inc.）中显影以刻蚀出电极特征。接下来，采用电子束物理气相沉积（EBPVD），在基底上依次沉积10 nm铬层和70 nm金层。选择金作为电极材料是因为其高生物相容性和制造过程中的易操作性。电极成型通过Remover PG（Kayaku Advanced Materials Inc.）中的剥离工艺完成，随后用丙酮、异丙醇和去离子（DI）水彻底清洗。共制造了六块芯片。
【数据】基底直径：4英寸；基底厚度：1 mm；食人鱼溶液比例：3:1（硫酸:过氧化氢）；清洗时间：15 min；LOR 5B旋涂：500 rpm/10 s + 3000 rpm/40 s；烘烤：150°C/5 min；AZ 1512旋涂：500 rpm/10 s + 5000 rpm/40 s；烘烤：100°C/90 s；曝光波长：405 nm；曝光强度：105 mJ/cm²；铬层厚度：10 nm；金层厚度：70 nm；芯片总数：6块
2.4 金纳米颗粒的合成与表面表征
本研究中使用的GNP直径约为18 nm。这些GNP通过回流含三水合氯化金（III）和柠檬酸三钠二水合物的溶液合成。GNP的尺寸取决于回流时间，并使用Malvern Zetasizer Ultra多角度动态光散射系统测量。GNP随后用羧基进行功能化。制备聚乙二醇甲基醚硫醇和MUA的混合溶液并加入GNP中，搅拌过夜。混合溶液随后多次离心并重悬于Milli-Q水中，直至OD达到50。另配制EDC和NHS溶于MES缓冲液的混合溶液，加入OD 50的GNP溶液中，室温孵育。离心并在Milli-Q水中重悬后，表面功能化完成。表面表征后再次测量GNP尺寸，尺寸增加表明功能化成功。
【数据】GNP直径：约18 nm；OD值：50；搅拌时间：过夜；缓冲液：MES；孵育温度：室温
2.5 蛋白G与GNP的结合
通过超声和室温振荡将蛋白G引入GNP中以确保成功结合。随后，将含Tween 20的PBS（PBST）加入混合物中并充分涡旋。混合物再次离心，去除上清液。残余物重悬于200 μL PBS中并超声处理。通过Zetasizer Ultra光散射系统监测GNP的尺寸变化，孵育后尺寸可观察到的增大表明结合成功。
【数据】重悬体积：200 μL PBS；缓冲液：PBST；孵育温度：室温；检测方法：Zetasizer Ultra光散射系统
2.6 SARS-CoV-2刺突蛋白与IDE芯片表面的结合
IDE芯片依次在丙酮、IPA和DI水中超声清洗。随后对芯片表面进行氧等离子体处理，再进行APTES孵育。之后芯片在乙醇中超声处理。最后将聚二甲基硅氧烷（PDMS）盖板贴附到制备好的芯片上。配制浓度为0.1 mg/mL的SARS-CoV-2刺突蛋白溶液，与EDC和NHS在MES缓冲液中混合以激活。室温孵育15分钟后，将激活溶液分配到每个PDMS孔中。整个芯片在37 °C恒温孵育1小时。孵育后，芯片依次用PBST洗涤一次、PBS洗涤三次以去除未结合分子。最后，将1% PVA溶液（溶于PBS）加入每个孔中，芯片再次在37 °C孵育1小时，达到所需激活水平（图1）。
【数据】刺突蛋白浓度：0.1 mg/mL；激活时间：15 min（室温）；孵育温度：37°C；孵育时间：1 h；洗涤：PBST×1 + PBS×3；PVA浓度：1%（PBS配制）；二次孵育：37°C/1 h
2.7 SARS-CoV-2 IgG与刺突蛋白的首次结合及GNP-G与IgG的第二次结合
SARS-CoV-2 IgG用PVA溶液稀释至不同浓度（500 ng/mL、250 ng/mL、100 ng/mL和50 ng/mL）。随后将IgG稀释液加入每个孔中，在37 °C孵育1小时。孵育后，芯片用PBST洗涤一次、PBS洗涤三次以去除未结合分子。GNP-G稀释至OD 0.1，加入每个孔中，在37 °C孵育1小时。孵育后，芯片用PBST洗涤一次、PBS洗涤三次（图1）。
