来源：Development and application of a CRISPR-dCpf1 assisted multiplex gene regulation system in Bacillus amyloliquefaciens LB1ba02（Microbiological Research）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
解淀粉芽孢杆菌LB1ba02是公认安全（GRAS）的工业产酶菌株，但其限制修饰系统导致外源质粒转化效率极低，CRISPR工具开发严重滞后。本研究首次在该菌株中适配了核酸酶失活突变体dCpf1（D917A），建立了CRISPR/dCpf1辅助的多基因调控系统，实现了最高73.9倍的基因抑制效率和1.8倍的转录激活效果，并通过crRNA阵列同时激活secE、secDF和prsA三个基因的表达。进一步构建Sec分泌途径crRNA激活文库，筛选出7种可促进胞外蛋白分泌的蛋白，其中SecA与CsaA联合激活时分泌效率提升达9.8倍。
研究背景
解淀粉芽孢杆菌LB1ba02与枯草芽孢杆菌近缘，但作为高效表达宿主尚未被充分开发。该菌存在限制修饰系统——已确认的II型限制修饰系统识别BamHI（5′…GGATCC…3′），另有推测的IV型甲基引导限制修饰系统。从甲基化宿主（如大肠杆菌Mach1-T1）提取的质粒无法转化入解淀粉芽孢杆菌，而从去甲基化宿主（如大肠杆菌JM110或GM2163）提取的质粒则可成功转化。目前该IV型系统识别特异性甲基化位点并切割的详细机制仍不清楚。随着CRISPR技术持续发展，这一快速高效的基因组编辑工具已在多种微生物中广泛应用，但解淀粉芽孢杆菌的CRISPR工具开发仍落后于其他芽孢杆菌属菌种。
研究方法
菌株与质粒
本工作使用的所有菌株和质粒见表1。大肠杆菌Mach1-T1和枯草芽孢杆菌SCK6M用于质粒构建。含大肠杆菌复制子的质粒由Mach1-T1构建，不含大肠杆菌复制子的质粒由SCK6M构建。dam和dcm缺陷的大肠杆菌JM110用于质粒去甲基化。未经驯化的解淀粉芽孢杆菌LB1ba02作为基因操作和表达调控的宿主。
【数据】菌株：大肠杆菌Mach1-T1、枯草芽孢杆菌SCK6M、大肠杆菌JM110、解淀粉芽孢杆菌LB1ba02；原文未详述培养温度
试剂与酶
KOD One™ PCR master Mix购自东洋纺（上海）生物科技有限公司。NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning Kit购自NEB（北京）有限公司。HiPure质粒提取微型试剂盒、HiPure细菌RNA试剂盒和HiPure DNA纯化微型试剂盒购自Magen Bio（上海）有限公司。DNA-Sanger测序和引物合成由金唯智生物科技（广州）有限公司完成。Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR II和SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit购自爱博泰克生物（湖南）有限公司。其他材料购自Sigma-Aldrich生物科技（上海）有限公司。
【数据】试剂来源：TOYOBO、NEB、Magen Bio、GENEWIZ、Accurate Biotechnology、Sigma-Aldrich；原文未详述具体用量
培养基与培养条件
质粒构建和转化子鉴定在LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中进行，温度37°C、转速220 rpm，根据需要添加不同浓度抗生素（氯霉素，Cm 25 μg/mL；卡那霉素，Kan 50 μg/mL）。LB培养基也用于24孔或96孔板的高通量筛选。为诱导dCpf1蛋白表达，添加50 μM IPTG。此外，根据质粒携带的不同抗性基因，在高通量筛选过程中向培养基中添加相应的氯霉素和卡那霉素。
