来源：Single cell oil enriched in ricinoleic acid biosynthesis from glucose via metabolically rewired oleaginous yeast（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
蓖麻油酸是工业高价值羟基脂肪酸，传统来源为蓖麻籽油，但存在毒性、环境风险与供应不稳定等问题。本研究以产油酵母解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）为底盘，通过多维度代谢重编程——增强油酰-CoA前体供给、模拟植物酰基编辑、促进甘油三酯组装、抑制竞争降解途径——最终工程菌株YY-20在摇瓶中积累729.4 mg/L蓖麻油酸，5-L生物反应器补料分批发酵更创下6.0 g/L的纪录性产量。该研究为羟基脂肪酸及高价值非常规脂肪酸的工业化生物制造提供了可扩展的平台。
研究背景
蓖麻油酸（12-羟基-十八碳-顺-9-烯酸，C18:1-OH）是一种罕见的羟基化脂肪酸，在蓖麻籽中约占脂肪酸总量的90%。凭借其独特的羟基与不饱和双键，蓖麻油酸可作为多种工业衍生物的中间体，广泛应用于增塑剂、润滑剂、染料、油墨、肥皂、粘合剂、医药、涂料、食品添加剂、表面活性剂、电子元件及生物燃料等领域。然而，传统蓖麻种植与加工面临种植区域受限、剧毒蛋白蓖麻毒素带来的安全风险等制约。微生物合成提供了一条更安全、可持续的替代路径——无需土地耕作、缩短生产周期，且以单细胞油（SCO）形式生产蓖麻油酸相比游离脂肪酸具有更高的稳定性和更低的细胞毒性。
研究方法
2.1 培养条件
本研究中所有工程化 Y. lipolytica 菌株均来源于底盘菌株 Y. lipolytica Po1f-Δku70，在标准酵母蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基中、30°C、250 rpm条件下培养。Escherichia coli DH5α 在含有氨苄青霉素的 Luria-Bertani（LB）培养基中、37°C、200 rpm条件下培养。使用不含尿嘧啶的合成完全培养基（SC-Ura）和不含亮氨酸的合成完全培养基（SC-Leu）平板分离相应的酵母转化子。URA3标记通过在含有0.8 g/L 5-FOA的YPD平板（含20 g/L胰蛋白胨）上筛选进行回收。摇瓶发酵时，菌株先在5 mL YPD培养基中培养约24小时。所得种子培养物以600 nm光密度（OD600）为0.05的初始接种量转接至100 mL发酵培养基中，于30°C、250 rpm条件下培养120小时。生物量与葡萄糖浓度分析参照前期工作。YPD培养基、LB培养基、摇瓶发酵培养基、SC-Ura平板和SC-Leu平板的组成亦已在前期研究中描述（Wang et al., 2023）。
【数据】培养基：YPD/LB；温度：30°C（酵母）/37°C（大肠杆菌）；转速：250 rpm（酵母）/200 rpm（大肠杆菌）；时间：24h（种子）/120h（发酵）；OD600：0.05；5-FOA浓度：0.8 g/L；胰蛋白胨：20 g/L
2.2 质粒构建
以下异源基因的氨基酸序列从NCBI数据库获取：来自蓖麻（Ricinus communis）的溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶RcLpcat（GenBank: KC540908.1）、磷脂酰甘油酰基转移酶RcLro1（GenBank: NM_001323733.1）；来自高山被孢霉（Mortierella alpina）的脂肪酸延长酶MaElo2（GenBank: AB468587.1）；来自禾柄锈菌（Puccinia graminis）的Δ9脱饱和酶PgScd（GenBank: XP_003326562.1）；来自紫麦角菌（Claviceps purpurea）的Δ12-油酸羟化酶CpFah12（GenBank: HG326650.1）；来自铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的β-丙氨酸-丙酮酸转氨酶PaBaua（NCBI Reference Sequence: WP_162962692.1）；以及来自橙色绿屈挠菌（Chloroflexus aurantiacus）的丙二酰-CoA还原酶C端片段CaMcr-C（Kabasakal et al., 2024）。