来源：Global metabolic rewiring of the nonconventional yeast Ogataea polymorpha for biosynthesis of the sesquiterpenoid β-elemene（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
β-榄香烯是具抗肿瘤活性的倍半萜化合物，传统依赖植物提取，供应受限。本研究以耐热工业非常规酵母Ogataea polymorpha为底盘，通过系统优化甲羟戊酸（MVA）途径、增强NADPH与乙酰-CoA供应、下调竞争途径，实现了β-榄香烯的高水平合成。工程菌株在摇瓶和补料分批发酵中分别产出509 mg/L和4.7 g/L β-榄香烯，展示了该非常规酵母作为萜类合成微生物平台的工业潜力。
研究背景
萜类化合物是药物、化妆品和食品的重要来源，包括抗疟药青蒿素、抗氧化剂虾青素、抗肿瘤药紫杉醇、维生素E和香料芳樟醇等。利用微生物细胞工厂生产复杂萜类已成为植物提取的替代方案。酵母因具备内源MVA途径（可生成异戊二烯前体）而成为萜类生产的重要宿主。模式酵母酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中已实现多种萜类的高水平生产，例如重构菌株高效生产青蒿酸、β-法尼烯和香紫苏醇。近年来，非常规酵母因其独特优势（如解脂耶氏酵母富含天然脂滴利于储存亲脂性萜类）而迅速成为优良底盘。Ogataea polymorpha是一种用于蛋白表达的工业酵母，具有耐热、底物谱广、高密度发酵等优点，但此前尚未有将其工程改造用于倍半萜合成的报道。本研究首次系统重塑O. polymorpha的细胞代谢，实现倍半萜β-榄香烯的高效合成。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养基
本研究所构建的全部菌株列于表S1。gRNA及其他表达质粒按先前描述构建（Yu et al., 2021），全部质粒列于表S2。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，列于表S3。YPD培养基含10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨和20 g/L葡萄糖，用于种子细胞培养。合成液滴（SD）固体培养基（6.7 g/L酵母氮碱、20 g/L葡萄糖和18–20 g/L琼脂）用于重组菌株筛选。gRNA去除时，菌株在YPD+5-FOA平板上培养，该平板含YPD、18–20 g/L琼脂和1 g/L 5-氟乳清酸。Delft极限培养基（pH 5.6）用于发酵，含2.5 g/L (NH₄)₂SO₄、14.4 g/L KH₂PO₄、0.5 g/L MgSO₄·7H₂O、20 g/L葡萄糖、2 mL/L微量元素（3.0 g/L FeSO₄·7H₂O、4.5 g/L ZnSO₄·7H₂O、4.5 g/L CaCl₂·2H₂O、1 g/L MnCl₂·4H₂O、300 mg/L CoCl₂·6H₂O、300 mg/L CuSO₄·5H₂O、400 mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、1 g/L H₃BO₃、100 mg/L KI、19 g/L Na₂EDTA·2H₂O）和1 mL/L维生素溶液（50 mg/L D-生物素、1.0 g/L D-泛酸半钙盐、1.0 g/L硫胺素-HCl、1.0 g/L吡哆醇-HCl、1.0 g/L烟酸、0.2 g/L 4-氨基苯甲酸、25 g/L肌醇），必要时补充20 mg/L尿嘧啶。大肠杆菌DH5α用于质粒扩增，在含10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl的LB培养基中培养，并添加100 μg/mL氨苄青霉素维持质粒。除标准品β-石竹烯（#C832338；CAS: 87-44-5）和β-榄香烯（#E885859；CAS:515-13-9）购自Macklin外，所有试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
【数据】YPD培养基：10 g/L酵母提取物+20 g/L蛋白胨+20 g/L葡萄糖；SD培养基：6.7 g/L YNB+20 g/L葡萄糖+18–20 g/L琼脂；YPD+5-FOA：含1 g/L 5-氟乳清酸；Delft培养基pH 5.6；氨苄青霉素：100 μg/mL；标准品CAS号：87-44-5（β-石竹烯）、515-13-9（β-榄香烯）
