来源：Rewiring the methanol assimilation pathway in the methylotrophic yeast Pichia pastoris for high-level production of erythritol（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
甲醇作为非粮、丰富且可再生的碳源，是生物制造的理想替代原料。尽管甲基营养酵母已实现从甲醇合成C2、C3和C6平台化合物，但C4类化合物（如赤藓糖-4-磷酸衍生物）的生产仍是空白。本研究通过重连毕赤酵母的甲醇同化途径——裁剪和强化碳重排网络（CRN），并引入细菌核酮糖单磷酸（RuMP）途径与天然木酮糖单磷酸（XuMP）途径形成杂合网络，显著提升赤藓糖醇产量并减少戊糖醇副产物。最终工程菌株在发酵罐中赤藓糖醇产量达到31.5 g/L，验证了以甲醇为原料高效合成E4P基化学品的可行性。
研究背景
石油、煤炭和天然气等传统化石能源的枯竭及温室气体排放的上升，是21世纪人类社会面临的最严峻问题之一。一碳气体化合物（如一氧化碳、二氧化碳、甲烷）及其液体衍生物（如甲醇、甲酸）可作为绿色生物制造的替代原料，有助于实现碳中和与可持续发展。甲醇是最重要的大宗化学品之一，近年来CO₂加氢和CO₂电还原技术的进展使其成为可再生的生物制造原料。因此，微生物将甲醇转化为化学品已成为代谢工程和合成生物学研究的前沿。
建立高效的甲醇利用细胞工厂是有效转化甲醇的关键。常见策略是将甲醇利用途径引入模式微生物如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌和酿酒酵母中。然而，虽然工程化的甲基营养酵母已成功实现从甲醇生产克级产量的C2（乙酰-CoA）、C3（丙酮酸）和C6（果糖-6-磷酸）平台化合物，C4类化学品（即赤藓糖-4-磷酸衍生物）的生产仍未被探索。毕赤酵母拥有天然的XuMP途径固定甲醇，本研究旨在通过系统重连其碳重排网络，实现甲醇到赤藓糖醇的高水平转化。
研究方法
2.1 质粒、菌株与细胞培养
大肠杆菌DH5α用于质粒构建。本研究所用质粒列于表S1。毕赤酵母GS115作为赤藓糖醇生产的背景菌株。所有其他酵母菌株均源自GS115，详见表S2。工程策略和酵母菌株构建流程如图S2所示。
大肠杆菌DH5α在37°C的Luria-Bertani培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L NaCl）中培养。酵母在30°C的酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨和20 g/L葡萄糖）中培养。转化后，重组菌株在含有适当抗生素（200 mg/L G418、100 mg/L zeocin、200 mg/L潮霉素、200 mg/L诺尔丝菌素）的YPD平板上筛选。
【数据】大肠杆菌培养温度：37°C；LB培养基成分：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl；酵母培养温度：30°C；YPD培养基成分：10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖；抗生素浓度：200 mg/L G418、100 mg/L zeocin、200 mg/L潮霉素、200 mg/L诺尔丝菌素
2.2 基因操作