【数据】IgG浓度梯度：500、250、100、50 ng/mL；孵育温度：37°C；孵育时间：1 h；洗涤：PBST×1 + PBS×3；GNP-G OD值：0.1；GNP-G孵育：37°C/1 h
2.8 阻抗测量与分析
每块IDE芯片包含8个通道，通过我们前期研究中开发的阻抗测量装置进行阻抗检测（图S2）。该系统向IDE输入10 mV信号，采集100 Hz至1 MHz范围内的阻抗谱输出。图2B展示了捕获靶标生物分子时系统的简化等效电路，由以下方程描述：
Z = (R_s + Z_t + 2jZ_dl) ‖ C_e
其中Z为系统总阻抗，R_s为环境缓冲液电阻，Z_dl为双电层阻抗，Z_t为靶标生物分子阻抗，C_e为电极电容。实验中，当更多生物分子结合到电极间的玻璃表面时，Z_t发生改变。阻抗测量在mAb和GNP-G结合后进行，测量前对IDE芯片进行清洗以去除残留物。相对阻抗变化量化公式为：
Z = (Z_mAb − Z_GNP-G) / Z_mAb × 100%
其中Z_mAb和Z_GNP-G分别为mAb结合后和GNP-G结合后的总阻抗值。
【数据】输入信号：10 mV；频率范围：100 Hz–1 MHz；通道数：8；计算公式：Z = (ZmAb − ZGNPG)/ZmAb × 100%
2.9 数据分析
所有统计分析均使用GraphPad Prism 10软件进行。整个实验过程中，所有数据均进行三次重复测量，取3次独立实验的平均值。标准偏差用于表示测量误差。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）后进行Tukey多重比较检验进行显著性差异检验（ns p > 0.05，*p < 0.05，p < 0.001，**p < 0.0001）。
【数据】重复次数：3次独立实验；统计方法：two-way ANOVA + Tukey多重比较；显著性阈值：ns p > 0.05，*p < 0.05，p < 0.001，**p < 0.0001
研究结果
3.1 COMSOL仿真
使用COMSOL软件中AC/DC模块和电极的显式几何参数预测了IDE芯片的电学特性。采用三维模型模拟电解质溶液与电极的相互作用。该研究旨在数值化检验一系列不同设计配置下模型中阻抗的变化，目标在于理解蛋白引入系统前后阻抗的变化。如图2B所示，考察了电极宽度、电极间隙和电极高度三个参数。电极宽度和电极间隙从2 μm逐步调整至6 μm，电极高度则从50 nm考察至90 nm。对应每个尺寸变量，建立了两个独立模型——一个包含靶标蛋白，另一个作为对照不含蛋白（如图2A所示）。两个模型的显著特征包括浸泡在PBS电解质溶液中的双金电极。PBS的电导率用电导率仪测得为5.56E-6，介电常数值为80。为建立概念验证，采用直径180 nm的均匀球形结构作为蛋白替代物。该代表性蛋白的介电常数设定为3.23，这是从超过15万个蛋白数据库中汇总的平均值。通过维持蛋白单元总数与电极间隙长度之间的固定比例来模拟一致的蛋白浓度。仿真进一步利用周期性边界条件来考虑多个电极的效应，从而模拟无限数量的电极对。对每个模型，通过跨模型的综合体积积分导出电势和电流密度范数。所得阻抗通过复电压与复电流之比计算。电极设计中的灵敏度以阻抗变化百分比表示，遵循以下方程：
S = |ΔZ/Z_empty| × 100% = |(Z_protein − Z_empty)/Z_empty| × 100%
