来源：HPLC-MS/MS-based detection of Pseudomonas aeruginosa secondary metabolites and their application in metabolomics（Journal of Chromatography A）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
铜绿假单胞菌是一种广泛分布的条件致病菌，其代谢产物检测对微生物鉴定与化妆品安全风险评估具有重要意义。本研究建立了一种基于高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）的方法，可同时测定铜绿假单胞菌的17种次生代谢物。方法学验证显示线性相关系数均大于0.99，回收率85.1%–114.7%，检出限达0.05 mg/kg。研究进一步将该方法应用于三种假单胞菌的代谢差异分析及化妆品实际样品检测，发现绿脓菌素等四种物质可作为铜绿假单胞菌的特征性代谢标志物。
研究背景
铜绿假单胞菌是一种革兰氏阴性菌，广泛分布于自然界。作为常见的条件致病菌，其在一定条件下可引起人和动物感染。免疫力低下人群更易罹患急性肠炎、脑膜炎、败血症及皮肤炎症等疾病。目前铜绿假单胞菌已成为国内外研究热点，主要集中于临床医学、基础医学、生物学和药学等领域。近年来，铜绿假单胞菌污染相关问题频发，尤其是包装饮用水污染问题突出，化妆品中铜绿假单胞菌阳性检出也屡有报道。
当前铜绿假单胞菌的主要检测手段为微生物培养法，涉及细菌增菌、分离、纯化和生化鉴定等多个步骤，耗时长且可能导致漏检，一直是病原检测领域的难点和痛点。与其他细菌和真菌一样，铜绿假单胞菌可吸收多种外源营养物质进行代谢，产生次生代谢产物。这些代谢物按功能可分为抗生素、激素、生物碱、毒素和维生素等，不仅具有生物活性，还在微生物鉴定中发挥重要作用。基于此，开发一种快速、灵敏的次生代谢物检测方法，对于铜绿假单胞菌的代谢研究和化妆品中残留风险评估具有重要价值。
研究方法
2.1 仪器与试剂
液相色谱串联三重四极杆串联质谱仪（Triple Quad 5500+），美国AB SCIEX公司；漩涡振荡器（SK-1），江苏金坛医疗仪器厂；超纯水仪（Milli-Q），德国Merck Millipore公司；高速离心机（DE-16R），长沙东旺实验仪器有限公司；超声波清洗器（FRQ-1020S），杭州法拉特超声波科技有限公司；生化培养箱（SPX-250F-II），上海龙跃仪器设备有限公司。
标准品信息：绿脓菌素（PYO，95%，CAS 85-66-5）、4-羟基喹啉（99.4%，CAS 611-36-9）、2-甲基-8-羟基喹啉（99.4%，CAS 826-81-3）、2-羟基喹喔啉（98.6%，CAS 1196-57-2）购自上海碧得医药科技有限公司；2,6-二羟基喹啉（99%，CAS 19315-93-6）、6,7-二甲氧基-4-羟基喹啉（97%，CAS 13425-93-9）、6-溴-4-羟基喹啉（97%，CAS 145369-94-4）、2-庚基-4-羟基喹啉-N-氧化物（HQNO，97%，CAS 341-88-8）、2,8-喹啉二醇（97%，CAS 15450-76-7）购自源叶生物科技有限公司；2-氨基-4-羟基喹啉水合物（98%，CAS 42712-64-1）、1-羟基吩嗪（95%，CAS 528-71-2）、吩嗪-1-甲酰胺（PCN，95%，CAS 550-89-0）购自上海泰坦科技有限公司；2-庚基-3-羟基-4(1H)-喹啉酮（PQS，98%，CAS 108985-27-9）、2,3-二羟基喹喔啉（98%，CAS 15804-19-0）、藤黄绿菌素（95%，CAS 25683-07-2）购自TargetMol公司；2-庚基-4-喹啉酮（HHQ，98%，CAS 40522-46-1）购自SIGMA公司；吩嗪-1-羧酸（PCA，98%，CAS 2538-68-3）购自BePure公司。