使用先前研究描述的Cre-LoxP方法敲除毕赤酵母GS115的Ku基因，生成PME00菌株（ΔKu）（Weninger et al., 2018）。将来自Candida magnoliae的ALR基因和来自大肠杆菌的YidA基因分别合成并克隆到pMPICKmHis质粒的BstBI和NotI位点之间，获得pMPICKmHis-ALR和pMPICKmHis-YidA质粒。通过SphI和BamHI双酶切pMPICKmHis-YidA获得YidA表达盒（5′AOX-YidA-3′AOX），然后插入pMPICKmHis-ALR的SphI和BglII位点，生成pMPICKmHis-AY质粒。该质粒经SalI线性化后转化ΔKu感受态细胞，生成重组菌株PME01（ΔKu-AY）。pMPICKmHis-2AY和pMPICKmHis-3AY质粒的构建方式与pMPICKmHis-AY类似。PME02（ΔKu-2AY）和PME03（ΔKu-3AY）菌株的构建方法与PME01相同。
为敲除PME01的TALa基因，首先从酵母基因组中扩增TALa基因的上下游同源臂，然后通过重叠延伸PCR将上游同源臂、下游同源臂和潮霉素抗性基因融合为完整片段。将该片段转化PME01菌株，通过同源重组敲除TALa基因，获得ΔKu-AY-ΔTALa（PME04）菌株。ΔKu-AY-ΔTALb（PME05）和ΔKu-AY-ΔSHB（PME06）菌株的构建方法与PME04类似。
为构建pMPICZ-AOX1质粒，合成AOX1基因并使用Gibson组装插入pMPICZ质粒的BstBI位点。pMPICZ-DAS1、pMPICZ-DAS2、pMPICZ-TPI、pMPICZ-FBAa、pMPICZ-FBAb、pMPICZ-TALa、pMPICZ-TALb、pMPICZ-RPI、pMPICZ-RPE1、pMPICZ-RPE2和pMPICZ-FBP质粒的构建方法类似。pMPICZ-AOX1质粒经PmeI线性化后整合到PME01菌株的AOX位点，生成重组菌株ΔKu-AY-AOX1（PME07）。按照相同方案，依次构建PME08至PME18菌株。
pMPICZ-mgHPSI、pMPICZ-mbuHPSI、pMPICZ-mcaHPSI和pMPICZ-bmmHPSI质粒的构建方法与pMPICZ-AOX1相同。这些质粒分别整合到PME02菌株的染色体中，获得PME19至PME22菌株。pMPICZHis-TPI-DAS1和pMPICZHis-TPI-bmmHPSI质粒的构建方法与pMPICKmHis-AY类似。PME23菌株通过敲除PME02的SHB基因构建。PME24至PME27菌株通过将以下质粒分别整合到PME23基因组中构建：pMPICZ-TPI、pMPICZHis-TPI-DAS1、pMPICZ-bmmHPSI和pMPICZHis-TPI-bmmHPSI。最后，PME30菌株通过将pMPICZ-RPE1质粒导入PME27菌株基因组构建。携带Ku基因的pMPICN-Ku质粒分别转化PME26、PME27和PME30菌株，获得PME28、PME29和PME31菌株。
【数据】限制性内切酶：BstBI、NotI、SphI、BamHI、BglII、SalI、PmeI；基因来源：ALR来自Candida magnoliae，YidA来自大肠杆菌；启动子：AOX1；抗性标记：潮霉素、G418、zeocin
2.3 qPCR实验
使用qPCR定量ΔKu-2AY和ΔKu-3AY中ALR和YidA的基因拷贝数。使用商业酵母基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN）从ΔKu-2AY和ΔKu-3AY菌株中提取基因组DNA。qPCR引物列于表S3。每个20 μL qPCR反应混合物包含：10 μL FastFire qPCR PreMix（TIANGEN）、正反向引物各0.6 μL、6.8 μL无RNA酶ddH₂O和2 μL基因组DNA模板。然后采用两步PCR反应，以GAPDH基因为内参基因。温度程序包括95°C预变性1分钟，随后40个循环的95°C变性5秒、60°C退火/延伸15秒。相对基因拷贝数使用2^−ΔΔCT方法计算（Livak and Schmittgen, 2001）。
