来源：Optimized aptamer-based next generation biosensor for the ultra-sensitive determination of SARS-CoV-2 S1 protein in saliva samples（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
COVID-19由SARS-CoV-2病毒引起，迅速席卷全球。病毒入侵细胞的关键蛋白——S1蛋白，成为检测与治疗的核心靶点。本研究利用一种名为"Optimer"的优化适体（OPT），结合一次性铅笔石墨电极（PGE），构建了无需标记的电化学阻抗生物传感器。在缓冲液和人工唾液中，检测限分别低至8.80 ag/mL和2.01 ag/mL，全程仅需25分钟。该传感器无需抗体、无需电极表面化学修饰，为唾液样本中病毒蛋白的快速筛查提供了新选项。
研究背景
适体是通过指数富集配体系统进化技术（SELEX）合成的三维人工短链寡核苷酸，能以高亲和力和特异性结合靶标。按化学本质可分为DNA/RNA适体与肽适体两类。适体可在特定区域进行结构修饰以增强与靶标的结合，且能通过变性/复性循环实现固定化生物分子的再生。以适体为识别元件的生物传感器称为适体传感器。尽管大多数抗体类传感器可实现高稳定性的蛋白识别，但抗体的稳定化与修饰性能不足构成其短板。相较之下，适体因易于生产、适用面广、可修饰性强、保质期长等优势，已成为抗体的优选替代方案。此外，适体传感器凭借精准、快速、低成本的检测能力，被广泛应用于靶标识别、药物发现、诊断与治疗等领域。本研究采用经优化的适体（即"Optimer"，OPT），构建新一代电化学生物传感器，用于唾液中SARS-CoV-2 S1蛋白的阻抗检测。
研究方法
2.1 化学试剂与仪器
所有电化学测量均使用配备FRA32M模块的AUTOLAB PGSTAT302恒电位仪及NOVA 1.11.1软件（Eco Chemie，荷兰）。电化学阻抗谱（EIS）与循环伏安法（CV）测量在法拉第屏蔽笼（Eco Chemie，荷兰）内完成。所有测量采用传统三电极系统：一次性PGE为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl/KCl（3 M，BAS，Model RE-5B，W. Lafayette，美国）为参比电极。
S1蛋白特异性优化适体（OPT）购自Aptamer Group（英国）。该公司开发、优化并申请了针对SARS-CoV-2 S1蛋白的特异性适体专利。建议使用结合缓冲液配制OPT。SARS-CoV-2 S1蛋白购自Sino Biological，以250 μg/mL的浓度溶于超纯水制备储备液，保存于−80 °C。S1蛋白稀释液以磷酸盐缓冲液（PBS，50 mM，pH 7.40）配制。MERS-CoV S1蛋白（MERS）购自Sino Biological，以150 μg/mL溶于超纯水制备储备液，−80 °C保存，稀释液以PBS（50 mM，pH 7.40）配制。流感血凝素（HA）肽购自Sigma-Aldrich，以5 mg/mL溶于超纯水制备储备液，−20 °C保存，稀释液以PBS（50 mM，pH 7.40）配制。N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、牛血清白蛋白（BSA）均购自Sigma-Aldrich。所有化学品均为分析纯级，来自全球供应商。所有水溶液均以Milli-Q超纯水新鲜配制。
【数据】S1蛋白储备液浓度：250 μg/mL（超纯水，−80 °C）；MERS储备液浓度：150 μg/mL（超纯水，−80 °C）；HA储备液浓度：5 mg/mL（超纯水，−20 °C）；PBS：50 mM，pH 7.40；参比电极：Ag/AgCl/KCl（3 M）
2.2 实验流程
基于优化适体（OPT）的电化学生物传感器用于S1蛋白测定的制备流程如下。
第一步，PGE的电化学活化。在醋酸缓冲液（ABS，0.5 M，pH 4.80）中，施加+1.2 V电压处理30 s完成PGE的电化学活化。随后，电极在室温下晾干备用。