【数据】培养基：LB（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）；温度：37°C；转速：220 rpm；抗生素：氯霉素25 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL；IPTG：50 μM
质粒构建
骨架质粒pWSdCpf1由本课题组前期质粒pWSCas9n构建而来。dCpf1通过引物dCpf1-F/R全合成以替换Cas9n。随后，P43-DR-N23-DR表达盒通过引物DR-F/R插入SmaI位点。构建质粒pWSdCpf1-GFP-crRNA时，Pveg-GFP表达盒由引物GFP-F/R扩增并插入骨架质粒pWSdCpf1的SalI位点。为插入23 nt靶向序列，使用引物N23(GFP)-F/R进行反向PCR，PCR片段通过Infusion克隆环化。后续替换23 nt靶向序列均采用此方法。构建转录激活质粒pWSdCpf1-ω-crRNA时，解淀粉芽孢杆菌LB1ba02的内源ω亚基由引物ω-F/R扩增，随后插入骨架质粒pWSdCpf1中dCpf1的C末端。构建质粒pHTdCpf1-ω-GFP时，载体pHT01经限制性内切酶EcoRI消化，然后通过Infusion克隆与Pgrac-dCpf1-ω和P43-SPwapA-GFP表达盒连接。Pgrac-dCpf1-ω和P43-SPwapA-GFP表达盒分别由引物dCpf1-ω-F/R和SP-GFP-F/R扩增。pLBP43-DR由解淀粉芽孢杆菌LB1ba02的内源质粒pLB01改造而来。以pLB01质粒为模板，用引物pLB-F/R扩增含复制蛋白RepB和卡那霉素基因的片段，然后与P43-DR-N23-DR表达盒连接获得crRNA转录质粒pLBP43-DR。同样，新N23靶向序列的插入通过反向PCR和Infusion克隆环化完成。构建crRNA阵列质粒（如pLBP43-secA-prsA-secE）时，在引物5′端添加多个N23靶向序列和DR片段，反向扩增片段同样通过Infusion克隆环化。本工作使用的所有引物见表S2。
【数据】质粒：pWSdCpf1、pWSdCpf1-GFP-crRNA、pWSdCpf1-ω-crRNA、pHTdCpf1-ω-GFP、pLBP43-DR、pLBP43-secA-prsA-secE；内切酶：SmaI、SalI、EcoRI；PCR方法：反向PCR + Infusion克隆
crRNA文库构建
针对Sec分泌途径涉及的24个蛋白设计crRNA文库。每个基因在其TSS上游约300 bp处设计2个crRNA，共含48个crRNA。具体而言，合成含48条crRNA序列的单链引物池（表S1）。10 μM引物池分别稀释不同倍数（100×、1000×和10000×），作为模板用引物crRNA-lib-F/R扩增文库片段。扩增的文库片段通过Infusion克隆与线性化载体pLBP43-DR连接，然后转化入枯草芽孢杆菌SCK6M。从平板上收集500个转化子到含Kan的液体培养基中，37°C、220 rpm培养8小时，提取质粒文库。随机挑取10个转化子提取质粒，进行DNA测序以确认不同crRNA片段是否成功插入。
【数据】crRNA文库：24个蛋白×2个crRNA=48个crRNA；引物池浓度：10 μM；稀释倍数：100×、1000×、10000×；转化子数量：500个；培养条件：37°C、220 rpm、8 h；测序验证：10个转化子
枯草芽孢杆菌SCK6M感受态制备与转化流程
挑取枯草芽孢杆菌SCK6M单菌落接种于5 mL LB中，37°C、220 rpm培养12小时。将1%接种量转接至新鲜LB培养基继续培养，当光密度OD600达到1时加入20%木糖。37°C、220 rpm培养2–4小时后加入终浓度10%的甘油。分装100 μL感受态细胞至管中，储存于−80°C冰箱。进行枯草芽孢杆菌SCK6M转化时，将1 μg质粒DNA加入100 μL感受态细胞中，37°C、220 rpm孵育1.5小时。随后涂布于含相应抗生素的LB平板，37°C培养12小时。从平板挑取转化子，通过PCR和DNA测序进一步鉴定。