【数据】qPCR体系：20 μL总体系（10 μL FastFire qPCR PreMix、引物各0.6 μL、6.8 μL ddH₂O、2 μL DNA模板）；温度程序：95°C预变性1min，40个循环（95°C 5s，60°C 15s）；定量方法：2^−ΔΔCT法
2.4 摇瓶培养
重组毕赤酵母菌株在YPD培养基中预培养48小时，离心收集后用25 mL基础盐培养基（BSM）重悬于250 mL摇瓶中。BSM培养基包含：9.1 g/L K₂SO₄、7.45 g/L MgSO₄·7H₂O、6.8 g/L KH₂PO₄、5.0 g/L (NH₄)₂SO₄、0.465 g/L CaSO₄和0.1% PTM1微量盐储备液（6 g/L CuSO₄·5H₂O、0.09 g/L KI、3 g/L MnSO₄·H₂O、0.02 g/L H₃BO₃、0.2 g/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.5 g/L CoCl₂、20 g/L ZnCl₂、65 g/L FeSO₄·7H₂O、0.2 g/L生物素和5.0 mL H₂SO₄），pH为6.0（Zhu et al., 2011）。最后，酵母菌株以初始OD₆₀₀为4，以甲醇为唯一碳源，在30°C、220 rpm条件下培养4天。发酵期间，每24小时添加500 μL甲醇，分两次添加：12小时添加300 μL，24小时添加200 μL。
低密度摇瓶培养是指在100 mL摇瓶中进行发酵，含40 mL BSM培养基并补充20 g/L甲醇。培养以初始OD₆₀₀为1启动，维持72小时。
【数据】BSM培养基成分：9.1 g/L K₂SO₄、7.45 g/L MgSO₄·7H₂O、6.8 g/L KH₂PO₄、5.0 g/L (NH₄)₂SO₄、0.465 g/L CaSO₄、0.1% PTM1；培养条件：30°C、220 rpm、4天、初始OD₆₀₀=4；甲醇添加：每24h 500 μL（300 μL+200 μL）；低密度培养：40 mL BSM+20 g/L甲醇、初始OD₆₀₀=1、72h
2.5 补料分批发酵
种子在250 mL摇瓶中的50 mL YPD培养基中培养48小时，然后转移到含有0.8 L BSM培养基（含20 g/L甘油和0.4% PTM1微量盐）的1 L生物反应器中。温度保持在30°C，通过添加NH₃·H₂O将pH控制在6左右。发酵过程中，一旦甘油耗尽且溶解氧水平回升，培养阶段切换到甲醇补料阶段。使用甲醇在线控制站（FC2002，华东理工大学，上海，中国）将甲醇浓度维持在约3 g/L。
【数据】种子培养：50 mL YPD、48h；发酵罐：1 L反应器、0.8 L BSM+20 g/L甘油+0.4% PTM1；温度：30°C；pH：6（NH₃·H₂O控制）；甲醇维持浓度：约3 g/L
2.6 分析方法
赤藓糖醇和戊糖醇的浓度通过高效液相色谱（HPLC）测定。取发酵液样品，在13,400×g离心1分钟，然后通过0.22 μm滤膜过滤。使用配备示差折光（RI）检测器的Agilent 1260 Infinity II HPLC系统分析上清液，使用Bio-Rad HPX-87H色谱柱或Waters Sugar-Pak I色谱柱。柱温设定为55°C（HPX-87H）和70°C（Sugar-Pak I）。流动相为8 mM H₂SO₄（流速：0.6 mL/min，HPX-87H柱）和超纯水（流速：0.4 mL/min，Sugar-Pak I柱）。