第二步，S1蛋白与OPT在溶液相中相互作用。取25 μL OPT溶液与25 μL S1蛋白溶液加入微量离心管中混合，在400 rpm转速下作用5 min。
第三步，固定化。将电化学活化后的PGE浸入发生OPT-S1相互作用的微量离心管中，孵育15 min以完成固定化步骤。随后，电极以PBS冲洗5 s，以去除未结合的物质。
第四步，EIS测量。按流程完成上述步骤后，在法拉第屏蔽笼中进行EIS测量。测量频率范围为100,000–0.05 Hz，使用含0.1 M KCl的PBS配制的1 mM氧化还原探针溶液。阻抗测量在开路电位（零V vs. OCP）及10 mV_RMS交流电位条件下进行。
EIS结果采用等效电路模型（Randles电路）拟合。该电路由溶液电阻（Rs）、常相位角元件（C）、电荷转移电阻（Rct）和Warburg阻抗（W）组成。半圆对应Rct值。所有Nyquist图均以拟合形式呈现。
【数据】活化条件：ABS 0.5 M（pH 4.80），+1.2 V，30 s；OPT与S1各25 μL混合；相互作用：400 rpm，5 min；固定化：15 min；PBS冲洗：5 s；EIS频率范围：100,000–0.05 Hz；探针：1 mM [Fe(CN)6]³⁻/⁴⁻ + 0.1 M KCl；AC电位：10 mV_RMS
2.3 选择性研究
所开发生物传感器的选择性研究以HA和MERS蛋白为干扰物进行。选择性实验遵循与上述相同的实验方法。
【数据】干扰物：HA肽、MERS-CoV S1蛋白；方法：与上述流程相同（原文未详述额外参数）
2.4 人工唾液样本中的应用
为验证优化适体生物传感器在真实样本中对S1蛋白测定的适用性，在人工唾液培养基中进行了一组实验。人工唾液首先按文献[32]方法配制。
称取4 mg/mL尿素、4 mg/mL猪胃黏蛋白、0.6 mg/mL磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）、0.3 mg/mL碳酸氢钠（NaHCO₃）、0.6 mg/mL无水氯化钙（CaCl₂）、0.4 mg/mL氯化钾（KCl）和0.4 mg/mL氯化钠（NaCl），溶于超纯水中。将溶液置于超声浴中20 min以辅助溶解，确保溶液均一。随后以0.1 M氢氧化钠（NaOH）溶液将pH调至7.2。配制好的人工唾液于4 °C保存备用。
人工唾液样本以PBS按不同比例稀释。在稀释后的人工唾液中配制不同浓度的S1蛋白。随后按前述流程进行EIS测量。
图1展示了基于优化适体的新一代生物传感器用于S1蛋白阻抗检测的示意流程。
【数据】人工唾液组分及浓度：尿素4 mg/mL、黏蛋白4 mg/mL、Na₂HPO₄ 0.6 mg/mL、NaHCO₃ 0.3 mg/mL、CaCl₂ 0.6 mg/mL、KCl 0.4 mg/mL、NaCl 0.4 mg/mL；超声溶解：20 min；pH调至7.2（0.1 M NaOH）；保存：4 °C
研究结果
3.1 基于OPT的阻抗生物传感器开发的条件优化
采用EIS和CV两种电化学技术，考察了化学活化步骤中使用的共价结合剂（CA）对OPT在电极表面固定化的影响。本研究选用EDC/NHS作为共价交联剂对，因为该组合已在此前多种生物传感器的开发中得到应用[33–36]。通过EDC/NHS共价偶联剂对，电极表面的羧基被活化，从而实现生物分子在电极表面的高效固定化。为此，本研究考察了CA对OPT在电极表面结合的影响。
PGE浸入5 mM EDC/8 mM NHS溶液[37]中保持1 h。将30 nM OPT固定化到电极表面1 h后[15]，在1 mM氧化还原探针溶液中进行EIS测量。在存在靶标S1蛋白的情况下，电极浸入80 ng/mL S1蛋白溶液中30 min。Lasserre等人[15]的研究中开发了用于刺突蛋白检测的优化适体传感器，其优化适体与80 ng/mL刺突蛋白相互作用30 min。因此，本研究初期实验沿用了这一相互作用条件。