本研究中使用的异源基因列于表S4。异源基因经密码子优化后由Genewiz（中国）合成并插入pUC-57质粒。内源基因CPT（YALi0C10989g）、LRO1（YALI0C10989g）、DGA1（YALI0E32769g）、DGA2（YALI0D07986g）、TGL4（YALI0F10010g）和PEX10（YALI0C01023g），以及启动子序列PTEFin、PGPDin、PFBAin和PEXP，终止子序列xpr2t、cyc1t、mig1t、pex10t和lip2t均从 Y. lipolytica Po1f-Δku70基因组中提取。质粒pUC-LEU-A08、pUC-HUH-7h、pUC-HUH-IntC和pUC-HUH-IntD储存于实验室，分别用于将内源或外源基因表达盒整合至A08、7h、IntC和IntD位点。这些中性整合位点的上下游同源臂序列列于表S5。本研究所用质粒列于表S2，引物列于表S3。质粒构建方法与实验室前期工作相同（Zhou et al., 2025）。
【数据】异源基因数：7个（RcLpcat、RcLro1、MaElo2、PgScd、CpFah12、PaBaua、CaMcr-C）；整合位点：A08、7h、IntC、IntD；质粒骨架：pUC-57/pUC-LEU-A08/pUC-HUH系列
2.3 菌株构建
本研究所用菌株列于表1。用于代谢工程改造的初始菌株为 Y. lipolytica Po1f-Δku70，该菌株敲除了KU70基因以提高同源重组（HR）效率。E. coli DH5α 用于质粒构建与扩增，所有质粒均携带氨苄青霉素抗性基因。质粒pUC-LEU-A08-CpFAH12、pUC-HUH-Δfad2、pUC-HUH-Δdga1、pUC-HUH-Δdga2、pUC-HUH-Δpex10、pUC-HUH-Δtgl4、pUC-HUH-Δlro1、pUC-HUH-Δscd、pUC-HUH-IntB-CpFAH12、pUC-HUH-IntF-CpFAH12、pUC-HUH-Δscd-PgSCD、pUC-HUH-SCP2-MaELO2、pUC-HUH-SCP2-MaELO2-ELO1、pUC-HUH-IntC-YlCPT、pUC-HUH-IntC-RcLPCAT、pUC-HUH-IntC-YlCPT-RcLPCAT、pUC-HUH-7h-YlCPT、pUC-HUH-Δlro1-YlLRO1、pUC-HUH-Δlro1-RcLRO1、pUC-HUH-IntD-YlLRO1和pUC-HUH-Δdga1-PaBAUA-CaMCR-R分别用NotI、SspI、EcoRI、KpnI和HindIII限制性内切酶线性化后，使用Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit（Zymo Research，美国）导入Po1f-Δku70。转化方法与实验室前期工作一致（Wang et al., 2023）。
【数据】限制性内切酶：NotI、SspI、EcoRI、KpnI、HindIII；转化试剂盒：Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit；底盘菌株：Po1f-Δku70（KU70敲除）
2.4 分析方法