2.2 DNA操作
本研究所用基因均注释于表S4，附NCBI登录号（内源基因）或基因序列（密码子优化的异源基因）。异源基因经密码子优化后由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。由于O. polymorpha NCYC 495 leu1.1基因组注释有限，相关基因通过对O. parapolymorpha DL-1或S. cerevisiae S288C基因组进行同源搜索鉴定，而CLN2 PEST（Peng et al., 2017）直接从S. cerevisiae克隆获得。为实现稳定表达，所有基因表达盒通过CRISPR-Cas9基因组工程技（Gao et al., 2021）整合至先前表征的基因组中性位点（Yu et al., 2021）。基因表达盒通过重叠延伸PCR构建（Zhou et al., 2012），包含整合中性位点的1000 bp上下游同源臂（HAs）、启动子、结构基因和终止子。多片段组装按先前报道进行（Gao et al., 2021），在启动子或终止子区域含1000 bp同源臂。所用启动子由本实验室鉴定（Yan et al., 2022; Zhai et al., 2021）。低亲和力葡萄糖转运蛋白基因HXT1（NCBI gene ID: 28918928）编码序列上游1000 bp片段被鉴定为启动子PopHXT1，该启动子在本研究中得到表征。蛋白融合表达使用连接肽GGGGS（Hu et al., 2017）。CRISPR-Cas9基因组编辑技术按先前描述进行遗传操作（Gao et al., 2021），将500 ng sgRNA和500 ng供体DNA通过电转化法转入感受态细胞。
【数据】同源臂长度：1000 bp；连接肽：GGGGS；sgRNA用量：500 ng；供体DNA用量：500 ng；转化方法：电转化
2.3 批次与补料分批发酵
经菌落PCR验证后，正确转化子通过发酵评估。发酵时，菌株先在YPD平板上划线培养3–5天，然后挑取单菌落接种于15 mL试管中的2.5 mL YPD培养基预培养。培养16–20 h后，收集酵母细胞并重悬于Delft极限培养基中，然后以初始OD₆₀₀=0.2转接至含15 mL Delft极限培养基的100 mL摇瓶中。此外，向培养物中添加10%（v/v）十二烷以捕获β-榄香烯。菌株在37°C、220 rpm条件下培养72 h。补料分批发酵使用50 mL YPD或Delft极限培养基置于250 mL摇瓶中，添加20%十二烷进行两相发酵。菌株先在YPD培养基中预培养，然后以初始OD₆₀₀=0.4（Delft）或0.2（YPD）接种至发酵培养基。每24 h取样测定产物滴度和OD₆₀₀。每24 h用4 M KOH将培养物pH调至5–6。补料分批过程中，检测残余葡萄糖以确定补料速率。当培养基中葡萄糖浓度低于5 g/L时，向细胞补加1–2 mL含12.5 g/L (NH₄)₂SO₄、72 g/L KH₂PO₄、2.5 g/L MgSO₄·7H₂O、10×微量元素和5×维生素溶液的500 g/L葡萄糖补料液，或含20 g/L酵母提取物和40 g/L蛋白胨的500 g/L葡萄糖补充液。
【数据】预培养时间：16–20 h；初始OD₆₀₀：0.2（批次/Delft补料）或0.4（Delft补料）；十二烷添加量：10%（v/v，批次）或20%（补料分批）；温度：37°C；转速：220 rpm；发酵时间：72 h（批次）；pH调节：4 M KOH调至5–6，每24 h一次；补料触发浓度：葡萄糖<5 g/L；补料体积：1–2 mL；补料葡萄糖浓度：500 g/L
2.4 产物与生物量分析
培养72 h后，通过OD₆₀₀测量生物量，收集有机层进行产物分析。有机相以13,000×g离心5 min去除细胞碎片，并用含50 mg/L β-石竹烯（内标）的十二烷稀释至适当范围。β-榄香烯含量通过外标校准计算，并用内标β-石竹烯校正。最终滴度由浓度比计算得出。采用GC-MS（Thermo Fisher Scientific）进行定性分析，数据在全扫描模式（50–650 m/z）下采集。定量使用配备Zebron ZB-5MS GUARDIAN毛细管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）的GC-FID仪器（Focus GC，Thermo Fisher Scientific）。进样口温度设为250°C，柱温箱程序如下：70°C起始保持1 min，以10°C/min升至200°C，最后以90°C/min升至320°C并保持3 min。