【数据】接种量：1%；OD600：1.0；木糖浓度：20%；甘油终浓度：10%；感受态分装：100 μL/管；储存温度：−80°C；质粒DNA量：1 μg；孵育条件：37°C、220 rpm、1.5 h；平板培养：37°C、12 h
crRNA文库的转化与筛选流程
构建的crRNA质粒文库首先转化入解淀粉芽孢杆菌LB1ba02/pHTdCpf1-ω-GFP，涂布于含Kan和Cm抗生素的LB平板，37°C培养12小时。随后从平板上随机挑取200个转化子至96深孔板（每孔800 μL LB液体培养基，添加Kan、Cm和50 μM IPTG），37°C、220 rpm培养24小时。不含crRNA序列的双质粒重组菌株作为对照。每个样品10,000 rpm离心5分钟，取200 μL上清液测定胞外荧光强度。胞外GFP强度显著提高的重组菌株通过24孔板发酵进一步验证。24孔板每孔以相同2%接种量接种3 mL液体LB培养基。同时测定胞外AmyX活性。结果以三次独立技术重复的平均值表示；最终值为三次独立技术重复的平均值。解淀粉芽孢杆菌的电转化按照Zakataeva等人的方法进行。添加质粒DNA的感受态细胞在Eppendorf Eporator电转化仪上、25 kV/2 cm场强条件下接受单次电脉冲，持续4–6 ms。
【数据】筛选规模：200个转化子；培养条件：96深孔板800 μL LB、37°C、220 rpm、24 h；离心：10,000 rpm、5 min；上清液量：200 μL；24孔板：3 mL LB、2%接种量；电转化参数：25 kV/2 cm、4–6 ms
实时荧光定量PCR
在指数生长期（2%接种量培养8小时）收集解淀粉芽孢杆菌LB1ba02细胞，使用HiPure Bacterial RNA Kit提取总RNA。通过260和280 nm光密度测量检测总RNA纯度。随后使用反转录试剂盒进行gDNA去除和反转录反应。编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gapA基因被选为内参基因。qRT-PCR在96孔板中进行，反应体积20 μL，使用SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit。反应条件原文未详述。
【数据】细胞收获：指数生长期（2%接种量、8 h）；RNA提取：HiPure Bacterial RNA Kit；RNA纯度检测：260/280 nm光密度；内参基因：gapA；反应体积：20 μL
研究结果
CRISPR/dCpf1介导的基因敲低
CRISPR干扰利用Cpf1的核酸酶缺陷突变体dCpf1实现靶向基因抑制。为验证CRISPR/dCpf1系统能否在解淀粉芽孢杆菌LB1ba02中进行基因敲低，构建了全合一质粒pWSdCpf1-GFP-crRNA。dCpf1（D917A）由IPTG诱导型启动子Pgrac控制表达。来源于枯草芽孢杆菌的组成型强启动子P43用于crRNA的转录。报告蛋白GFP由另一个组成型启动子Pveg表达。去除crRNA的质粒pWSdCpf1-GFP作为阳性对照。将两种质粒分别转化入解淀粉芽孢杆菌LB1ba02。在GFP报告基因5′端设计了一个crRNA位点（5′- ACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGT - 3′）。缺乏DNA双链切割活性的dCpf1蛋白通过crRNA特异性识别并结合GFP报告基因的5′互补链，阻碍转录和翻译过程。Pgrac是非严紧型IPTG诱导启动子，在缺乏诱导剂时存在轻微泄漏表达。为探究不同浓度IPTG对基因抑制的影响，设计了不同IPTG浓度梯度进行验证。重组菌株在24孔板中30°C、220 rpm培养36小时。取1 mL培养菌液10,000 rpm离心5分钟，用去离子水洗涤3次。细胞重悬于1 mL去离子水中，取200 μL转移至96孔微量滴定板测量荧光强度。如图1b所示，通过添加不同浓度IPTG成功实现了基因表达抑制。未添加IPTG时观察到32.3倍抑制效率，这归因于启动子的轻微泄漏表达。添加50 μM IPTG时实现最佳73.9倍抑制。此外，注意到GFP强度随IPTG浓度增加而逐渐降低，这可能是IPTG浓度对宿主生长的影响所致。这些结果表明，本工作开发的CRISPR/dCpf1基因敲低系统在解淀粉芽孢杆菌LB1ba02中运行良好，可应用于后续研究。