在上述对比实验中，分别在存在和不存在EDC/NHS溶液的情况下进行平行实验，以考察其对OPT在电极表面结合及与S1蛋白相互作用后生物传感器响应的影响。结果汇总于表S1和表S2。
经CA活化电极表面后，固定SARS-CoV-2 S1特异性OPT的电极相较于对照组，平均Rct值（n = 3）增加了2.91倍。在OPT与S1蛋白相互作用后，平均Rct值（n = 3）较对照组增加了7.19%。
相比之下，在不使用EDC/NHS、仅经电化学活化处理的PGE表面固定OPT后，平均Rct值（n = 3）较对照组增加了6.61倍。OPT与S1蛋白相互作用后，平均Rct值（n = 3）较对照组增加了24.39%。
与对照组相比，不使用EDC/NHS的实验获得了比使用EDC/NHS时更高的Rct值增幅。
此外，根据式(1)[38]计算了PGE和PGE/EDC-NHS的表观覆盖率（θ_IS^R）：
式(1)：θ_IS^R = 1 − (R_ct^a / R_ct^b)
其中R_ct^a为OPT固定化前的电荷转移电阻，R_ct^b为OPT固定化后的电荷转移电阻。经计算，PGE和PGE/EDC-NHS的表观覆盖率（θ_IS^R）分别为0.85和0.66。数值的增加证明OPT在PGE表面的结合能力高于PGE/EDC-NHS表面。基于上述结果可以得出结论：在不使用EDC/NHS的情况下，OPT能更有效地结合到PGE表面。
此外，使用2.5 mM氧化还原探针通过CV技术考察了CA对生物传感器响应的影响（图S1）。CV测量在−0.5 V至1 V电位范围内、以50 mV/s扫描速率进行。经EDC/NHS活化电极表面后，OPT固定化后电流较对照组下降了38.85%（表S3）。仅经电化学活化电极表面后进行OPT固定化时，电流较对照组下降了51.51%（表S4）。CV结果表明，不经过CA活化步骤的PGE获得了更高的电流降幅。
对PGE和PGE/EDC-NHS进行了场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）分析，图像见图S2。数据显示，CA活化未引起电极表面的任何变化。如文献[39]所述，EDC-NHS化学法通过功能化纳米材料来促进亲和探针在表面的固定化。而本研究在PGE表面进行，未施加任何材料修饰。PGE表面经电化学方法预处理后，表面的-COOH基团被活化。适体通过5′端标记的-NH₂基团与电极表面的-COOH基团相互作用而结合。此外，EDC-NHS交联可能导致适体沉淀，此现象已有文献报道[40]。因此，本研究得出结论：在OPT固定化步骤之前无需以EDC/NHS活化电极表面。
为确定优化适体的最佳浓度，将不同浓度的OPT（0.3、3、30和300 nM）固定化到电极表面，随后在电极表面与80 ng/mL S1蛋白相互作用。%变化值根据OPT与S1蛋白相互作用前（R_ct^OPT）和后（R_ct^OPT+S1蛋白）获得的Rct值计算，结果见表S5。在30 nM OPT存在下获得了最高的Rct值增幅（24.39%），且重现性最佳，因此选择30 nM作为本研究中OPT的最佳浓度。
接下来考察了BSA对优化适体生物传感器响应的影响。许多研究采用包括BSA、乙醇胺、酪蛋白等在内的多种物质进行电极表面封闭[41–43]。由于BSA是其中最常用的封闭剂[41,44–49]，本研究考察了以BSA封闭电极表面对OPT生物传感器响应的影响。
优化适体固定化后，参照早期研究的封闭条件[50,51]，以0.1% BSA封闭电极表面1 h。随后在电极表面进行OPT与80 ng/mL S1蛋白的相互作用，并进行EIS测量。Ferreira等人[50]开发了用于检测乳腺癌生物标志物HER2的适体阻抗生物传感器，其丝网印刷电极表面以0.1% BSA封闭。Samie和Arvand[51]在孕酮检测电化学适体传感器的研究中同样采用0.1% BSA封闭电极表面。因此，本研究以0.1% BSA封闭电极表面，考察封闭剂对生物传感器响应的影响。
