来源：Metabolic reprogramming and machine learning-guided cofactor engineering to boost nicotinamide mononucleotide production in Escherichia coli（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
烟酰胺单核苷酸（NMN）是NAD(P)+代谢中的重要活性化合物，具有抗衰老、神经保护等多种药理潜力。然而，增强NMN生物合成面临与细胞生长竞争碳源及扰乱胞内氧化还原稳态的双重挑战。本研究通过对大肠杆菌中心碳代谢进行重编程，并构建群体感应（QS）控制的辅因子工程系统，结合机器学习（ML）模型优化，最终在5 L生物反应器补料分批发酵中获得20.13 g/L NMN。研究揭示辅因子水平扰动是NMN生物合成的关键限制因素，提出的ML引导策略为精准操控胞内氧化还原状态提供了新范式。
研究背景
NMN作为NAD(P)+生物合成的重要前体，在动物模型中已被证实具有从抗衰老到神经保护、改善胰岛功能障碍等多重健康功效，使其成为营养保健品中的有用添加剂。此外，NMN还可作为非经典氧化还原辅因子替代高成本的NAD(P)+用于生物催化应用。目前，补料分批发酵和全细胞催化因高产物选择性和低环境影响而被广泛用于NMN合成。然而，增强NMN生物合成面临与细胞生长竞争以及扰乱胞内氧化还原稳态的挑战。已有研究通过引入不同来源的NMN合成酶实现了一定程度的NMN生产，但如何在保证细胞生长的同时高效合成NMN仍是亟待解决的问题。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
大肠杆菌DH5α用于质粒构建，大肠杆菌BL21(DE3)作为代谢工程改造的起始菌株。接种时，大肠杆菌细胞在Luria Broth（LB）培养基中于37°C、220 rpm条件下培养。必要时，添加50 μg/mL壮观霉素（Spe）、50 μg/mL卡那霉素（Kan）和25 μg/mL氯霉素（Cm）进行抗生素筛选，并添加0.5 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导。本研究构建的所有菌株和质粒已列于表1（见补充材料）。
【数据】菌株：E. coli DH5α、BL21(DE3)；培养基：LB；温度：37°C；转速：220 rpm；抗生素：50 μg/mL Spe、50 μg/mL Kan、25 μg/mL Cm；诱导剂：0.5 mM IPTG
2.2 基因组编辑与质粒构建
用于异源酶表达的基因包括：来自弧菌噬菌体KVP40的烟酰胺磷酸核糖转移酶（nadV）、来自蜡样芽孢杆菌的NMN转运蛋白（pnuC）、宏基因组来源的蓝色荧光蛋白（GenBank: ADG46021.1）、以及来自斯氏泛菌的AHL合酶（esaI）和转录调控因子（esaR）。这些基因均基于大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，并由Genewiz（中国苏州）合成。其他基因通过聚合酶链式反应（PCR）从酿酒酵母或大肠杆菌MG1655中扩增获得。为优化GDH1和GDH2的表达，将10个经测试具有不同翻译效率的RBS随机插入pSTV28质粒中GDH1和GDH2基因前方（见补充材料）。质粒构建使用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit V2（Vazyme，南京）进行In-fusion克隆。基因敲除与整合采用CRISPR/Cas9基因编辑系统，使用pEcCas9和pEcgRNA质粒。构建供体双链DNA（dsDNA）时，将目标基因与两个同源臂（300–500 bp）分别扩增并通过重叠PCR融合。将供体dsDNA（900 ng）和gRNA质粒（300 ng）共转化至含有pEcCas9质粒的电转感受态细胞中，使用Eppendorf Eporator（德国）在2.5 kV条件下进行电转化。电转化后，细胞在SOC培养基中于37°C恢复培养2 h，然后涂布于含50 μg/mL Spe和50 μg/mL Kan的LB培养基上，37°C培养12 h。随后用菌落PCR筛选阳性转化子。基因组操作完成后，分别添加鼠李糖（1 g/L）和蔗糖（10 g/L）以消除gRNA质粒和pEcCas9质粒，获得无质粒菌株。所有用于PCR的DNA聚合酶和试剂购自Vazyme Biotech（中国南京）。引物合成和DNA测序由Genewiz（中国苏州）完成。所有用于基因组编辑和质粒构建的引物列于补充材料。
