来源：Optimized SARS-CoV-2 spike protein detection via coupling coefficient-driven fast fourier transform analysis in a peptide-functionalized fiber optic biosensor（Sensors and Actuators B: Chemical）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合域（RBD）是病毒感染宿主细胞的关键结构域，也是中和抗体的主要靶点。本研究报道了一种基于法布里-珀罗（Fabry-Pérot）腔的光纤生物传感器，通过将ACE2来源肽固定于腔体外壁，利用耦合系数变化结合傅里叶变换分析，实现了对刺突蛋白RBD的高灵敏度检测。该传感器在多种肽联合使用时检测限低至0.018 ng/mL，线性相关系数R²达0.99，为病毒快速检测提供了新平台。
研究背景
SARS-CoV-2作为COVID-19大流行的病原体，凸显了全球对高效病毒检测与监测机制的迫切需求。刺突蛋白的受体结合域（RBD）负责与宿主细胞初始相互作用——病毒利用ACE2酶作为入侵宿主细胞的入口，该外肽酶膜蛋白主要存在于肾脏、肺和心脏中。RBD不仅是病毒感染性和宿主范围的关键决定因素，也是中和抗体的主要靶点，在疫苗设计和治疗干预中具有核心作用。精确检测和监测刺突蛋白RBD，对于追踪病毒突变、理解宿主免疫应答及开发新型疫苗策略具有重要价值。
研究方法
编码hACE2（质粒#1786，https://www.addgene.org/1786/）和SARS-CoV-2刺突蛋白（质粒#145032，https://www.addgene.org/145032/）的质粒购自Addgene。随后，细菌在200 mL LB培养基（Sigma-Aldrich）中，加入Addgene推荐抗生素，于摇床中37°C、220 rpm过夜培养。最后，将细菌培养物离心，使用NucleoSpin® Plasmid试剂盒（Macherey-Nagel）按照制造商方案提取并纯化质粒DNA。
DNA片段的PCR扩增采用标准程序进行。简要而言，制备反应混合物，包含四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）各200 μM、每种引物10 pmol、2 mM MgCl₂、0.5 U/µL Ampli Taq Gold聚合酶（Applied Biosystem），以及10至50 ng模板质粒DNA（质粒#1786或#145032）；全部稀释于制造商提供的反应缓冲液中。反应在GeneAmp® PCR System 2700热循环仪（Applied Biosystem）中进行。引物针对选定区域设计（AC2 A：正向 5'-GAA TTC ACC CCA CCA TTG AGG AAC AGG C，反向 5'-CTC GAG TGG TGT TAT ATT TCC AAG AAG C；AC2 B：正向 5'-GAA TTC ACC GGG GAC AAA TGG TCT GCC T，反向 5'-CTC GAG GAT TCT GAA TTT CTT GTA GTG G；AC2 C：正向 5'-GAA TTC ACC GCC ATC CCA CAG CTT GGG，反向 5'-CTC GAG GTC CAT TGT CAC CTT TGT GC；RBD刺突蛋白：正向 5'-GAA TTC ACC GGC TTA TCG AAA TTA ATA CGA C，反向 5'-AAG CTT GAT CAG CGG GTT TAA ACG GG）。扩增的DNA通过1%或2%琼脂糖凝胶电泳在TAE缓冲液（40 mM Tris-醋酸，2 mM Na₂EDTA）中分离。获得的片段用适当的限制性内切酶消化，亚克隆至原核表达载体pGEX-4T3中以生成相应的GST-ACE2 A、B和C重组肽，并亚克隆至pMAL-c5X载体中以生成MBP-RBD SARS-CoV-2刺突蛋白。对亚克隆至pGEX-4T3和pMAL-c5X的插入片段进行测序，以验证PCR扩增过程中未发生阅读框改变。验证完成后，各质粒转化至大肠杆菌BL21菌株。
