来源：CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins（Insect Biochemistry and Molecular Biology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
Bt转基因作物的大面积种植使棉铃虫对Cry2Ab毒素的抗性演化成为农业生产的重要威胁。此前研究已通过遗传定位发现ABCA2转运蛋白基因与Cry2Ab抗性相关，但缺乏直接功能证据。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，在敏感品系SCD中分别通过NHEJ和HDR途径敲除HaABCA2基因，创制了两个纯合敲除品系。生测结果显示，两个敲除品系对Cry2Aa和Cry2Ab均产生超过100倍的高水平抗性，但对Cry1Ac仍保持敏感，同时中肠BBMV结合实验证实了敲除品系丧失Cry2Ab毒素结合能力。该研究为HaABCA2作为Cry2A毒素功能受体提供了首个反向遗传学证据。
研究背景
表达苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）杀虫蛋白的转基因作物已成为玉米、棉花等大田作物害虫治理的核心工具，全球种植面积已超过10亿英亩。针对夜蛾科等鳞翅目害虫，主要依赖Cry1、Cry2和Vip3三类Bt毒素。Cry1类毒素的抗性机制研究较为深入，已证实与钙黏蛋白基因突变有关。近期研究发现，Cry2Ab的高水平抗性与棉铃虫（Helicoverpa armigera）和澳大利亚棉铃虫（H. punctigera）中ABCA2基因的突变相关联，但该候选基因的功能验证尚未完成。棉铃虫是亚洲、澳洲、非洲和欧洲最重要的农业害虫之一，近年来已入侵南美洲，因此确认Cry2Ab抗性的分子机制具有重要的理论与应用价值。
研究方法
2.1 昆虫品系与饲养
野生型SCD品系于1970年代采集自科特迪瓦，2001年由拜耳作物科学公司惠赠本实验室。该品系在实验室条件下未接触任何杀虫剂或Bt毒素，已连续饲养超过30年，对Bt毒素和化学杀虫剂均表现敏感。利用CRISPR/Cas9基因组编辑工具敲除SCD品系的HaABCA2基因，获得两个敲除品系SCD-A2KO1和SCD-A2KO2。SCD-A2KO1品系在HaABCA2外显子2上携带由非同源末端连接（NHEJ）产生的2-bp缺失纯合突变。SCD-A2KO2品系在外显子18上携带由同源定向修复（HDR）产生的5-bp缺失纯合突变，该突变设计用于模拟澳大利亚田间Cry2Ab抗性品系的r2抗性等位基因。所有品系幼虫以小麦胚芽和大豆粉为基础的人工饲料饲养，条件为26±1°C，相对湿度60±10%，光周期16h光照:8h黑暗。成虫饲喂10%糖水溶液。
【数据】饲养温度：26±1°C；相对湿度：60±10%；光周期：16h:8h；成虫饲料：10%糖水
2.2 Bt蛋白与生物测定
本研究所用Cry2Ab原毒素由中国农业科学院植物保护研究所提供。Cry2Aa原毒素和Cry1Ac活化毒素由美国凯斯西储大学Marianne P. Carey博士提供。采用饲料表面铺膜生物测定法检测各Bt蛋白对SCD品系和两个HaABCA2敲除品系的毒性。用0.01 M、pH 7.4磷酸盐缓冲液（PBS）稀释蛋白储备液，制备梯度浓度的Bt蛋白溶液。在24孔板每孔（表面积=2 cm²）中加入900 μl液态人工饲料。待饲料冷却凝固后，每孔表面均匀涂布100 μl Bt蛋白溶液。室温下待Bt蛋白溶液干燥后，每孔放入一头未取食的新生幼虫（24 h龄），7天后记录死亡率。幼虫死亡或体重低于5 mg视为死亡。各品系LC50值（杀死50%幼虫所需的Bt蛋白浓度）及95%置信限通过PoloPlus软件（LeOra Software, 2002）对死亡率数据进行probit分析计算。两个LC50值的95%置信限不重叠则视为差异显著。
【数据】Bt蛋白溶液缓冲液：0.01M PBS，pH 7.4；每孔饲料量：900μl；每孔Bt蛋白溶液量：100μl；每孔面积：2cm²；生测周期：7天；死亡判定：死亡或体重<5mg
2.3 靶向HaABCA2外显子2的sgRNA设计与制备