【数据】同源臂：300–500 bp；供体dsDNA：900 ng；gRNA质粒：300 ng；电转电压：2.5 kV；恢复培养：37°C、2 h；筛选培养：37°C、12 h；质粒消除：1 g/L鼠李糖 + 10 g/L蔗糖；RBS数量：10个
2.3 深孔板与摇瓶培养
96孔板种子培养时，将工程菌株单菌落接种于含500 μL M9培养基的96孔板各孔中，于37°C、600 rpm培养12 h。随后，将50 μL种子培养液转移至含1 mL发酵培养基（12 g/L KH2PO4，5 g/L (NH4)2SO4，1.1 g/L柠檬酸·H2O，1 g/L MgSO4，1 g/L NaCl，5 g/L酵母提取物和10 g/L MOPS）的48孔板中，设置三个重复。培养4 h后，向培养基中加入终浓度为0.5 mM的IPTG和10 mM的NAM，细胞在37°C下继续培养20 h以生产NMN。
摇瓶发酵时，将工程菌株接种于5 mL LB中，37°C过夜培养。随后将1 mL种子培养液转移至含30 mL发酵培养基的摇瓶中（三个重复），于37°C、220 rpm条件下培养。待OD600达到1.0时，向培养基中加入终浓度0.5 mM的IPTG和10 mM的NAM，分别用于诱导基因表达和提供NMN合成前体。摇瓶发酵培养基含有20 g/L葡萄糖、12 g/L KH2PO4、5 g/L (NH4)2SO4、1.1 g/L柠檬酸·H2O、2 g/L MgSO4·7H2O、1 g/L NaCl、5 g/L酵母提取物、10 g/L MOPS，pH 7.0–7.2。
【数据】96孔板：500 μL M9培养基、37°C、600 rpm、12 h；48孔板：1 mL发酵培养基、接种量50 μL、三重复；诱导条件：0.5 mM IPTG + 10 mM NAM；发酵时间：20 h（48孔板）；摇瓶：30 mL发酵培养基、接种量1 mL、37°C、220 rpm；诱导时机：OD600=1.0；摇瓶培养基：20 g/L葡萄糖、12 g/L KH2PO4、5 g/L (NH4)2SO4、1.1 g/L柠檬酸·H2O、2 g/L MgSO4·7H2O、1 g/L NaCl、5 g/L酵母提取物、10 g/L MOPS、pH 7.0–7.2
2.4 5 L生物反应器补料分批发酵
将预培养的斜面菌株转移至200 mL LB培养基中。37°C过夜培养后，将200 mL种子培养液转移至含2.3 L发酵培养基的5 L生物反应器中。发酵培养基含有6 g/L KH2PO4、16 g/L K2HPO4、5 g/L (NH4)2SO4、1.1 g/L柠檬酸·H2O、2 g/L MgSO4·7H2O、10 g/L酵母提取物、7 g/L葡萄糖、1 g/L玉米浆、0.1 g/L硫胺素-HCl和2 mL/L微量元素溶液。当OD600达到15时，分别添加终浓度为0.5 mM的IPTG和2 g/L的NAM。微量元素溶液与Huang等人（2022）所述相同。发酵过程中，通过添加25% NH3·H2O维持pH值为7.0，溶解氧水平控制在10%–30%之间。NAM和葡萄糖以适当速率连续补入反应器，控制终浓度低于5 g/L。
【数据】5 L反应器：装液量2.3 L；培养基成分：6 g/L KH2PO4、16 g/L K2HPO4、5 g/L (NH4)2SO4、1.1 g/L柠檬酸·H2O、2 g/L MgSO4·7H2O、10 g/L酵母提取物、7 g/L葡萄糖、1 g/L玉米浆、0.1 g/L硫胺素-HCl、2 mL/L微量元素；诱导时机：OD600=15；IPTG：0.5 mM；NAM：2 g/L；pH：7.0（25% NH3·H2O维持）；溶氧：10–30%；补料控制浓度：<5 g/L