【数据】离心：13,000×g，5 min；内标：50 mg/L β-石竹烯；GC-MS扫描范围：50–650 m/z；进样口温度：250°C；升温程序：70°C（1 min）→10°C/min至200°C→90°C/min至320°C（保持3 min）
2.5 残余葡萄糖检测
残余葡萄糖浓度使用SBA-40D生物传感器（山东省科学院生物研究所，山东，中国）按说明书测定。
【数据】检测仪器：SBA-40D生物传感器
2.6 荧光测定
工程菌株在极限培养基中培养，分别于24 h、48 h、72 h和96 h取样。收集细胞并以13,000×g离心3 min，然后用H₂O洗涤两次，稀释至OD₆₀₀=1。随后用Tecan SPARK酶标仪（Tecan，瑞士）按先前描述进行测定（Yu et al., 2021）。
【数据】取样时间点：24 h、48 h、72 h、96 h；离心：13,000×g，3 min；测定OD₆₀₀：1
2.7 NADPH测定
菌株YY-9和YY-12用于NADPH/NADP⁺定量，按先前报道（Cai et al., 2022; Gao et al., 2022）略作修改。细胞在Delft极限培养基中以初始OD₆₀₀=0.2培养，在对数前期（OD₆₀₀为2–4）收集。离心（3000×g，5 min）并用PBS洗涤两次后，细胞立即重悬于0.3 mL 0.2 M HCl（用于NADP⁺）或0.2 M NaOH（用于NADPH）中。然后向细胞中加入玻璃珠，在冰浴支架中以70 Hz剧烈振荡140 s两次，彻底破碎细胞。重复八次后于60°C加热30 min。接下来，加入0.3 mL 0.2 M HCl（用于NADPH）或0.2 M NaOH（用于NADP⁺）中和提取液，并以13,000×g离心5 min。循环测定使用由等体积1.0 M Bicine缓冲液（pH 8.0）、30 mM葡萄糖-6-磷酸、40 mM EDTA（pH 8.0）和4.2 mM 3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物（MTT）、两倍体积16.6 mM吩嗪硫酸乙酯和三倍体积水组成的试剂混合物。反应试剂包含10 μL中和提取液和180 μL试剂混合物。
【数据】初始OD₆₀₀：0.2；收集OD₆₀₀：2–4；离心：3000×g，5 min；破碎：70 Hz，140 s×2次，重复8次；加热：60°C，30 min；最终离心：13,000×g，5 min；Bicine缓冲液：1.0 M（pH 8.0）；MTT浓度：4.2 mM
研究结果
3.1 在O. polymorpha中评估不同germacrene A合酶
β-榄香烯由germacrene A在热诱导条件下（如气相色谱进样口250°C）通过自发Cope重排生成，甚至在长期冷冻条件下也可发生。Germacrene A合酶催化FPP环化生成germacrene A（图2A）。因此，我们首先比较了几种已报道的germacrene A合酶（表S5）：来自莴苣（Lactuca sativa）的LsLTC2（Bennetta et al., 2002），该酶已用于酿酒酵母中β-榄香烯生产（Hu et al., 2017）；来自菊苣（Cichorium intybus）的CiGASsh，具有较低Km值（Bouwmeester et al., 2002）；来自Barnadesia spinosa的BsGAS2，具有较高Kcat值（Nguyen et al., 2016）；以及来自除虫菊（Tanacetum cinerariifolium）的TcGAS（Ramirez et al., 2013）。经密码子优化后，这些合酶在强组成型启动子PGAP1控制下于附加体质粒中表达，LsLTC2表现出最佳的β-榄香烯生产能力（图S1A）。随后，将这些合酶基因整合至O. polymorpha Ku80ΔL基因组中，整合的LsLTC2表达在极限培养基中培养72 h后获得最高β-榄香烯滴度19 mg/L；因此，该基因被用于后续研究（图2B）。
【数据】β-榄香烯最高滴度：19 mg/L（LsLTC2整合表达，极限培养基，72 h）；比较的合酶：LsLTC2、CiGASsh、BsGAS2、TcGAS
3.2 调控MVA途径基因大幅提升β-榄香烯产量