重组肽的诱导和纯化基于制造商（GE HealthCare和New England Biolabs）建立的方法进行。简言之，细菌在5 mL 2XYT培养基（Sigma-Aldrich）中（含100 μg/mL氨苄青霉素，Sigma-Aldrich）过夜预培养，稀释10倍，稀释1小时后，通过向培养基中加入1 mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）（GE HealthCare）进行重组肽诱导。在诱导剂存在下培养4小时后，通过超声裂解细菌培养物，离心收集上清液。重组肽的纯化采用亲和层析法，使用固定在琼脂糖基质上的直链淀粉或谷胱甘肽。当细菌裂解液的可溶部分加入这些亲和柱时，融合蛋白与之结合，而杂质通过结合缓冲液洗涤去除。GST和MBP融合蛋白分别通过加入还原型谷胱甘肽或麦芽糖从基质上洗脱，从而在非变性条件下从基质释放重组肽，以保持其结构和功能。洗脱的肽经定量后分装保存于−80°C。
裸光纤换能器表面功能化以实现基于GST-ACE2 A、B和C重组肽亲和结合的Spike-RBD选择性检测，需要处理流程以达到所需灵敏度。图9显示了换能器表面功能化的处理过程，分为四个步骤。第一步涉及残余有机组分的去除和表面羟基化。换能器在食人鱼溶液（由H₂SO₄和H₂O₂按3:1（v/v）比例混合制备）中室温孵育20分钟。孵育后，换能器用足量Milli-Q水彻底洗涤。接下来进行表面硅烷化。换能器在新制备的2.5%（v/v）APTES溶液（溶于乙醇）中，室温、持续摇动下孵育45分钟。孵育后，换能器用乙醇和Milli-Q水（1:1，v/v）及5%（v/v）乙酸溶液洗涤，以去除过量APTES分子并形成APTES单层。随后，换能器在100°C烘烤30分钟，在表面产生功能性胺基（-NH₂）。第三步涉及特制肽的固定化。现已带有功能性胺基的换能器在3.5 μg/mL肽溶液中室温孵育1小时。孵育后，换能器用PBS洗涤以去除弱结合的肽。最后，为封闭非特异性结合位点，固定化肽的换能器在2% BSA中孵育15分钟。随后换能器表面用PBS洗涤。
为评估传感器对PBS中不同浓度Spike-RBD的检测能力，将最高浓度（1000 ppb）以十倍递减方式系列稀释至最低浓度（0.01 ppb）制备目标样品。检测过程从最低浓度（0 ppb）进行至最高浓度（1000 ppb）。每个样品浓度置于微孔板（Thermo Scientific™ Nunc™ 96孔聚苯乙烯圆底微孔板）的一个孔中。传感器在每个样品中浸泡5分钟以实现结合稳定，为样品中Spike-RBD与传感器表面固定化肽之间的亲和结合提供足够时间。每个5分钟间隔后，收集光谱仪输出信号，传感器转移至下一浓度样品。
图10显示了不同浓度Spike-RBD重组肽到达功能化壁时用光束轮廓仪测量的束宽。图显示随着浓度增加，由于蛋白质存在增多导致散射增强，光束色散也增加。因此，耦合系数降低，正如方程11所预测。根据该方程，耦合效率针对不同Tsurface值进行评估，该值影响反射光束的色散。
【数据】培养基：LB（200 mL）、2XYT（5 mL）；温度：37°C（细菌培养）、室温（功能化处理）、100°C（烘烤）；转速：220 rpm；时间：过夜培养、IPTG诱导4小时、食人鱼溶液处理20分钟、APTES孵育45分钟、烘烤30分钟、肽固定化1小时、BSA封闭15分钟、每浓度浸泡5分钟；浓度：dNTP各200 μM、MgCl₂ 2 mM、Ampli Taq Gold 0.5 U/µL、模板DNA 10-50 ng、氨苄青霉素100 μg/mL、IPTG 1 mM、APTES 2.5%（v/v）、乙酸溶液5%（v/v）、肽溶液3.5 μg/mL、BSA 2%、Spike-RBD 0.01-1000 ppb；引物：10 pmol/种；食人鱼溶液：H₂SO₄:H₂O₂ = 3:1（v/v）
研究结果