2.5 NADH和NADPH测定
胞内NADH、NADPH和ATP水平分别使用NAD+/NADH检测试剂盒（S0175，碧云天，中国）、NADP+/NADPH检测试剂盒（S0179，碧云天，中国）和ATP检测试剂盒（S0026，碧云天，中国）按照说明书进行测定。为实时监测胞内NADPH水平，使用了一种能够特异性结合NADPH并表现出增强荧光的宏基因组来源蓝色荧光蛋白（mBFP）。该策略的可行性通过在不同胞内NADPH水平的工程菌株中表达mBFP进行验证，结果显示mBFP的荧光强度与胞内NADPH水平呈正相关（见补充材料）。样品制备时，收集200 μL发酵液，离心（6500 rpm，2 min以内）。PBS洗涤三次后，在激发波长350 nm、发射波长451 nm条件下检测荧光强度。
【数据】检测试剂盒：S0175（NAD+/NADH）、S0179（NADP+/NADPH）、S0026（ATP）；样品量：200 μL发酵液；离心：6500 rpm、<2 min；荧光检测：激发350 nm/发射451 nm
2.6 分析方法
细胞生长通过紫外分光光度计在600 nm波长下测定（OD600）。残余葡萄糖浓度使用SBA-40E生物传感器（山东省科学院，中国）定量。NAM和NMN水平通过配备ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm × 150 mm，Waters）的HPLC系统测定。检测温度设定为30°C。流动相由20 mM乙酸铵溶液和纯乙腈组成（95:5，v/v）。同时采用荧光法检测48孔板发酵中的NMN滴度（Zhang et al., 2011）。
【数据】OD600检测波长：600 nm；HPLC色谱柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm × 150 mm）；检测温度：30°C；流动相：20 mM乙酸铵/乙腈=95:5（v/v）
2.7 机器学习方法
数据准备阶段，首先移除Sanger测序中含有突变或缺失值的条目，并合并具有相同组合的条目。采用三种机器学习算法分析数据集，包括随机森林（RF）、XgBoost（XGB）和支持向量机（SVR）。模型训练时，数据集以80:20的比例随机分为训练集和测试集。对于每个模型的超参数调优，采用贝叶斯优化来优化模型性能，并使用5折交叉验证防止过拟合。为确保可重复性，所有数据分割和优化步骤中设置随机种子为35。训练模型性能和预测准确性通过R平方（R²）评估。三种模型预测的前1%组合列于补充材料。本研究中所有代码可在GitHub获取：https://github.com/SonglabTjU/ML_NMN_Redox。
【数据】数据分割：80:20（训练集:测试集）；交叉验证：5折；随机种子：35；评估指标：R²；筛选阈值：前1%组合
2.8 统计分析
本研究展示的数据为三次独立实验的平均值和标准差。数据显著性差异通过GraphPad Prism 8.0.2使用双尾Student's t检验确定。
【数据】重复次数：3次独立实验；统计方法：双尾Student's t检验；软件：GraphPad Prism 8.0.2
研究结果
3.1 工程化NMN生物合成相关通路增强NMN产量与辅因子水平
在大肠杆菌中，NMN主要由NAD+通过核苷三磷酸二磷酸酶催化合成，由于NAD+代谢受细胞严格调控，这阻碍了NMN的过量积累。引入异源途径可以增强NMN生物合成并规避胞内调控。NAMPT是一种能够催化NAM和PRPP合成NMN的有效酶，广泛用于工程菌株中的NMN生物合成（图1a）。
以大肠杆菌BL21（WT）为起始菌株，过表达来自弧菌噬菌体KVP40的NAMPT（由基因nadV编码），构建重组大肠杆菌菌株S1，将NMN滴度提高至0.06 g/L（图1b）。随后，通过在菌株S1中依次敲除UDP-糖水解酶（ushA）、NMN腺苷酰转移酶（nadR）和NMN氨基水解酶（pncC），考察阻断NMN降解对细胞生长和NMN生产的影响，分别构建菌株S2、S3和S4。菌株S2、S3和S4的NMN滴度随这些基因修饰的组合而增加，最终菌株S4达到0.27 g/L，为菌株S1的4.5倍。