其中Z_protein和Z_empty分别代表检测体积中蛋白-PBS基质和仅含PBS溶液的复阻抗，ΔZ代表蛋白存在引起的阻抗偏移。图2C展示了可变尺寸参数对灵敏度的影响。所得数据表明，仅在电极间隙的情况下，电极尺寸的改变才会引起阻抗响应的显著变化——阻抗偏移与电极间隙之间呈现明显的线性关系。随着电极间隙增大，阻抗变化百分比相应减小。阻抗响应随电极高度变化呈现看似随机的模式，这种缺乏清晰模式的现象表明电极高度与灵敏度不相关。对电极宽度模型的检验显示，当电极宽度恰好为2 μm时，阻抗出现显著偏移；相反，电极宽度的其他变化产生了相当类似的阻抗变化。对图3C的详细观察显示，在3 μm–6 μm范围内阻抗变化微小，无明显趋势。可以假设，当电极宽度减小到某一阈值（仿真中确定为2 μm）以下时，灵敏度会出现急剧增加。
基于这些结果，本文聚焦于理解灵敏度与电极间隙宽度的关系。电极高度选择60 nm，因为这在剥离工艺中相对易于制造。电极宽度设定为4 μm，以避免较小宽度常见的潜在制造缺陷。电极间隙分别选定为3 μm、4 μm和5 μm。
【数据】PBS电导率：5.56E-6；PBS介电常数：80；蛋白替代物直径：180 nm；蛋白介电常数：3.23；电极宽度扫描范围：2–6 μm；电极间隙扫描范围：2–6 μm；电极高度扫描范围：50–90 nm；选定电极高度：60 nm；选定电极宽度：4 μm；选定间隙：3、4、5 μm
3.2 纳米制造缺陷对芯片质量和性能的影响评估
纳米制造过程中不可避免地会出现缺陷，可能破坏电极连通性，从而显著影响阻抗结果。为量化芯片质量的差异，在环境空气条件下对裸芯片进行了阻抗测试。考虑到同一芯片内各孔可能具有均质性，选取了来自不同芯片批次的十个孔。没有任何电极指连接的空白芯片以电容方式工作。每个孔在10 kHz至1 MHz频率范围内的阻抗测量结果见表S1。值得注意的是，间隙尺寸较小的芯片表现出较高的标准偏差。这些发现为初始仿真提供了实证支持——仿真曾假设间隙较小的芯片因其更高的灵敏度，缺陷对阻抗的影响会更显著。就相对标准偏差（RSD）而言，在关注频率区域内记录的最大值分别为：3 μm间隙2.06%、4 μm间隙1%、5 μm间隙0.75%。这一趋势表明所有芯片的质量具有高度一致性。因此可以推断，缺陷对整体性能的影响极小，从而证实了制造工艺的质量和可靠性。
【数据】测试频率范围：10 kHz–1 MHz；RSD最大值：3 μm间隙2.06%、4 μm间隙1%、5 μm间隙0.75%；选取孔数：10个
3.3 通过阻抗分析检测COVID-19的可行性验证
在前期研究中，我们的生物传感器已被用于区分COVID-19阳性血清样本。阻抗变化阈值设定为10%（10%为区分阳性和阴性血清样本的阈值；高于10%为阳性，低于10%为阴性），考虑到阴性血清样本的阻抗偏移在2%–8%范围内。为验证该方法的可重复性和可靠性，用血清样本对相同流程进行了进一步测试。图3A和B分别展示了COVID-19阳性和阴性样本分析的阻抗结果。不出所料，阴性血清样本表现出极小的阻抗偏移，而加入GNP-G后观察到显著的阻抗变化。图3C对阳性和阴性血清之间的阻抗偏移进行了比较分析，进一步印证了先前的发现。
该流程还通过荧光检测和SEM进行了验证，如图3D所示。在SEM图像中，GNP呈现为白色圆圈。它们与蛋白G的结合降低了其导电性，从而影响了SEM图像的清晰度。尽管如此，不同血清样本中mAb浓度的差异给灵敏度分析带来了挑战。因此，采用商业人抗SARS-CoV-2 mAb以确保可控的浓度水平。这种方法允许间接调控mAb与刺突蛋白的结合亲和力比例。图3E展示了不同mAb浓度下的荧光检测结果，显示结合率随mAb浓度降低而出现差异，符合预期。