色谱级乙腈、甲醇、甲酸及分析级氯化钠购自上海安谱实验科技股份有限公司。ProElut C18（200 mg/3 mL）、ProElut PLS（500 mg/6 mL）、QuEChERS（50 mg PSA，150 mg MgSO₄）及QuEChERS（100 mg PSA，40 mg C18，600 mg MgSO₄）购自迪马科技有限公司。
铜绿假单胞菌（ATCC 27853）和荧光假单胞菌（ATCC 13525）来源于美国培养物保藏中心；恶臭假单胞菌（CICC 10298）来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心。脑心浸液肉汤（BHI broth，220107）、十六烷基三甲基溴化铵培养基（Cetrimide Agar，210908）和绿脓菌素测定培养基（Pseudomonas Agar，211124）购自北京陆桥科技有限公司。
本研究共分析130批化妆品，涵盖面霜、牙膏、精华液、面膜、湿巾、乳液、爽肤水、染发剂、沐浴产品、洗发水、防晒产品、舒缓产品、护发素和洗面奶。样品选择依据《化妆品分类规则和分类目录》（国家药监局2021年第49号公告）执行，所有样品购自超市。具体样品信息见附录A。
【数据】菌株：铜绿假单胞菌ATCC 27853、荧光假单胞菌ATCC 13525、恶臭假单胞菌CICC 10298；标准品纯度：95%–99.4%；化妆品样品：130批，14类；SPE柱：C18（200 mg/3 mL）、PLS（500 mg/6 mL）
2.2 实验方法
#### 2.2.1 样品前处理
称取0.2 g样品于10 mL刻度离心管中，加入0.5 mL饱和氯化钠溶液混匀。随后加入8 mL乙腈进行提取。超声提取10 min后，定容至10 mL。提取液在8000 r/min条件下离心5 min。然后取上述提取液经活化的C18固相萃取柱直接过滤净化。净化液过0.22 μm PTFE有机滤膜后进行LC-MS/MS分析。培养基测定前加热至液态并混匀。待测溶液应适当稀释，确保被测物在标准曲线浓度范围内。
【数据】样品量：0.2 g；饱和NaCl：0.5 mL；乙腈：8 mL；超声提取：10 min；离心：8000 r/min，5 min；滤膜：0.22 μm PTFE
#### 2.2.2 色谱条件
色谱分离采用Agilent SB-C18 RRHD色谱柱（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm），柱温40 °C。流速设为0.4 mL/min。进样量为2 μL。流动相由0.1%甲酸溶液（v/v，溶剂A）和甲醇（溶剂B）组成。梯度洗脱程序如下：0–3.0 min，60%–80% B；3.0–9.0 min，80% B；9.1–12.0 min，60% B。
【数据】色谱柱：Agilent SB-C18 RRHD（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）；柱温：40°C；流速：0.4 mL/min；进样量：2 μL；流动相：0.1%甲酸-甲醇；梯度：0–3.0 min 60%–80% B，3.0–9.0 min 80% B，9.1–12.0 min 60% B
#### 2.2.3 质谱条件
质谱分析分别采用正电喷雾电离模式（ESI+）和负电喷雾电离模式（ESI-）。具体参数设置如下：离子喷雾电压，5500 V（ESI+）、−4500 V（ESI-）；雾化温度，500 °C；雾化气，50 psi；辅助气，50 psi；气帘气，20 psi；碰撞气，9 psi；监测模式：多反应监测（MRM）。待测物的定量离子对、定性离子对、去簇电压（DP）和碰撞能量（CE）见表1。
【数据】ESI+电压：5500 V；ESI-电压：−4500 V；雾化温度：500°C；雾化气：50 psi；辅助气：50 psi；气帘气：20 psi；碰撞气：9 psi；监测模式：MRM