研究发现，不表达nadV的菌株S4的NMN滴度低于0.01 g/L（见补充材料），表明由NAD+二磷酸酶（nudC）和核苷三磷酸焦磷酸水解酶（mazG）介导的内在NMN生物合成能力较弱。因此考察了分别敲除这两种酶对NMN合成的影响，构建菌株S5和S6。有趣的是，菌株S5和S6的NMN滴度分别增加至0.33 g/L和0.38 g/L，同时ATP水平有所提高（图1b和补充材料）。NMN滴度的增加可能归因于NudC和MazG也参与ATP代谢，敲除这些酶可为NMN合成提供更多ATP。
尽管上述结果表明阻断NMN降解有利于NMN生物合成且不影响细胞生长，但大肠杆菌的内在NMN生物合成能力仍然较低。接下来，在菌株S6中引入来自蜡样芽孢杆菌的NMN转运蛋白（pnuC）以增加NMN外排，使所得菌株S7产生1.26 g/L NMN，较菌株S6提高2.3倍（图1c）。这些结果表明碳流被导向NMN合成，为NMN过量生产奠定了基础。
由于NMN由NAM和PRPP缩合而成，PRPP的可利用性需要提高以促进NMN生产。PRPP由PRPP合成酶（由基因prs编码）以ATP和核糖-5-磷酸为底物合成，而prs基因的表达受嘌呤核苷酸合成阻遏蛋白PurR调控，酶活性受ADP竞争性抑制。为规避这些调控，在菌株S7中进行了purR基因敲除和引入ADP抑制抗性PRPP合成酶突变体PrsD128A，分别构建菌株S8和S9。菌株S8在摇瓶培养中产生1.65 g/L NMN，进一步引入PrsD128A（菌株S9）使NMN滴度提高至1.80 g/L，较菌株S7提高43%（图1c）。
作为NAD(P)+生物合成的前体，NMN产量的增加可能影响工程大肠杆菌菌株的胞内辅因子水平（即NADH和NADPH水平）。为验证这一假设，分别评估了菌株WT和菌株S9中NADH和NADPH的水平。观察到随着NMN生物合成的增强，胞内NADH和NADPH水平均有所增加，菌株S9中分别达到0.48和0.43 μmol/OD600，比菌株WT（0.36和0.34 μmol/OD600）分别高出33%和26%（图1d）。这一结果与先前报道一致，表明增强NMN生物合成可通过影响辅因子代谢来影响细胞生理。综合来看，这些结果表明引入异源NMN途径并阻断NMN降解可增强大肠杆菌中的NMN生物合成，从而增加胞内辅因子水平。
【数据】菌株S1 NMN滴度：0.06 g/L；菌株S4 NMN滴度：0.27 g/L（为S1的4.5倍）；菌株S4（无nadV）NMN滴度：<0.01 g/L；菌株S5 NMN滴度：0.33 g/L；菌株S6 NMN滴度：0.38 g/L；菌株S7 NMN滴度：1.26 g/L（为S6的2.3倍）；菌株S8 NMN滴度：1.65 g/L；菌株S9 NMN滴度：1.80 g/L（较S7提高43%）；NADH水平：S9为0.48 μmol/OD600、WT为0.36 μmol/OD600（高33%）；NADPH水平：S9为0.43 μmol/OD600、WT为0.34 μmol/OD600（高26%）
3.2 重编程中心碳代谢将碳流导向NMN生物合成并升高NADPH水平
在发现解除嘌呤核苷酸生物合成抑制可增强NMN生产后，研究进一步尝试强化磷酸戊糖（PP）途径以最大化流向NMN的碳通量。在大肠杆菌中，PP途径在葡萄糖代谢第一步从Embden-Meyerhof-Parnas（EMP）途径分支碳流，而PP途径的通量分配本质上被EMP途径所压制。为克服这一限制，考察了敲除EMP和PP途径中多种酶（包括葡萄糖-6-磷酸异构酶（由基因pgi编码）、6-磷酸果糖激酶I（pfkA）、磷酸果糖激酶II（pfkB）、转醛醇酶A（talA）和转醛醇酶B（talB））对菌株S9的NMN滴度和细胞生长的影响（图2a）。