【数据】阳性判定阈值：阻抗变化>10%；阴性样本阻抗偏移范围：2%–8%
3.4 递减IgG浓度下的EIS检测
还测试了阻抗响应对递减的人抗SARS-CoV-2 mAb浓度的灵敏度。每个孔饱和加入36 μL 10 μM PBS溶液，在引入GNP-G前后均进行阻抗测量。为确定显著的灵敏度变化，在特定频率节点（100 kHz、68 kHz和46 kHz）下进行检测。图4展示了在36 μL PBS溶液中、浓度为1 μM条件下，电极间隙分别为（A）3 μm、（B）4 μm和（C）5 μm时，GNP-G存在下在46 kHz、68 kHz和100 kHz频率下的阻抗响应（*p < 0.05，p < 0.001，**p < 0.0001）。
图5展示了在mAb浓度为50 ng/mL时，三种间隙几何设计（3 μm、4 μm和5 μm）在（A）100 kHz、（B）68 kHz、（C）46 kHz频率下的灵敏度比较。变异系数为（A）4.712%、23.25%、3.489%；（B）5.074%、29.23%、8.101%；（C）5.054%、27.55%、1.（原文截断）。
【数据】PBS体积：36 μL；PBS浓度：10 μM；测试频率：100 kHz、68 kHz、46 kHz；mAb浓度：50 ng/mL；变异系数（100 kHz）：4.712%、23.25%、3.489%；变异系数（68 kHz）：5.074%、29.23%、8.101%；变异系数（46 kHz）：5.054%、27.55%
讨论与解读
三维COMSOL模型的仿真结果突出了电极间隙与IDE生物传感器阻抗灵敏度之间的线性关系。本研究实证证明了缩小间隙可增强生物传感器灵敏度。基于这些见解，制备了三种电极间隙分别为3 μm、4 μm和5 μm的IDE芯片设计。为展示适用性，研究人抗SARS-CoV-2 mAb与SARS-CoV-2刺突蛋白的策略性固定化以及随后与GNP-G的结合。实验结果不仅证实了最初的仿真发现，还突出了3 μm设计的优越灵敏度——能够检测低至50 ng/mL的mAb浓度。这种检测阈值的鲜明对比强调了电极间隙尺寸对生物传感器性能的关键影响。总体而言，这项研究不仅验证了理论模型，还为高灵敏度IDE生物传感器的设计设定了基准。此外，电极设计的优化也为提升生物传感器定量限（LOQ）提供了有前景的途径，为POC诊断技术带来显著进步。
编译者解读
该研究最值得称道之处在于将仿真预测与实验验证紧密结合——先通过COMSOL模型锁定电极间隙这一关键几何参数，再有针对性地制备三种间隙的原型芯片进行实证，避免了盲目的试错式优化。3 μm间隙设计在50 ng/mL浓度下的检测能力，为低成本POC设备的高灵敏度化提供了清晰的几何优化路径。不过，研究目前以SARS-CoV-2抗体为模型体系，电极间隙缩小带来的灵敏度增益是否在复杂临床基质中依然稳健，以及进一步缩小至亚微米级别是否会因制造缺陷或扩散限制而出现收益递减，仍值得后续探索。该优化策略具备跨平台通用性，有望推广至其他电化学生物传感体系。
参考来源
Jiang T. Sensitivity studies and optimization of an impedance-based biosensor for point-of-care applications. Biosensors and Bioelectronics: X, 2024. DOI: 10.1016/j.biosx.2024.100479
DOI: 10.1016/j.biosx.2024.100479