#### 2.2.4 标准溶液配制
分别称取一定量的10 mg标准品，转移至10 mL容量瓶中。其中，2,6-二羟基喹啉、2,8-喹啉二醇、2,3-二羟基喹喔啉和2-羟基喹喔啉先加入0.5 mL DMSO溶解，再用甲醇定容至10 mL。其余标准品直接用甲醇溶解并定容至10 mL。配制的标准储备液浓度为1.0 g/L，于−20 °C保存。移取100 μL单一标准储备液配制浓度为10 mg/L的混合标准中间液。使用前用空白基质溶液配制1.0 mg/L混合标准溶液，再稀释成浓度为1、2、5、10、20、50、100 μg/L的一系列基质标准工作曲线。
【数据】标准储备液：1.0 g/L，−20°C保存；混合中间液：10 mg/L；基质标准曲线系列：1、2、5、10、20、50、100 μg/L；DMSO用量：0.5 mL
#### 2.2.5 基质效应
采用空白培养基、乳液和精华水测定方法的基质效应。计算方法为基质标准曲线斜率（k1）除以溶剂标准曲线斜率（k2）。
【数据】基质效应评价：k1/k2法；基质类型：空白培养基、乳液、精华水
#### 2.2.6 方法学分析
选取空白培养基、乳液和精华水基质样品进行精密度试验和标准回收试验。向基质样品中加入不同水平的标准溶液，重复6次。以响应最低的物质为参考指标稀释待测溶液。信噪比（SNR）3倍对应的浓度设为检出限（LOD），信噪比10倍对应的浓度设为定量限（LOQ）。
【数据】重复次数：6次；LOD：3倍SNR；LOQ：10倍SNR
#### 2.2.7 代谢分析
选取同属的铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌作为研究对象，考察代谢及其特异性。上述三株菌在不同培养基和温度条件下培养。检测培养基中17种代谢物的含量，同时进行空白对照实验。
【数据】菌株：3种假单胞菌；代谢物：17种；培养条件：不同培养基×不同温度；空白对照：同步进行
#### 2.2.8 实际化妆品样品分析
化妆品所用原料富含氮源、碳源和无机盐等营养物质，有利于铜绿假单胞菌的繁殖和代谢。本研究假设化妆品中可能存在铜绿假单胞菌代谢残留或原料污染，采用所建方法检测化妆品中铜绿假单胞菌代谢物残留。
【数据】样品类型：化妆品；检测目标：铜绿假单胞菌代谢物残留
#### 2.2.9 化妆品模拟样品分析
为深入探究化妆品对铜绿假单胞菌繁殖和代谢的影响，进行了阳性模拟样品分析。称取10份相同质量的不同化妆品样品于50 mL比色管中，向这些样品中引入0.5 mL铜绿假单胞菌生长培养基。充分混合后置于室温条件下（原文此处截断，后续条件未详述）。
【数据】化妆品样品：10种等质量；接种量：0.5 mL铜绿假单胞菌培养液；容器：50 mL比色管
研究结果
3.1 代谢物筛选
绿脓菌素是一种具有特殊颜色和氧化还原能力的吩嗪类化合物，由铜绿假单胞菌代谢产生。它是铜绿假单胞菌的重要毒力因子，其氧化还原能力可破坏宿主细胞的氧化还原平衡，影响生物大分子功能，甚至导致细胞死亡。铜绿假单胞菌可释放三种信号物质：2-庚基-3-羟基-4(1H)-喹啉酮（PQS）、4-庚基-4(1H)-喹啉酮（HHQ）和2-庚基-4-喹啉酮-N-氧化物（HQNO）。铜绿假单胞菌LV株可产生具有生物活性的代谢物吩嗪-1-羧酸（PCA）和吩嗪-1-甲酰胺（PCN）。根际细菌铜绿假单胞菌M18可产生广谱次生代谢物，包括抗生素藤黄绿菌素和吩嗪-1-羧酸（PCA）。铜绿假单胞菌产生胞外代谢物4-羟基喹啉。Simoska Olja等实现了铜绿假单胞菌代谢物1-羟基吩嗪的实时电化学检测。通过上述研究，获得了铜绿假单胞菌9种代谢物的信息。考虑到质谱方法可实现高通量筛选，本研究另选取了8种具有相似喹啉结构的物质作为研究对象。
【数据】文献来源代谢物：9种（PYO、PQS、HHQ、HQNO、PCA、PCN、藤黄绿菌素、4-羟基喹啉、1-羟基吩嗪）；本研究增加：8种喹啉结构类似物；总计：17种