在酵母中，FPP通过MVA途径合成（图2A），优化MVA途径是提高萜类产量的必要手段（Paramasivan and Mutturi, 2017）。已有报道将倍半萜合酶与Erg20融合（Hu et al., 2017; Liu et al., 2019）可形成FPP向倍半萜转化的直接通道，同时最小化FPP的竞争性消耗。因此，通过连接肽GGGGS构建了N端和C端融合体（LE：LsLTC2-GGGGS-ERG20和EL：ERG20-GGGGS-LsLTC2）。这两种融合体产生的β-榄香烯滴度远高于单独基因表达。值得注意的是，融合体EL（菌株YY-EL）实现了191 mg/L的β-榄香烯产量，比YY-Ls高10倍（图2B）。随后，我们尝试增强MVA途径的每一步以促进β-榄香烯生产（图2C）。HMGR（3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶）是MVA途径的限速基因（Paramasivan and Mutturi, 2017），其截短形式tHMGR在细胞质中更稳定（Donald et al., 1997）。首先，基于与酿酒酵母HMGR的同源性（Polakowski et al., 1998），对O. polymorpha天然HMGR进行截短；删除HMGR的前513个氨基酸，生成tHMGR。然后在强组成型启动子PADH1控制下过表达tHMGR，但仅观察到轻微提升。第二，过表达ERG10和ERG13以驱动更多碳通量进入MVA途径。值得注意的是，YY-1的滴度较对照菌株YY-t增加了35%。其他基因（如ERG12和ERG8）的过表达对提高β-榄香烯产量贡献甚微，而涉及IPP与DMAPP异构化的IDI1基因与YY-4相比显著促进了β-榄香烯产量（P值<0.05）。摇瓶发酵72 h后，菌株YY-9产出336 mg/L β-榄香烯，比起始菌株YY-EL高76%。然而，进一步增加IDI1或tHMGR的拷贝数对β-榄香烯产量产生负面影响。
【数据】EL融合体（YY-EL）产量：191 mg/L（较YY-Ls高10倍）；YY-1较YY-t提升35%；YY-9产量：336 mg/L（较YY-EL高76%）；HMGR截短：删除前513 aa；IDI1显著性：P<0.05
3.3 增强NADPH和乙酰-CoA供应
异戊二烯生物合成需要充足的辅因子NADPH作为驱动力。为增加NADPH库，我们首先通过过表达FBP1（果糖-1,6-二磷酸酶）、ZWF1（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）和GND1（6-磷酸葡糖酸脱氢酶）增强磷酸戊糖途径（PPP）（Bertels et al., 2021）（图3A），所得菌株YY-12较YY-9多产21%的β-榄香烯（405 mg/L）（图3B）。值得注意的是，我们发现过表达在对数早期导致NADPH/NADP⁺比值显著升高（图3C）。然而，进一步过表达IDP2（编码来自酿酒酵母的NADP⁺依赖性异柠檬酸脱氢酶）以产生NADPH，以及整合另一拷贝tHMGR，均未能提高β-榄香烯滴度（图S2A）。此外，通过表达来自酿酒酵母的MDH（苹果酸脱氢酶）和来自圆红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）的ME（苹果酸酶）（Ratledge, 2014; Zhou et al., 2016）构建苹果酸循环以供应NADPH（图3A），结果导致严重生长缺陷（图S2B），可能是由于代谢失衡。作为一种Crabtree阴性酵母，O. polymorpha中从葡萄糖-6-磷酸（G6P）到PPP的代谢通量远高于酿酒酵母（Fiaux et al., 2003; Malina et al., 2021），尤其在过表达ZWF1和GND1之后。因此，引入来自明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）的PK（磷酸酮醇酶）和来自克鲁维梭菌（Clostridium kluyveri）的PTA（磷酸转乙酰酶）以重连PPP通量并合成更多乙酰-CoA（图3A）。为避免类似酿酒酵母中的乙酸盐积累（Meadows et al., 2016），我们用柔性连接肽GGGGS对PK和PTA进行融合表达，并删除了磷酸酶基因GPP1（与酿酒酵母GPP1有35%同一性）。PK∼PTA融合（菌株YY12–P3）较亲本菌株YY12略微提高了β-榄香烯产量（图3D），GPP1缺失（菌株YY-82）较YY12–P3进一步将β-榄香烯产量提高11.4%（图3E）。随后，过表达PPP关键基因（包括RPE、SOL、TKL1、TAL和PGI1（葡萄糖磷酸异构酶））以平衡G6P和F6P水平，获得YY-79，其β-榄香烯产量较YY12–P3高11%。然而，这些策略的组合未显示进一步改善（YY-89，图3E）。