对于气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析，样品经硅烷化处理。100 μL样品用冷冻干燥机Alpha 1–2 LDplus（Christ，德国）干燥。干燥样品溶于50 μL吡啶和50 μL含1%三甲基氯硅烷（TMCS）的N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（BSTFA）中，在70°C孵育1小时。上清液转移至GC微量进样瓶进行GC-MS分析。衍生化样品立即用GCMS-QP2010 Ultra（Shimadzu，日本）分析，使用DB-5 ms色谱柱（30 m长、0.25 mm内径、0.25 μm膜厚，Agilent）。氦气载气流速为1 mL/min。接口和离子源温度分别设定为280°C和200°C。电子轰击电压设定为70 eV。m/z范围为50–500。柱温初始设定为80°C，保持3分钟，然后以10°C/min的速率升至250°C。
【数据】HPLC离心：13,400×g、1min；滤膜：0.22 μm；柱温：55°C（HPX-87H）、70°C（Sugar-Pak I）；流动相：8 mM H₂SO₄（0.6 mL/min）或超纯水（0.4 mL/min）；GC-MS硅烷化：100 μL样品、50 μL吡啶、50 μL BSTFA（含1% TMCS）、70°C孵育1h；载气流速：1 mL/min；离子源温度：200°C；电压：70 eV；m/z范围：50–500
研究结果
3.1 基于动力学建模的菌株原型构建与瓶颈分析
许多天然赤藓糖醇生产者如解脂耶氏酵母能够分解代谢赤藓糖醇（Carly et al., 2017）。然而，在搜索解脂耶氏酵母赤藓糖醇分解代谢途径基因的同源物后，未在毕赤酵母中鉴定到完整的赤藓糖醇分解代谢途径（表S4）。为研究毕赤酵母是否能分解代谢赤藓糖醇，用甲醇和不同浓度的赤藓糖醇培养ΔKu（PME00）菌株。结果表明，添加赤藓糖醇不影响PME00菌株的正常生长（图S3），且整个发酵过程中赤藓糖醇浓度未发生变化（图S4）。因此得出结论：毕赤酵母至少在甲醇生长阶段不能分解代谢赤藓糖醇。
接下来，将赤藓糖醇合成途径引入毕赤酵母PME00菌株（图1A）。酵母中赤藓糖醇可由赤藓糖-4-磷酸（E4P）——磷酸戊糖途径的代谢中间体——经E4P磷酸酶和赤藓糖还原酶介导的去磷酸化和还原反应合成（Khatape et al., 2022）。因此，来自大肠杆菌的YidA基因（编码E4P磷酸酶）和来自Candida magnoliae的ALR基因（编码赤藓糖还原酶）分别置于强诱导型醇氧化酶1（AOX1）启动子控制下，并按照BioBricks标准组装（图1B）。将含有YidA和ALR表达盒的载体整合到PME00基因组中，生成ΔKu-AY（PME01）菌株。该重组菌株在以甲醇为唯一碳源的BSM培养基摇瓶培养中可产生1.2 g/L赤藓糖醇（图1C），证明利用毕赤酵母作为细胞底盘成功实现了从甲醇合成赤藓糖醇。
毕赤酵母中赤藓糖醇的高效合成可能受几个关键参数影响，包括前体E4P的可利用性、YidA和ALR的表达水平以及胞内NADH水平。为定量确定这些参数中哪一个是瓶颈，构建了动力学模型来评估它们对赤藓糖醇通量的影响（表S5）。模型的敏感性分析显示，ALR、YidA和E4P水平的敏感性值最高，而NADH水平的敏感性值非常低（图1D）。还模拟了E4P、YidA、ALR和NADH水平变化（±50%）对赤藓糖醇通量的影响（图S5），证实赤藓糖醇合成主要受ALR、YidA和E4P前体水平影响，而NADH水平影响很小。基于动力学模型的分析因此提出：赤藓糖醇合成可通过提高YidA和ALR的表达水平以及增加甲醇来源的E4P供应来改善。
【数据】PME01菌株赤藓糖醇产量：1.2 g/L（BSM培养基、甲醇唯一碳源、摇瓶）；敏感性分析：ALR、YidA、E4P敏感性最高，NADH极低；模拟变化范围：±50%
3.2 提高E4P到赤藓糖醇的转化
为优化E4P到赤藓糖醇的转化率，目标是提高YidA和ALR的表达水平。为此，构建了含有2个和3个串联重复YidA-ALR表达盒的重组载体并导入PME00菌株。通过qPCR确认这些构建体的整合（图S6、表S6），鉴定出正确整合2个和3个拷贝YidA和ALR基因的菌株，分别命名为ΔKu-2AY（PME02）和ΔKu-3AY（PME03）（图1B）。然后以PME01为对照菌株，评估这两个菌株在摇瓶培养中的赤藓糖醇产量。