实验评估中，制作并测试了多个传感器。结果如图11所示，左上方面板展示了其中一个传感器浸入Milli-Q水中时获得的光谱，代表不同浓度Spike-RBD：0、10、100和1000 ppb。右上方面板提供了特定光谱区域的放大视图，突出显示不同浓度下光谱的细微变化。为进一步分析这些变化，左下方面板显示了完整光谱的快速傅里叶变换（FFT），而右下方面板提供了FFT峰的放大视图。这些面板清楚地显示，随着Spike-RBD浓度增加，FFT峰振幅降低，反映了传感器的灵敏度及其检测和定量目标蛋白的能力。
图12显示了使用不同肽时，不同浓度Spike-RBD的FFT强度降低情况。为验证结果的可重复性，每种肽分别以三次独立试验固定化在换能器表面，每次遵循相同方案。记录相应测量值，并使用非功能化换能器浸入Spike-RBD样品中进行对照实验。这些对照结果以图12中蓝点表示。如图所示，所有肽均表现出FFT强度随Spike-RBD浓度增加而持续降低，呈现强线性相关性，R²值达0.99。各肽的检测限（LOD）测定为：肽A为0.04 ng/mL，肽B为0.066 ng/mL，肽C为0.032 ng/mL，所有肽联合使用时为0.018 ng/mL。光谱测量的FFT分析揭示了由于Spike-RBD与固定在传感器表面的GST-ACE2 A、B和C重组肽之间亲和结合而产生的明显光谱变化。这些变化与耦合系数的变化直接相关，进而影响干涉图案。插图中的放大视图说明FFT峰振幅随蛋白质浓度增加而降低，展示了传感器的灵敏度及其检测蛋白质结合细微变化的能力。
对照实验中，非功能化换能器浸入Spike-RBD样品时未显示明显的FFT强度变化（蓝色数据点），确认了信号响应源于特异性亲和结合而非非特异性吸附。高浓度下FFT振幅的微小波动被进一步分析以验证传感器在极端条件下的稳定性。实验结果表明，FFT强度降低与Spike-RBD在传感器表面的特异性结合直接相关，由肽与目标蛋白之间的生物亲和力驱动。
【数据】检测限：肽A 0.04 ng/mL、肽B 0.066 ng/mL、肽C 0.032 ng/mL、联合肽 0.018 ng/mL；R²：0.99；浓度范围：0-1000 ppb；对照实验：非功能化换能器浸入Spike-RBD样品
讨论与解读
本研究成功开发并验证了一种用于SARS-CoV-2刺突蛋白检测的高灵敏度、高特异性光纤生物传感器。通过利用GST-ACE2 A、B和C重组肽功能化的法布里-珀罗腔传感器的独特性质，能够精确监测与目标蛋白浓度直接相关的耦合系数变化。该方法的有效性在低浓度刺突蛋白RBD检测中得到证实——多肽联合使用时检测限低至0.018 ng/mL。传感器的设计通过理论计算和实验测量双重验证，功能化壁处高斯光束光斑尺寸的理论与实验值高度一致，确认了模型的准确性。干涉图案的傅里叶变换分析进一步证明了传感器检测蛋白质结合细微变化的能力，使其成为实时病毒检测的有力工具。该传感器的一个关键优势在于其适应性——虽然针对SARS-CoV-2刺突蛋白设计和测试，但通过重新设计靶向不同蛋白的肽，可轻松改造用于检测其他病原体。
编译者解读：该研究将光学物理原理与合成生物学工具巧妙结合——利用ACE2来源肽段作为生物识别元件，通过监测光学耦合系数的细微变化实现蛋白定量，避免了传统标记方法的复杂性。从合成生物学应用视角看，肽段功能化策略展示了模块化设计的优势：更换识别肽即可适配不同靶标，为构建可编程生物传感平台提供了范例。然而，当前验证仅在缓冲液体系中进行，实际临床样本（血清、唾液等）中的基质效应尚待考察——这也是论文作者明确指出的后续方向。该技术若能成功跨越复杂生物样本的挑战，有望成为现场快速诊断的有力工具。
参考来源
Arrizabalaga O. Optimized SARS-CoV-2 spike protein detection via coupling coefficient-driven fast fourier transform analysis in a peptide-functionalized fiber optic biosensor. Sensors and Actuators B: Chemical, 2025. DOI: 10.1016/j.snb.2025.137226
DOI: 10.1016/j.snb.2025.137226