根据5′-CCNN18CC-3′原则，在HaABCA2外显子2上选择sgRNA靶序列（5′-CCTATTTTTATTGATAACTTACC-3′，下划线为PAM序列）。通过检索棉铃虫基因组和GenBank数据库确认所选sgRNA靶序列无潜在脱靶位点。采用基于PCR的两条寡核苷酸融合方法制备模板DNA：一条为编码T7聚合酶结合位点和sgRNA靶序列GGN18的特异性寡核苷酸（5′-GAAATTAATACGACTCACTATAGGN18 GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3′），另一条为编码其余sgRNA序列的通用寡核苷酸（5′-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3′）。融合PCR反应体系和PCR产物纯化方法同Wang等（2016）报道。sgRNA采用MEGAshortscript™ T7 High Yield Transcription Kit（Ambion, Foster City, CA）进行体外转录合成，操作按制造商说明书进行。
【数据】sgRNA靶序列：5′-CCTATTTTTATTGATAACTTACC-3′；PAM序列：TACC；体外转录试剂盒：MEGAshortscript™ T7 High Yield Transcription Kit
2.4 靶向HaABCA2外显子18的sgRNA设计与制备
HaABCA2的r2等位基因在外显子18上存在5-bp缺失（ACAAG），该突变与棉铃虫Cry2Ab抗性遗传连锁。为在SCD品系中重现相同的5-bp缺失，我们在HaABCA2外显子18上选择sgRNA靶序列（5′-GACAAGTGATCCCGTCGTGATGG-3′，下划线为PAM序列，其中带下划线的“ACAAG”序列为待删除序列）。通过检索棉铃虫基因组和GenBank数据库确认无潜在脱靶位点。sgRNA制备方法同2.3节所述。设计了一个96 nt大小的单链寡脱氧核苷酸（ssODN），携带HaABCA2的特异性5-bp缺失，由GENEWIZ（中国苏州）合成。该ssODN将作为HDR的模板，用于修复Cas9介导的双链断裂（DSB）。
【数据】sgRNA靶序列：5′-GACAAGTGATCCCGTCGTGATGG-3′；待删除序列：ACAAG；ssODN长度：96nt
2.5 Cas9 mRNA与蛋白
Cas9 mRNA（GeneArt™ CRISPR Nuclease mRNA）和Cas9蛋白（GeneArt™ Platinum™ Cas9 Nuclease）购自赛默飞世尔科技（中国上海）。
【数据】Cas9 mRNA来源：GeneArt™ CRISPR Nuclease mRNA；Cas9蛋白来源：GeneArt™ Platinum™ Cas9 Nuclease
2.6 胚胎显微注射
卵的收集和制备方法同Wang等（2016）报道。简要步骤如下：2 h内产下的新鲜卵用1%次氯酸钠溶液从纱布上洗下，蒸馏水冲洗。抽滤后，将卵排列在载玻片上（用双面胶固定）。靶向外显子2的实验：向每个卵注射约1 nL sgRNA（300 ng/μl）和Cas9 mRNA（500 ng/μl）的混合物，使用FemtoJet和InjectMan NI 2显微注射系统（Eppendorf, Hamburg, Germany）。靶向外显子18的实验：向每个卵注射约1 nL sgRNA（100 ng/μl）、Cas9蛋白（50 ng/μl）和ssODN供体DNA（100 ng/μl）的混合物。显微注射在2 h内完成。注射后的卵置于26±1°C、60±10%相对湿度条件下孵化。
【数据】注射体积：~1nL/卵；外显子2组：sgRNA 300ng/μl + Cas9 mRNA 500ng/μl；外显子18组：sgRNA 100ng/μl + Cas9蛋白 50ng/μl + ssODN 100ng/μl；孵化条件：26±1°C，60±10% RH
2.7 CRISPR/Cas9介导的HaABCA2突变鉴定
为鉴定HaABCA2外显子2的插入缺失突变，设计了一对特异性引物（正向：5′-GGCAAGTCCAGTGTTAGATGAT-3′，反向：5′-AGCGATAATGCTGCGTGTAGTT-3′），扩增包含sgRNA靶位点的259-bp片段。从单头昆虫基因组DNA中扩增PCR片段，送Life Technology（中国上海）进行直接测序（以正向引物为测序引物）。当在Cas9诱导的DSB切割位点附近观察到双峰簇时，将PCR产物进行TA克隆并测序，以确定精确的插入缺失突变类型。为鉴定HaABCA2外显子18的突变类型，使用一对特异性引物（正向：5′-TTTCTCCGCCCACTCAGTAA-3′，反向：5′-GTAGCAACATCGTGGTAGCC-3′）从单头昆虫基因组DNA中扩增包含sgRNA靶位点的356-bp片段。PCR产物直接测序，以正向引物为测序引物。根据测序色谱图的峰型判别Cas9诱导的突变类型：切割位点附近出现双测序峰簇表明为NHEJ产生的插入缺失突变杂合子；从5-bp缺失（ACAAG）位置开始出现双测序峰簇则代表HDR产生的5-bp缺失等位基因杂合子。