PME02的赤藓糖醇产量显著增加，比对照提高35%。相比之下，PME03仅显示出17%的适度增加（图1E）。值得注意的是，PME02和PME03菌株的细胞生长均比PME01显著降低，其中PME03受影响尤为严重（图1F）。这强调了YidA和ALR过表达对酵母细胞生理的潜在不利影响。
在此前的敏感性评估中，假设E4P浓度恒定——这一假设在考虑毕赤酵母整体代谢时可能不成立。事实上，如PME02和PME03中观察到的，随着E4P向赤藓糖醇的转化增加，E4P池大小将显著减少，除非E4P供应相应增加。动力学模型进一步表明，随着E4P浓度降低，其可利用性对赤藓糖醇合成变得更加限速（图S7）。此外，E4P的耗竭可能导致CRN中其他重要中间体如F6P、甘油醛-3-磷酸（G3P）和Xu5P的流失，这些对C1同化至关重要。这一假说为PME02和PME03菌株生长显著降低提供了合理的解释。因此，要进一步提高赤藓糖醇产量，需要随着PME02和PME03中YidA和ALR的过表达同步增加甲醇来源的E4P供应。
【数据】PME02赤藓糖醇产量提升：比对照增加35%；PME03赤藓糖醇产量提升：比对照增加17%；拷贝数：PME02为2拷贝、PME03为3拷贝
3.3 通过CRN重连工程E4P可利用性：网络裁剪——破坏导致E4P降解的多余途径
在毕赤酵母复杂的XuMP网络中，有两条分支负责将E4P转化为景天庚酮糖-7-磷酸（S7P），S7P随后转化为Xu5P，从而完成Xu5P的再生以进行下一轮C1同化（图2A）（Fukuoka et al., 2019）：（1）在途径A中，E4P与F6P一起可被转醛醇酶转化为S7P和G3P。（2）在途径B中，E4P和磷酸二羟丙酮（DHAP）可被果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（FBA）催化生成景天庚酮糖-1,7-二磷酸（SBP），然后SBP被景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶（SHB）去磷酸化为S7P。重要的是，途径B是不可逆过程，其中SBP的去磷酸化为E4P向S7P的转化提供了强大的驱动力，即使在E4P浓度较低时也是如此。虽然这两条途径的共存确保了Xu5P的充足供应以满足生理需求，但也导致了E4P的大量损失。因此，通过破坏其中一条途径来消除这种冗余，可能有助于保留E4P用于赤藓糖醇合成。
毕赤酵母拥有两个转醛醇酶旁系同源物TALa和TALb，据报道分别定位于毕赤酵母的胞质和过氧化物酶体（Ruβmayer et al., 2015）。因此在PME01中分别破坏编码TALa和TALb的基因。由于FBA除介导E4P和DHAP生成SBP外，还负责催化G3P和DHAP生成果糖-1,6-二磷酸（FBP），因此选择SHB作为途径B破坏的靶基因。通过同源重组在PME01菌株中分别敲除TALa、TALb和SHB，生成ΔKu-AY-ΔTALa（PME04）、ΔKu-AY-ΔTALb（PME05）和ΔKu-AY-ΔSHB（PME06）菌株。
摇瓶培养显示，TALa的破坏使赤藓糖醇产量降低11%，而TALb敲除对赤藓糖醇合成的影响微乎其微（即使有也可忽略）。相比之下，SHB的破坏与PME01菌株相比赤藓糖醇产量显著增加，摇瓶中观察到15%的增加（图2B）。因此，破坏不可逆的途径B可有效增加E4P池大小，从而增强赤藓糖醇合成。
【数据】TALa敲除：赤藓糖醇产量降低11%；SHB敲除：赤藓糖醇产量增加15%；TALb敲除：影响可忽略
3.4 通过CRN重连工程E4P供应：网络强化——系统过表达途径酶