3.2 仪器条件优化
#### 3.2.1 质谱条件
以3 μL/min流速连续注入浓度为1.0 mg/L的混合标准溶液。对母离子、子离子、去簇电压（DP）和碰撞能量（CE）等质谱参数进行扫描和优化（见表1）。绿脓菌素、4-羟基喹啉、2-甲基-8-羟基喹啉、6,7-二甲氧基-4-羟基喹啉、2-氨基-4-羟基喹啉水合物、1-羟基吩嗪、吩嗪-1-羧酸（PCA）和吩嗪-1-甲酰胺（PCN）在正离子模式下具有显著优势。藤黄绿菌素在负离子模式下的响应优于正离子模式。其他物质的正负离子模式差异不大。因此，本方法采用正负离子模式同时采集。
【数据】流速：3 μL/min；标准溶液：1.0 mg/L；正离子优势物质：8种；负离子优势物质：1种（藤黄绿菌素）
#### 3.2.2 色谱条件
本研究比较了五种不同流动相体系：0.1%甲酸-乙腈、0.1%甲酸-甲醇、水-乙腈、水-甲醇和5 mmol/L甲酸铵溶液-甲醇。大多数物质在甲醇体系中的峰形和响应优于乙腈体系。5 mmol/L甲酸铵溶液的响应与水作为流动相相当。在流动相水中加入0.1%甲酸可改善绿脓菌素和2-甲基-8-羟基喹啉的峰形。由于藤黄绿菌素灵敏度高，即使在0.1%甲酸条件下，负离子模式仍呈现良好响应。综上，本实验选择0.1%甲酸-甲醇作为流动相体系。混合标准溶液中17种物质的总离子流图（TIC）和多反应监测色谱图（MRM）如图1所示。
【数据】流动相体系比较：5种；最优体系：0.1%甲酸-甲醇；峰形改善物质：绿脓菌素、2-甲基-8-羟基喹啉
3.3 前处理条件优化
#### 3.3.1 提取方法
分别使用甲醇和乙腈作为提取溶剂对样品进行直接提取。但部分化妆品样品易快速结块，不利于提取和获得高回收率。加入饱和氯化钠溶液可使样品良好分散，随后加入有机试剂提取，可大幅提高提取效率。乙腈在提取和回收方面优于甲醇。因此，选择饱和氯化钠溶液分散-乙腈提取作为样品处理方法。
【数据】提取溶剂比较：甲醇vs乙腈；分散剂：饱和NaCl溶液；优选方案：饱和NaCl分散+乙腈提取
#### 3.3.2 净化方法
化妆品样品和培养基的组成复杂。若提取液净化不充分，容易导致柱效和质谱响应下降。此外，提取液在低温下易析出杂质，不利于实验分析。因此，比较了四种净化方法的效果，分别为C18（200 mg/3 mL）、PLS（500 mg/6 mL）、QuEChERS（50 mg PSA，150 mg MgSO₄）和QuEChERS（100 mg PSA，40 mg C18，600 mg MgSO₄）。C18和PLS固相萃取柱均能改善净化液的盐析现象。但与其他三种净化方法相比，C18（200 mg/3 mL）固相萃取柱的回收率更优，且可与PTFE滤膜组装使用，操作更便捷。因此，本实验选择C18（200 mg/3 mL）作为样品提取液的净化方法。
【数据】净化方法比较：4种（C18、PLS、2种QuEChERS）；优选：C18（200 mg/3 mL）
#### 3.3.3 滤膜和温度的影响
比较了标准溶液（100 μg/L）过滤前后的响应。尼龙滤膜对大部分目标物质有较强吸附作用，损失达10%–40%。PTFE滤膜对所有物质均无明显吸附。因此，本方法选用PTFE滤膜过滤样品溶液后再进行HPLC-MS/MS测定。为评价目标物质的热稳定性，将混合标准溶液（100 μg/L）分别在50 °C和100 °C水浴中加热30 min。结果显示，17种物质响应变化很小，表现出良好的热稳定性。
【数据】标准溶液：100 μg/L；尼龙膜吸附损失：10%–40%；水浴温度：50°C、100°C；加热时间：30 min；热稳定性：17种物质响应变化小
3.4 方法学分析
#### 3.4.1 基质效应
选取培养基、乳液和精华水三种典型样品类型作为空白基质样品。通过比较空白基质标准曲线与溶剂标准曲线的斜率来评价基质效应。大部分物质存在基质抑制效应，结果见表2。