【数据】外显子2扩增片段：259bp；外显子18扩增片段：356bp；测序服务商：Life Technology (Shanghai)
2.8 Bt毒素与中肠刷状缘膜囊泡（BBMVs）的结合实验
取1日龄5龄棉铃虫幼虫，冰上麻醉后解剖。去除气管、马氏管、围食膜和食物团。中肠组织在冰浴0.15 M NaCl中短暂漂洗。BBMVs按Wolfersberger等（1987）的差异镁沉淀法制备。最终BBMV沉淀以1 mg/ml蛋白浓度重悬于重悬缓冲液（300 mM甘露醇、20 mM HEPES-Tris、pH 7.4）中。毒素与BBMVs的结合实验按文献方法进行。
【数据】幼虫龄期：1日龄5龄；NaCl浓度：0.15M；BBMV蛋白浓度：1mg/ml；重悬缓冲液：300mM甘露醇，20mM HEPES-Tris，pH 7.4
研究结果
3.1 外显子2 2-bp缺失纯合品系SCD-A2KO1的创制
将200粒新鲜卵逐粒注射1 nL Cas9 mRNA和靶向HaABCA2外显子2的sgRNA混合物。注射卵中46%（92/200）孵化。92头新生幼虫中，64%（59/92）发育为成虫（G0）。G0雌雄蛾混合交配产生下一代（G1）。收集足够卵后，制备单头G0蛾的基因组DNA，按2.7节方法鉴定外显子2的插入缺失突变。直接测序显示，39%（23/59）的G0个体中Cas9蛋白诱导了插入缺失突变。克隆测序揭示23个Cas9诱导突变个体中存在8种不同类型的插入缺失突变。G1幼虫饲养至化蛹。选取94头蛹（性别比=1:1），用末龄幼虫蜕皮进行外显子2基因分型。94头测序个体中，10头携带两个突变等位基因，27头仅携带一个突变等位基因，57头为野生型纯合子。为将突变等位基因传递至G2，选取5头雄蛾和6头雌蛾（均为外显子2 2-bp缺失杂合子）混合交配。对G2的96头个体用末龄幼虫蜕皮进行基因分型，13.5%（13/96）被鉴定为外显子2 2-bp缺失纯合子。13头纯合突变体（7雄6雌）混合交配产生纯合突变品系，命名为SCD-A2KO1。
【数据】注射卵数：200；孵化率：46%（92/200）；成虫率：64%（59/92）；G0突变率：39%（23/59）；突变类型数：8；G1中纯合突变体数：10/94；G2纯合突变体比例：13.5%（13/96）
3.2 外显子18 5-bp缺失纯合品系SCD-A2KO2的创制
将1 nL Cas9蛋白、ssODN供体和靶向HaABCA2外显子18的sgRNA混合物注入452粒新鲜卵。注射卵中40%（183/452）孵化，69%（127/183）发育为成虫（G0）。从G0成虫中随机选取30头雄蛾和30头雌蛾混合交配产生G1。收集足够卵后，制备G0蛾基因组DNA，按2.7节方法鉴定外显子18基因型。直接测序结果显示，85%（51/60）受检G0个体中Cas9蛋白诱导了基于NHEJ的插入缺失突变和/或基于HDR的突变。随机选取113头G1蛹进行基因分型。为避免损伤所选蛹，用末龄幼虫蜕皮制备基因组DNA，对CRISPR靶位点两侧的PCR产物进行直接测序以确定HaABCA2基因型。113头G1个体中检测到4种HaABCA2基因型：野生型（无Cas9诱导基因组编辑），占41%（46/113）；NHEJ产生的外显子18插入缺失突变，占38%（43/113）；HDR产生的外显子18 5-bp缺失纯合子，占8%（9/113）；HDR产生的外显子18 5-bp缺失杂合子，占13%（15/113）。为构建与HaABCA2 r2等位基因（Tay等，2015）相同5-bp缺失的纯合品系，将G1中9头5-bp缺失纯合子（4雄5雌）混合交配，启动新品系SCD-A2KO2。基因分型确认，从SCD-A2KO2随机选取的31头幼虫均为外显子18 5-bp缺失纯合子。
【数据】注射卵数：452；孵化率：40%（183/452）；成虫率：69%（127/183）；G0突变率：85%（51/60）；G1基因型比例：野生型41%，NHEJ突变38%，HDR纯合缺失8%，HDR杂合缺失13%；SCD-A2KO2验证数：31头全为纯合子
3.3 两个HaABCA2敲除品系对Bt毒素的敏感性