【数据】抑制效率：无IPTG时32.3倍、50 μM IPTG时73.9倍；培养条件：24孔板、30°C、220 rpm、36 h；离心：10,000 rpm、5 min；洗涤：去离子水3次；测量体积：200 μL；crRNA靶序列：5′-ACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGT-3′
CRISPR/dCpf1-ω介导的转录调控
CRISPR/dCpf1系统通过特异性结合启动子转录区或基因编码区阻止基因表达。此外，当dCpf1蛋白与转录激活因子融合并结合启动子上游特定区域时，可进一步激活靶基因表达。为验证dCpf1与转录相关激活因子的融合表达能否在解淀粉芽孢杆菌LB1ba02中实现基因转录激活，选择了来自RNAP的ω亚基，构建了CRISPR/dCpf1-ω转录激活系统。ω亚基融合到dCpf1蛋白的C末端，同样由IPTG诱导型启动子Pgrac表达。随后，GFP报告基因由启动子Pveg驱动整合到解淀粉芽孢杆菌LB1ba02基因组中。整合方法和过程参照此前发表的论文。设计了距离Pveg-GFP表达盒转录起始位点（TSS）不同距离（＋78、－15、－111、－269、－311、－327和－384 bp）的7个crRNA，用于评估CRISPR/dCpf1-ω系统的抑制和激活效率。如图2c所示，当dCpf1-ω结合启动子转录区（－15）和基因编码区（＋78）时，GFP表达受到抑制。此外，当dCpf1-ω结合启动子上游区域时，GFP表达以不同倍数增加，在－327 bp位点实现最佳1.8倍激活效果。这些结果表明，CRISPR/dCpf1-ω系统可以通过设计不同crRNA位点在解淀粉芽孢杆菌LB1ba02中实现基因转录激活和抑制。
【数据】crRNA位点：＋78、－15、－111、－269、－311、－327、－384 bp；最佳激活：－327 bp处1.8倍；抑制位置：－15（启动子转录区）和＋78（基因编码区）
CRISPR/dCpf1-ω系统的多基因调控
尽管dCpf1蛋白丧失切割DNA双链的能力，它仍能在无tracrRNA辅助下将pre-crRNA加工为成熟crRNA。因此，CRISPR/dCpf1系统可通过设计crRNA阵列实现对基因表达的多重调控。为确定CRISPR/dCpf1-ω系统能否在解淀粉芽孢杆菌LB1ba02中同时进行多基因调控，构建了含有三个基因（secE、secDF和prsA）crRNA阵列的质粒，命名为pWSdCpf1-ω-crRNA-secE-secDF-prsA。随后将该质粒转化入解淀粉芽孢杆菌LB1ba02。采用实时荧光定量PCR方法检测三个基因表达激活后的mRNA转录量。不含crRNA阵列的重组菌株LB1ba02/pWSdCpf1-ω作为对照。如图2d所示，三个基因（secE、secDF和prsA）的相对转录水平分别提高了1.6、1.4和2.2倍。结果表明，CRISPR/dCpf1-ω系统可良好应用于解淀粉芽孢杆菌LB1ba02，并同时激活多个基因的表达。
【数据】转录水平提升：secE 1.6倍、secDF 1.4倍、prsA 2.2倍；检测方法：qRT-PCR；对照菌株：LB1ba02/pWSdCpf1-ω
CRISPR/dCpf1-ω系统研究胞外蛋白的Sec分泌途径