随后我们寻找其他策略进一步增强前体乙酰-CoA库（图S3A）。令人惊讶的是，截短的内源丙酮酸脱氢酶（PDH）复合体（Claros and Vincens, 1996）或来自大肠杆菌的突变PDH（Cardenas and Da Silva, 2016）以及PDH旁路（来自酿酒酵母的PDC1、ALD6和来自肠道沙门氏菌的ACS L641P）（Shiba et al., 2007）均未显示对β-榄香烯产量的改善（图S3B）。类似地，通过过表达己糖激酶促进葡萄糖利用，或通过删除丙酮酸载体基因MPC2和胞质肉碱乙酰转移酶YAT2阻断丙酮酸和乙酰-CoA转运至线粒体（Cardenas and Da Silva, 2016），均未显著促进β-榄香烯产量（图S3C和D）。删除线粒体孔蛋白基因POR2甚至导致更长的延滞期。另一方面，我们尝试通过引入柠檬酸裂解酶旁路途径将代谢通量从TCA循环导向胞质乙酰-CoA供应——该策略在酿酒酵母中提高了脂肪酸产量（Zhou et al., 2016）；然而这导致了生长缺陷（图S3E–G）。
【数据】YY-12较YY-9提高21%（405 mg/L）；GPP1缺失（YY-82）较YY12–P3提高11.4%；YY-79较YY12–P3提高11%；PK-PTA连接肽：GGGGS；GPP1与酿酒酵母GPP1同一性：35%；PPP基因：FBP1、ZWF1、GND1、RPE、SOL、TKL1、TAL、PGI1
3.4 下调ERG9表达与操纵转录因子
接下来我们探索如何通过下调竞争途径减少FPP消耗。ERG9将FPP转化为角鲨烯用于甾醇合成，但该途径不能完全阻断，因为角鲨烯是细胞膜的必要组分（图4A）（Jennings et al., 1991）。在酿酒酵母中，ERG9在转录水平被动态调控——用葡萄糖诱导型启动子PHXT1替换天然启动子以平衡细胞生长与产物合成之间的代谢通量分配，该策略已被证明可有效降低麦角甾醇（Scalcinati et al., 2012）或角鲨烯含量（Dong et al., 2020; Wang et al., 2021）。类似地，我们首先测试了内源PopHXT1或酿酒酵母PscHXT1驱动GFPuv在O. polymorpha中表达的效果。PopHXT1在整个过程中组成型表达，如
【数据】ERG9功能：FPP→角鲨烯；ERG9启动子替换策略：葡萄糖诱导型启动子PHXT1（酿酒酵母中验证）；候选启动子：PopHXT1、PscHXT1
3.5 补料分批发酵
原养型菌株YY-100U用于补料分批发酵评估。使用Delft极限培养基（图5A）或YPD培养基（图5B）培养菌株，待所有葡萄糖消耗完后补加含500 g/L葡萄糖的Delft极限培养基（图5A）或YPD培养基（图5B）。在YPD中培养的细胞在216 h停止生长，因此
【数据】补料葡萄糖浓度：500 g/L；YPD培养停止生长时间：216 h
讨论与解读
本研究系统探索了O. polymorpha生产倍半萜的潜力，通过优化MVA途径、增强辅因子NADPH和前体乙酰-CoA的供应，实现了该非常规酵母中倍半萜β-榄香烯的高水平生产，在极限培养基中获得最高滴度。作为O. polymorpha工程化生产倍半萜的首次尝试，研究系统评估了MVA途径各基因。将Erg20与合酶LsLtc2融合以及通过促进Erg9降解下调角鲨烯合成显著提高了β-榄香烯产量，表明充足的直接前体FPP供应对倍半萜生产至关重要。出乎意料的是，过表达在酿酒酵母中通常被视为限速基因的tHMGR对提高β-榄香烯产量无显著效果。过表达上游基因ERG10和ERG13使β-榄香烯滴度提高35%，表明上游HMG-CoA供应是O. polymorpha中异戊二烯生物合成的瓶颈。过表达
编译者解读
本研究在非常规酵母底盘选择上颇具巧思——O. polymorpha的Crabtree阴性特征使PPP通量天然高于酿酒酵母，这为NADPH供应策略提供了独特优势。方法层面，ERG20与合酶的融合表达、PK-PTA融合加GPP1缺失的乙酰-CoA强化设计，均体现了"通量通道化"的合成生物学核心思路。值得注意的是，PDH旁路、苹果酸循环等经典策略在酿酒酵母中有效却在此失效，提示不同酵母底盘间代谢调控逻辑存在显著差异。509 mg/L（批次）与4.7 g/L（补料分批）的产量差距也说明，发酵工艺优化对释放菌株潜力同样关键。该工作为非常规酵母的萜类合成提供了可借鉴的系统性改造范式。
参考来源
期刊：Metabolic Engineering, 2023
DOI: 10.1016/j.ymben.2023.02.008
DOI: 10.1016/j.ymben.2023.02.008