发酵结果显示，pgi基因的缺失限制了菌株S10的细胞生长，并使NMN滴度大幅降低43%，从1.80 g/L（菌株S9）降至1.02 g/L（图2b）。菌株S12中pfkB基因和菌株S14中talB基因的缺失也导致NMN滴度下降。相反，单独敲除pfkA基因（菌株S11）和talA基因（菌株S13）分别使NMN滴度提高至2.25和1.90 g/L，比菌株S9分别高出25%和6%（图2b）。
为进一步将碳流导向PP途径，在菌株S9的nudC基因座和mazG基因座处整合由启动子PJ23119驱动的zwf基因（编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）和gnd基因（编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶）进行同时过表达，构建菌株S15。菌株S15的NMN滴度为2.15 g/L，较菌株S9提高19%（图2b）。接下来，在菌株S9中同时进行zwf和gnd基因过表达以及pfkA和talA基因敲除，构建菌株S16。菌株S16的NMN滴度达到2.45 g/L，较菌株S9提高36%，但这些正向代谢修饰对NMN生产的协同效应似乎有所减弱（图2b）。此外，菌株S16的最大生长速率（0.18/h）低于菌株S9（0.29/h），菌株S16的OD600值（OD600=4.88）较菌株S9（OD600=6.09）降低20%（图2c）。
先前研究表明，中心碳代谢的重编程容易破坏胞内氧化还原稳态并延缓细胞生长。由于工程化NMN生物合成相关代谢网络已改变菌株中的辅因子水平，推测强化PP途径加剧了氧化还原失衡，从而限制了细胞生长和NMN合成。这一假设随后通过胞内NADPH测定得到证实，结果显示与菌株S9相比，除敲除talB基因的菌株S14外，所有工程菌株的NADPH水平均有所增加（图2d）。值得注意的是，菌株S16的NADPH水平（0.69 μmol/OD600）较菌株S9（0.40 μmol/OD600）增加了73%，而胞内NADH水平和NADH/NAD+比值仅略高于菌株S9（<10%）（见补充材料）。为监测菌株S9和S16在发酵过程中的NADPH水平，使用了一种能够通过结合NADPH而展现蓝色荧光的宏基因组来源蓝色荧光蛋白（mBFP）。
【数据】菌株S10 NMN滴度：1.02 g/L（较S9降低43%）；菌株S11 NMN滴度：2.25 g/L（较S9提高25%）；菌株S13 NMN滴度：1.90 g/L（较S9提高6%）；菌株S15 NMN滴度：2.15 g/L（较S9提高19%）；菌株S16 NMN滴度：2.45 g/L（较S9提高36%）；最大生长速率：S16为0.18/h、S9为0.29/h；OD600：S16为4.88、S9为6.09（降低20%）；NADPH水平：S16为0.69 μmol/OD600、S9为0.40 μmol/OD600（增加73%）；NADH/NAD+比值差异：<10%
讨论与解读
本研究描述了一种基于代谢重编程和机器学习引导辅因子工程的协同策略，用于提升大肠杆菌中NMN的生物合成。中心碳代谢的重编程将碳流重新导向NMN生物合成，而QS控制的辅因子工程系统缓解了由此产生的NADPH过剩，改善了细胞生长和补料分批发酵中的NMN产量。研究凸显了维持氧化还原稳态对高效NMN生物合成的重要性。ML引导的辅因子工程策略可应用于精准操控工程菌株的胞内氧化还原状态，从而促进有价值产物的生物合成。
编译者解读：本研究的方法论亮点在于将机器学习引入辅因子工程的优化循环中，以数据驱动方式替代传统的试错式菌株改造。QS系统实现辅因子水平的自我调控，避免了组成型表达带来的持续代谢负担，这一设计思路对其它依赖还原力平衡的产物合成具有借鉴价值。然而，20.13 g/L的产量虽在摇瓶水平上提升显著，工业放大中的成本控制与诱导策略仍需进一步优化。mBFP荧光探针用于实时监测NADPH的策略也为发酵过程的动态调控提供了新工具。整体而言，该工作展示了"通路工程+调控工程+智能化化"三位一体的菌株开发范式。
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132350