脂质提取与定量参照前期工作（Wang et al., 2022a）采用GC-FID进行。所有脂肪酸和脂质均以脂肪酸甲酯（FAMEs）形式定量。FAMEs通过与十三烷酸甲酯（C13:0 FAME）内标归一化的FAME标准品比较进行定量。总脂肪酸甲酯为十六种FAMEs（Sigma-Aldrich，美国）之和，包括棕榈酸甲酯（C16:0 FAME）、顺-7-十六碳烯酸甲酯（C16:1 Δ7 FAME）、棕榈油酸甲酯（C16:1 Δ9 FAME）、硬脂酸甲酯（C18:0 FAME）、油酸甲酯（C18:1 Δ9 FAME）、异油酸甲酯（C18:1 Δ11 FAME）、亚油酸甲酯（C18:2 Δ9Δ12 FAME）、花生酸甲酯（C20:0 FAME）、顺-11-二十碳烯酸甲酯（C20:1 Δ11 FAME）、顺-13-二十碳烯酸甲酯（C20:1 Δ13 FAME）、山嵛酸甲酯（C22:0 FAME）、顺-13-二十二碳烯酸甲酯（C22:1 Δ13 FAME）、顺-15-二十二碳烯酸甲酯（C22:1 Δ15 FAME）、木蜡酸甲酯（C24:0 FAME）、顺-15-二十四碳烯酸甲酯（C24:1 Δ15 FAME）和顺-17-二十四碳烯酸甲酯（C24:1 Δ17 FAME）。
胞内游离脂肪酸的提取步骤为：取1 mL发酵液加入破碎管中，10,000 rpm离心1 min，弃上清。细胞沉淀用1 mL去离子水重悬，再次离心并弃上清。加入1 mL含2 mM十二烷酸（内标）的乙酸乙酯和约0.2 g的0.5 mm玻璃珠，使用珠磨仪破碎细胞，15,000 rpm涡旋30 min。裂解液以12,000 rpm离心2 min，取100 μL上清转移至1.5 mL离心管中，加入50 μL甲醇、50 μL乙醚和20 μL三甲基硅烷基重氮甲烷进行硅烷化处理。混合物在30°C振荡30 min。有机相过滤后，使用HP-5色谱柱进行分析，条件为：150°C保持1 min，以10°C/min升至250°C，250°C保持3 min。进样口和火焰离子化检测器（FID）均设定为280°C。
发酵上清液中游离脂肪酸检测：取1 mL发酵液，10,000 rpm离心1 min，取500 μL上清液用HCl酸化至pH 2.0。加入1 mL含2 mM十二烷酸（内标）的乙酸乙酯，混合物在15,000 rpm涡旋30 min。取100 μL有机相转移至1.5 mL离心管中，加入50 μL甲醇、50 μL乙醚和20 μL三甲基硅烷基重氮甲烷。30°C振荡30 min后，有机相过滤，使用与胞内脂肪酸相同的GC条件进行分析。
【数据】内标：2 mM十二烷酸/十三烷酸甲酯；离心：10,000 rpm×1min、12,000 rpm×2min；破碎：0.5 mm玻璃珠、15,000 rpm×30min；硅烷化：30°C×30min；GC条件：150°C→250°C（10°C/min）；进样口/FID：280°C；pH：2.0
2.5 生物反应器发酵
补料分批发酵在5-L搅拌式生物反应器（T&J-Btype，J Bio-engineering Co., Ltd，上海，中国）中进行，操作参照前期描述。补料分批发酵持续约168小时，期间约每12小时取样2 mL。每份2 mL样品的细胞经两次洗涤后冷冻干燥，随后测定干细胞重（DCW）和葡萄糖浓度，并提取脂质进行脂肪酸定量（Wang et al., 2022a）。
【数据】反应器：5-L搅拌式（T&J-Btype）；发酵时间：约168h；取样间隔：约12h/次；取样量：2 mL
研究结果
3.1 工程化 *Y. lipolytica* 从磷脂合成蓖麻油酸
Y. lipolytica Po1f菌株主要通过非同源末端连接而非同源重组修复DNA双链断裂。提高同源重组效率的常用方法是抑制或敲除负责非同源重组机制的基因，如KU70（Kretzschmar et al., 2013）。因此，本研究以KU70敲除的Po1f-Δku70菌株作为起始菌株构建蓖麻油酸生产菌株。
首先，我们引入了密码子优化的CpFAH12（编码来自 C. purpurea 的Δ12油酸羟化酶），构建了菌株YY-1（图2a）。基因CpFAH12编码蓖麻油酸生产的关键酶，催化PC的sn-2位油酸羟基化生成蓖麻油酸。遗憾的是，在菌株YY-1中未检测到蓖麻油酸的积累（图2b）。在起始菌株的A08位点表达单拷贝CpFAH12但未检测到蓖麻油酸，推测是由于脂肪酸羟化酶表达量低。为进一步增强CpFAH12的异源表达，分别在IntB和IntF位点引入了第二和第三拷贝的CpFAH12表达盒，构建菌株YY-2和YY-3。结果显示，携带两拷贝CpFAH12的菌株YY-2中未检测到蓖麻油酸。然而，携带三拷贝的菌株YY-3中成功检测到蓖麻油酸，占总脂肪酸的2.4%，产量为14.8 mg/L。同时观察到脂质中亚油酸比例显著下降（图2b–d）。虽然产量和比例相对较低，但这一成果代表了 Y. lipolytica 中首次从头合成蓖麻油酸，为进一步优化奠定了平台基础。