此前，为增强天然和合成甲基营养菌的甲醇同化和化学品生产，研究者们聚焦于过表达C1同化途径的关键酶（Bennett et al., 2018; Cai et al., 2022）。然而，由于这些途径的复杂性，确定合适的过表达靶点仍然是一项具有挑战性的任务。对于已经拥有高效C1同化网络的天然甲基营养菌尤其如此。迄今为止……
【数据】原文未详述本节具体过表达结果数据
3.5 异源RuMP途径的引入与杂合网络构建
（此节原文在节选中被截断，基于上下文推断内容涉及HPLC分析鉴定戊糖醇副产物、杂合XuMP-RuMP底盘构建等）
【数据】原文未详述本节具体数据
3.6 整合性CRN重连
（此节原文在节选中被截断，涉及摇瓶培养中工程菌株的赤藓糖醇和核糖醇产量测定、赤藓糖醇占总糖醇比例等）
【数据】原文未详述本节具体数据
3.7 RPE1过表达增强Xu5P向F6P转化以减少阿拉伯糖醇形成
（此节原文在节选中被截断，涉及发酵罐培养中通过RuMP途径增强Xu5P向F6P转化的示意及赤藓糖醇和阿拉伯糖醇产量数据）
【数据】原文未详述本节具体数据
讨论与解读
近年来，毕赤酵母等甲基营养酵母除了作为成功的蛋白质表达系统外，已被重新发现为强大的化学品生产细胞工厂。已有显著成就使化学品产量超过克/升，有些甚至达到20–50 g/L（Guo et al., 2023）。然而，大多数中等到高水平的化学品生产集中在C2、C3或C6平台化合物。例如，脂肪酸产量达23.4 g/L（Cai et al., 2022），3-羟基丙酸达48.2 g/L（Wu et al., 2023），均利用源自乙酰-CoA的C2平台。乳酸（3.8 g/L）（Yamada et al., 2019）、β-丙氨酸（5.6 g/L）（Miao et al., 2021）和苹果酸（13.2 g/L）（Guo et al., 2020）等化学品源自丙酮酸的C3平台，而葡萄糖（13.41 g/L）（Tang et al., 2024）和硫酸软骨素（2.1 g/L）（Jin et al., 2021）则由C6平台即果糖-6-磷酸（F6P）生产。值得注意的是，C2、C3和C6平台可以从磷酸二羟丙酮（DHAP）线性和高效地合成——DHAP是天然XuMP途径的固定输出产物。例如，丙酮酸可通过糖酵解途径下半部分从DHAP高效转化，乙酰-CoA直接源自丙酮酸，果糖-6-磷酸也可以容易地转化……（原文截断）
本研究通过系统重连毕赤酵母的碳重排网络，首次实现了从甲醇到C4类化学品赤藓糖醇的高水平生产。动力学模型引导的瓶颈分析、网络裁剪与强化策略、异源RuMP途径的引入，构成了一个完整的方法论体系。
编译者解读
本研究最值得借鉴之处在于将动力学模型引入菌株构建的决策前端——先用敏感性分析定位瓶颈，再有针对性地设计基因操作，避免盲目过表达带来的代谢负担。引入细菌RuMP途径与天然XuMP途径形成杂合网络，跳出了"仅优化内源途径"的思维定式，为其他甲基营养菌的C4化合物生产提供了可迁移的策略。31.5 g/L的发酵罐产量也验证了该策略的工业潜力。值得思考的是，菌株生长与产物合成之间的权衡——多拷贝过表达虽提高了产量却显著抑制生长，如何在生产强度与生物量之间找到最优平衡点，或许需要动态调控等更精细的代谢控制手段介入。
参考来源
Wang, S. (2025). Rewiring the methanol assimilation pathway in the methylotrophic yeast Pichia pastoris for high-level production of erythritol. Bioresource Technology. DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132430
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132430