结合遗传定位和候选基因测序已鉴定出澳大利亚棉铃虫HaABCA2中三个与Cry2Ab抗性相关的插入缺失突变。为获得HaABCA2参与Cry2Ab抗性的体内功能证据，我们利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统从棉铃虫原始SCD品系创制了两个HaABCA2敲除品系：SCD-A2KO1品系为NHEJ产生的HaABCA2外显子2 2-bp缺失纯合子，SCD-A2KO2品系为HDR产生的外显子18 5-bp缺失纯合子。预测这两种缺失突变均导致HaABCA2蛋白截短。比较两个敲除品系与祖代SCD品系对Cry2Aa、Cry2Ab和Cry1Ac的敏感性。生测结果表明，与SCD品系相比，两个敲除品系对Cry2Aa（>120倍）和Cry2Ab（>100倍）均获得高水平抗性，但对Cry1Ac无抗性或抗性极低（<4倍）。结果提供了HaABCA2作为Cry2Aa和Cry2Ab功能性受体（而非Cry1Ac受体）的有力反向遗传学证据。
【数据】Cry2Aa抗性倍数：>120倍；Cry2Ab抗性倍数：>100倍；Cry1Ac抗性倍数：<4倍
3.4 Cry2Ab抗性的显性度与遗传互补测验
将两个抗性品系（SCD-A2KO1和SCD-A2KO2）分别与敏感品系SCD杂交，在4 μg/cm² Cry2Ab判别浓度下检测三个品系及其F1后代的响应。两个抗性品系的显性度参数（h）分别为0.01和0.08，表明两个抗性品系的Cry2Ab抗性几乎完全隐性。两个抗性品系杂交的F1后代在4 μg/cm² Cry2Ab浓度下存活率高达92%。遗传互补结果确认两个抗性品系的Cry2Ab抗性由同一基因座（即HaABCA2）赋予。
【数据】判别浓度：4μg/cm² Cry2Ab；显性度h：0.01和0.08；F1存活率：92%
3.5 毒素与中肠BBMVs结合的影响
从SCD品系和两个HaABCA2敲除品系制备中肠BBMVs，进行Cry2Ab或Cry1Ac的定性体外结合实验。SCD-A2KO1和SCD-A2KO2的中肠BBMVs均丧失与Cry2Ab毒素的结合，但保留与Cry1Ac毒素的结合。作为对照，SCD品系的中肠BBMVs与Cry2Ab和Cry1Ac毒素均能结合。活化的Cry2Ab有两个条带（60 kDa和48 kDa）。SCD品系中肠BBMVs与两种形式的Cry2Ab毒素均能结合，而两个HaABCA2敲除品系对两种蛋白的结合均丧失。结果确认HaABCA2的破坏与Cry2Ab结合能力的丧失相关，从而赋予棉铃虫对Cry2Ab的高水平抗性。
【数据】Cry2Ab活化条带：60kDa和48kDa；结合实验蛋白浓度：原文未详述
讨论与解读
CRISPR/Cas9是一种高效的基因组编辑工具，特别适合非模式物种的反向遗传学研究。本研究将Tay等（2015）鉴定的ABCA2转运蛋白基因通过功能实验确认为Cry2Ab抗性的责任基因，该基因参与毒素结合及可能的孔道形成。在田间和实验诱导的Cry2Ab抗性个体中，通常观察到毒素结合的缺失。Caccia等（2010）在Tay等（2015）所用的同一批棉铃虫和澳大利亚棉铃虫品系中证实了结合缺失现象。本研究通过HDR将H. armigera ABCA2基因中Ha2Ab-R02等位基因的精确突变导入完全敏感品系，所获修饰昆虫表现出高水平抗性，与田间分离的SP15品系特征一致，从而确认了Tay等（2015）所鉴定突变在抗性中的作用。
本研究的巧妙之处在于——用两种不同的基因编辑策略（NHEJ随机突变与HDR精确模拟田间等位基因）独立敲除同一基因，互为验证，使结论更加可靠。BBMV结合实验将基因型与表型直接关联，证据链条完整。局限在于，ABCA2如何参与Cry2A毒素的孔道形成机制仍未阐明；从抗性治理角度看，基于HDR精确重现田间抗性等位基因的策略，为评估和监测田间抗性演化提供了可复制的实验范式，对Bt作物抗性管理策略的制定具有直接参考价值。
编译者解读：本研究是典型的"基因编辑—表型验证—机制解析"闭环研究。选择HDR精确模拟田间等位基因是方法的亮点，使实验室结论可直接对接田间抗性监测。CRISPR/Cas9的引入使非模式昆虫的功能基因研究不再受制于传统遗传学手段，但ABCA2介导Cry2A毒力的精确分子机制（如是否直接参与孔道形成）仍是后续研究的关键切入点。
参考来源
Wang J, et al. CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2017. DOI: 10.1016/j.ibmb.2017.07.002
DOI: 10.1016/j.ibmb.2017.07.002