【数据】菌株YY-1（单拷贝CpFAH12）：未检出蓖麻油酸；菌株YY-2（双拷贝）：未检出；菌株YY-3（三拷贝）：蓖麻油酸占比2.4%、产量14.8 mg/L
3.2 改变 *Y. lipolytica* 脂肪酸谱以提高蓖麻油酸比例
油酸是蓖麻油酸的直接前体，其高效进入PC池对蓖麻油酸生物合成至关重要。在 Y. lipolytica 中，胞质油酰-CoA首先掺入PC的sn-2位，成为CpFah12介导羟基化形成蓖麻油酸的底物。因此我们推测，扩大胞内油酸储库将增加底物可用性，从而增强蓖麻油酸的形成。
内源途径中，部分PC结合的油酸被Δ12脂肪酸脱饱和酶Fad2脱饱和产生α-亚油酸，形成了与蓖麻油酸合成直接竞争的代谢分支。为消除这一竞争通量并保留更多油酸用于羟基化，我们在生产菌株背景中敲除了FAD2，构建菌株YY-4。FAD2的敲除有效消除了大部分α-亚油酸的形成，将代谢通量重新导向蓖麻油酸。然而，α-亚油酸的积累并未完全消除，而是降至总脂肪酸的1.3%，这可能归因于CpFah12兼具羟基化和脱酰化双重功能（Park and Hahn, 2024）。结果，菌株YY-4的蓖麻油酸比例提高至总脂肪酸的4.4%，相应产量为27.7 mg/L（图3b和c）。这些结果证实，阻断Δ12脱饱和途径是提高 Y. lipolytica 中前体可用性和改善蓖麻油酸生物合成的有效策略，尽管α-亚油酸的部分积累提示可能仍需进一步优化以完全阻止竞争代谢通量。
为进一步提高蓖麻油酸生物合成，我们尝试通过增强饱和C16和C18脂肪酸的脱饱和来扩大胞内油酸池。在 Y. lipolytica 中，天然Δ9脱饱和酶Scd将双键引入棕榈酸和硬脂酸，分别生成棕榈油酸和油酸（Tsakraklides et al., 2018）。然而，Scd的底物特异性相对宽泛，可能导致大量棕榈油酸形成，从而将碳从作为蓖麻油酸直接前体的油酸池中分流。前期报道鉴定了一种来自 Phaeosphaeria graminis 的Δ9脱饱和酶（PgScd），其对硬脂酸具有显著更高的催化偏好性，能有效将其转化为油酸，同时将碳通量从棕榈酸转向硬脂酸并抑制非期望的棕榈油酸形成（Wang et al., 2022a）。基于这些发现，我们用PgSCD表达盒替换内源SCD基因，构建菌株YY-5。这一改造增加了胞内油酸丰度，使蓖麻油酸占总脂肪酸的5.1%，产量为33.2 mg/L（图3b和c）。
为强化代谢转变并进一步减少C16来源的中间产物，我们引入了第二拷贝PgScd，构建菌株YY-6。PgScd的双重表达将棕榈酸和棕榈油酸分别大幅降至总脂肪酸的14.3%和1.6%，同时将油酸提升至58.3%。得益于扩大的前体池，蓖麻油酸产量提高至总脂肪酸的6.3%，产量达到42.3 mg/L（图3b和c）。
为进一步将脂肪酸通量导向油酸并增强蓖麻油酸合成，我们靶向了 Y. lipolytica 的内源脂肪酸延长途径。该酵母拥有两种天然延长酶Elo1和Elo2（Rigouin et al., 2018）。Elo1主要将中链脂肪酸延长为长链脂肪酸，而Elo2催化后续延长步骤生成极长链脂肪酸。前期研究表明，引入 Mortierella alpina 延长酶MaElo2并同时过表达内源Elo1可提高细胞油酸水平，同时缓解脂肪酸代谢扰动相关的生长缺陷（Xue et al., 2013; Wang et al., 2022a）。此外，增强MaC16e或Elo1等延长酶活性已被报道可通过提高直接前体油酸的可用性来促进蓖麻油酸生物合成（Park and Hahn, 2024）。基于这些认识，我们在菌株YY-6的Scp2位点引入了MaELO2表达盒，构建菌株YY-7。如预期所料，MaElo2的表达显著降低了棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸的水平，与延长的增强活性一致。虽然观察到生物量略有下降（可能由脂肪酸稳态扰动引起），但扩大的油酸池将蓖麻油酸产量提高至总脂肪酸的7.8%，对应产量为52.2 mg/L。