以BSA封闭电极表面并与S1蛋白孵育后，EIS测量中Rct值增加了15.92%（表S6）。相反，不进行任何封闭步骤、直接进行S1蛋白孵育时，Rct值增加了25.73%，且重现性更佳（表S7）。结果表明，不进行电极表面封闭时，S1蛋白与优化适体的相互作用更为有效，S1蛋白孵育后获得更高的Rct值增幅。Lasserre等人[15]的研究结果也支持了本优化适体传感器所获得的结果。由此得出结论：本研究中无需使用封闭剂来封闭电极表面。
图2：(A) OPT与S1蛋白在缓冲液中、浓度为10¹ ag/mL–10⁶ ag/mL范围内相互作用前后的Nyquist图。(B) 缓冲液中S1蛋白阻抗测定的校准曲线。
图3：10 fg/mL浓度的S1蛋白/MERS/HA选择性研究中获得的平均Rct值柱状图（n = 3）。
图4：(A) OPT与S1蛋白在稀释人工唾液（1:20）中、浓度为10¹–10⁵ ag/mL范围内相互作用前后的Nyquist图。(B) 稀释人工唾液（1:20）中S1蛋白阻抗测定的校准曲线。
图5：(A) 0.1 fg/mL、(B) 10 fg/mL、(C) 100 fg/mL浓度的S1蛋白/MERS/HA在稀释人工唾液（1:20）中制备的选择性研究平均Rct值柱状图（n = 3）。
【数据】CA活化对比：EDC/NHS存在时Rct增幅2.91倍（OPT固定化）/7.19%（S1相互作用）；无EDC/NHS时Rct增幅6.61倍（OPT固定化）/24.39%（S1相互作用）；表观覆盖率：PGE为0.85，PGE/EDC-NHS为0.66；CV电流降幅：有CA为38.85%，无CA为51.51%；最佳OPT浓度：30 nM；BSA封闭后Rct增幅15.92%，无封闭为25.73%；S1蛋白浓度：80 ng/mL；EDC/NHS浓度：5 mM/8 mM，处理1 h；OPT固定化时间：1 h；S1相互作用时间：30 min；CV扫描速率：50 mV/s
讨论与解读
本研究设计了针对SARS-CoV-2 S1蛋白的优化适体阻抗生物传感器，并实现了选择性、灵敏检测。该OPT生物传感器首次采用一次性PGE电极，实现了超灵敏、选择性、一次性、低成本、易操作的无标记阻抗检测。包括S1蛋白与OPT相互作用、固定化到PGE表面及EIS测量在内的全流程总时间为25分钟。S1蛋白在溶液相中与OPT相互作用后固定于PGE表面，EIS测量在1 mM [Fe(CN)₆]³⁻/⁴⁻氧化还原探针溶液中进行。缓冲液中10¹–10⁶ ag/mL浓度范围内LOD为8.80 ag/mL（0.11 aM）。选择性研究以MERS和HA为干扰物完成。人工唾液介质中10¹–10⁵ ag/mL浓度范围内LOD为2.01 ag/mL（0.025 aM），并在该介质中验证了选择性。与早期研究相比（表1），该OPT阻抗生物传感器在宽浓度范围内实现了更低的检测限。
【编译者解读】该研究最值得关注的设计思路在于"溶液相相互作用+电极表面固定化"的两步策略，以及彻底跳过EDC/NHS化学修饰和BSA封闭步骤——这不仅简化了流程，还意外获得了更高的信号响应，说明适体构象在自由溶液中的靶标识别效率优于表面受限状态。从应用角度看，25分钟全流程、一次性电极和飞克级检测限使该平台具备即时检测的潜力。但需注意，人工唾液与实际临床唾液在成分复杂度上仍有差距，且该研究未报告批间重现性变异系数，后续临床样本验证仍是必经之路。适体传感器绕开了抗体的冷链与批次稳定性问题，这类"无修饰表面"设计对资源有限环境中的病原体监测具有实际意义。
参考来源
Erdem A. Optimized aptamer-based next generation biosensor for the ultra-sensitive determination of SARS-CoV-2 S1 protein in saliva samples. International Journal of Biological Macromolecules, 2024.
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2024.136233
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2024.136233