为进一步将CRISPR/dCpf1-ω转录调控系统应用于解淀粉芽孢杆菌LB1ba02，构建了crRNA激活文库来研究Sec分泌途径。作为蛋白质分泌的主要途径，Sec途径存在于各种原核微生物中。研究表明，过表达参与Sec途径的转运蛋白或分子伴侣等蛋白可促进胞外蛋白分泌。因此，设计了针对Sec分泌途径24个蛋白的crRNA文库。每个基因在其TSS上游约300 bp处设计2个crRNA，共含48个crRNA。由于单个大质粒转化效率低，设计了一种双质粒CRISPR/dCpf1-ω调控系统。芽孢杆菌载体pHT01用于插入dCpf1-ω和GFP表达盒，另一个质粒pLBP43-DR被改造用于构建crRNA文库。如图3b所示，质粒pHT-dCpf1-ω-GFP首先转化入解淀粉芽孢杆菌LB1ba02。随后，将crRNA文库转化入重组菌株LB1ba02/pHT-dCpf1-ω-GFP。不含crRNA序列的双质粒重组菌株作为对照。首先挑取200个转化子，在96孔板中37°C、220 rpm培养24小时，初步筛选出胞外GFP强度高于对照的重组菌株。胞外GFP强度较强的重组菌株通过24孔板进一步验证，然后通过提取质粒并测序crRNA位点确定被激活的蛋白。如图3c所示，最终筛选出7种Sec途径蛋白（SipS、SecDF、PrsA、LspA、SecE、SipV和SecA），这些蛋白的表达被激活后均能促进胞内蛋白GFP分泌到胞外培养基中。其中，分子马达转运蛋白SecA表达被激活时效果最为显著，胞外上清液荧光强度为对照菌株的1.5倍。
【数据】crRNA文库：24个蛋白、48个crRNA、TSS上游约300 bp；初筛：200个转化子、96孔板、37°C、220 rpm、24 h；筛选结果：7种蛋白（SipS、SecDF、PrsA、LspA、SecE、SipV、SecA）；最佳效果：SecA激活时胞外荧光为对照1.5倍
讨论与解读
解淀粉芽孢杆菌作为GRAS微生物宿主和工业重要产酶菌株，由于限制修饰系统的存在，尚未被充分开发为靶蛋白的高效表达宿主。该系统能识别并切割外源DNA，导致解淀粉芽孢杆菌转化效率极低。为将外源DNA转化入解淀粉芽孢杆菌，必须规避其限制修饰系统。本工作中，不含大肠杆菌复制子的质粒由枯草芽孢杆菌SCK6M构建。SCK6因基因组过表达感受态因子ComK可培养为超感受态细胞。为规避II型限制修饰系统，将源自解淀粉芽孢杆菌的bamHIM甲基转移酶基因整合到SCK6基因组中用于外源质粒甲基化，命名为SCK6M。此外，SCK6菌株不含DNA-胞嘧啶甲基转移酶（Dcm）和DNA-腺嘌呤甲基转移酶（Dam）基因，理论上可规避解淀粉芽孢杆菌LB1ba02中推测的IV型限制修饰系统。研究证实，从SCK6M提取的质粒可成功转化入LB1ba02。限制修饰系统和低转化效率也导致其CRISPR工具开发远落后于其他芽孢杆菌属。
本研究通过dCpf1与ω亚基融合，在同一菌株中实现了基因抑制与激活的双向调控，并利用crRNA阵列完成了多基因同步激活。该策略绕开了限制修饰系统对转化效率的制约，为含该类系统的工业菌株提供了可行的CRISPR工具开发路径。筛选出的7个Sec途径分泌相关蛋白为芽孢杆菌蛋白分泌工程提供了新的靶点资源。值得注意的是，本研究的激活效应（1.8倍）弱于抑制效应（73.9倍），且文库筛选仅覆盖了Sec途径的部分蛋白，其他分泌途径或未注释蛋白可能同样具有促进分泌的潜力，原文未详述。
编译者解读：该研究的核心价值在于将CRISPRi/a工具成功拓展至长期受限于限制修饰系统的工业菌株，并通过双质粒系统规避了单大质粒转化瓶颈。从合成生物学应用角度看，SecA与CsaA联合激活实现9.8倍分泌提升的发现，直接为工业酶制剂的分泌优化提供了可操作靶点。然而，该系统的激活倍数相对有限，且依赖IPTG诱导，在大规模发酵中成本与控制精度或成制约因素。未来若能在该框架下引入自诱导或组成型激活模块，将更贴近工业应用场景。
参考来源
Xin Q. Development and application of a CRISPR-dCpf1 assisted multiplex gene regulation system in Bacillus amyloliquefaciens LB1ba02. Microbiological Research, 2022. DOI: 10.1016/j.micres.2022.127131
DOI: 10.1016/j.micres.2022.127131