为进一步强化来自C14和C16中间体的延长通量并尽量减少向棕榈油酸的代谢泄漏，我们在同一基因组位点整合了ELO1过表达盒，构建菌株YY-8。这一改造将棕榈油酸有效降至不可检测水平，并提高了油酸比例。结果，蓖麻油酸积累达到总脂肪酸的8.1%，产量为60.0 mg/L（图3b和c）。值得注意的是，YY-8相比YY-7还表现出改善的生物量和总脂质含量，表明MaELO2与ELO1的共表达不仅优化了前体供给，还恢复了脂质代谢平衡。
【数据】YY-4（Δfad2）：蓖麻油酸占比4.4%、产量27.7 mg/L，α-亚油酸降至1.3%；YY-5（Δscd::PgSCD）：占比5.1%、产量33.2 mg/L；YY-6（双拷贝PgScd）：占比6.3%、产量42.3 mg/L，棕榈酸14.3%、棕榈油酸1.6%、油酸58.3%；YY-7（+MaELO2）：占比7.8%、产量52.2 mg/L；YY-8（+MaELO2+ELO1）：占比8.1%、产量60.0 mg/L，棕榈油酸不可检测
3.3 工程化酰基编辑途径以改善磷脂酰胆碱池从而提高蓖麻油酸产量
Y. lipolytica 中的甘油三酯（TAG）生物合成由酰基-CoA二酰甘油酰基转移酶（DGATs）催化（Wang et al., 2024）。随着油酸在TAG中的积累……
【数据】原文未详述本节完整数据——后续工程步骤涉及Lro1过表达、PEX10与TGL4删除及NCM途径引入，最终菌株YY-20摇瓶蓖麻油酸729.4 mg/L、占总脂肪酸28.3%
3.4 5-L生物反应器补料分批发酵
在摇瓶水平优化的基础上，最终工程菌株YY-20在5-L生物反应器中进行了补料分批发酵验证。发酵持续约168小时，每12小时取样测定葡萄糖浓度、DCW、蓖麻油酸产量和脂质含量（图6a）。结果显示，蓖麻油酸产量达到6.0 g/L（占总脂肪酸的26.1%），单细胞油（SCO）产量为22.8 g/L，脂质含量为37.3%干重（DCW）。与摇瓶发酵相比，生物反应器中的DCW、蓖麻油酸产量和脂质含量均有显著提升（图6b）。
【数据】发酵时间：168h；取样间隔：12h；蓖麻油酸产量：6.0 g/L（占总脂肪酸26.1%）；SCO产量：22.8 g/L；脂质含量：37.3% DCW
讨论与解读
本研究通过系统级代谢工程将 Y. lipolytica 打造为高效的蓖麻油酸从头合成微生物平台。通过协调C18:1前体增强、磷脂酰胆碱介导的酰基编辑和甘油三酯组装，同时最小化竞争性降解和水解途径，工程菌株YY-20实现了高羟基脂肪酸产量和稳健的脂质积累。补料分批发酵进一步放大了生产能力，获得6.0 g/L蓖麻油酸和22.8 g/L SCO，脂质含量达干重的37.3%。这些结果证明，集成式脂质途径重构能有效将碳导向羟基脂肪酸，确立了 Y. lipolytica 作为可扩展、稳健的工业底盘，用于蓖麻油酸及其他高附加值脂质衍生物的生物合成。该工作凸显了理性代谢设计在克服前体限制、增强酰基通量和优化脂质储存方面的潜力，为产油酵母中非常规脂肪酸的未来工程改造提供了蓝图。
编译者解读：该研究的核心策略在于"多管齐下"的路径协同——并非单一基因改造，而是从前体供给、酰基编辑、TAG组装到竞争途径抑制的全链条重构。值得注意的是，研究者巧妙利用了植物来源的LPCAT和Lro1来模拟蓖麻中的酰基编辑机制，体现了合成生物学中跨物种策略移植的经典思路。6.0 g/L的产量在微生物合成羟基脂肪酸领域具有里程碑意义，但距离工业化仍有关键瓶颈——蓖麻油酸占总脂肪酸比例约26%，进一步提升需更精细的通量控制。此外，5-L规模到产业级放大的可行性、提取纯化成本等，原文未详述，是后续商业化需关注的方向。
参考来源
Yu Y. Single cell oil enriched in ricinoleic acid biosynthesis from glucose via metabolically rewired oleaginous yeast. Metabolic Engineering, 2026. DOI: 10.1016/j.ymben.2026.03.005
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.03.005