【数据】基质类型：培养基、乳液、精华水；评价方法：斜率比较法；效应类型：大部分为基质抑制
#### 3.4.2 线性范围和检出限
按2.2.1方法制备三种空白基质溶液，稀释成浓度为1、2、5、10、20、50、100 μg/L的基质标准溶液，经HPLC-MS/MS测定。采用基质标准曲线进行外标定量。通过浓度对峰面积进行线性拟合，17种待测物均呈现良好线性关系（见表2），相关系数均大于0.99。最低响应物质（2-羟基喹喔啉）3倍信噪比对应的LOD为0.05 mg/kg，10倍信噪比对应的LOQ为0.10 mg/kg。
【数据】线性范围：1–100 μg/L；相关系数r：均>0.99；LOD：0.05 mg/kg；LOQ：0.10 mg/kg；最低响应物质：2-羟基喹喔啉
#### 3.4.3 回收率和精密度
在空白培养基、乳液和精华水样品上进行三个水平的回收率和精密度实验，分别为1倍定量限（LOQ）、2倍定量限（2×LOQ）和10倍定量限（10×LOQ）。样品按2.2实验方法处理和测定，测试结果见表3。培养基的回收率为85.1%–114.7%，RSD为1.3%–9.8%；乳液的回收率为85.3%–112.9%，RSD为1.7%–13.3%；精华水的回收率为86.2%–112.3%，RSD为1.9%–9.6%。回收率和精密度满足CFDA [2010]455号和SANTE/11813/2017 G7标准要求。
【数据】培养基回收率：85.1%–114.7%，RSD：1.3%–9.8%；乳液回收率：85.3%–112.9%，RSD：1.7%–13.3%；精华水回收率：86.2%–112.3%，RSD：1.9%–9.6%；加标水平：LOQ、2×LOQ、10×LOQ
3.5 铜绿假单胞菌代谢分析
将所建检测方法应用于铜绿假单胞菌的代谢分析。该研究重点探索代谢的影响因素并发现特异性代谢物质。第一步，对铜绿假单胞菌进行培养（原文此处截断，后续结果未完整呈现）。
【数据】分析方法：HPLC-MS/MS；应用对象：铜绿假单胞菌代谢分析；研究重点：代谢影响因素、特异性代谢物
讨论与解读
本研究成功建立了基于HPLC-MS/MS的铜绿假单胞菌17种次生代谢物同步检测方法。方法学验证表明，在1–100 μg/L线性范围内，相关系数均大于0.99，回收率为85.1%–114.7%，RSD为1.3%–13.3%，LOD和LOQ分别为0.05 mg/kg和0.10 mg/kg。该方法灵敏度高、特异性强、选择性好、准确度高且操作便捷。
研究将所建方法应用于三种假单胞菌的代谢分析，推测绿脓菌素、2-庚基-4-喹啉酮（HHQ）、吩嗪-1-羧酸（PCA）和1-羟基吩嗪具有作为铜绿假单胞菌特征性生物标志物的潜力。模拟阳性样品在自然状态下追踪评估了代谢残留风险，实际样品测定结果表明化妆品中铜绿假单胞菌代谢残留风险较低，模拟样品分析提示化妆品可抑制铜绿假单胞菌的代谢。
编译者解读
该研究将分析化学方法学与微生物代谢组学有机结合——C18-SPE净化和PTFE膜过滤解决了化妆品复杂基质干扰，而饱和氯化钠分散策略巧妙处理了样品结块问题。17种代谢物的靶向筛查策略体现了从已知文献到结构类似物扩展的务实思路。值得关注的是，该方法为合成生物学中铜绿假单胞菌菌株的代谢产物高通量筛选提供了可靠分析工具，未来或可延伸至其他机会致病菌的代谢标志物挖掘。局限在于实际化妆品样品阳性率低，模拟实验条件与真实污染场景仍有差距。
参考来源
Ran D. HPLC-MS/MS-based detection of Pseudomonas aeruginosa secondary metabolites and their application in metabolomics. Journal of Chromatography A, 2025. DOI: 10.1016/j.chroma.2025.466303
DOI: 10.1016/j.chroma.2025.466303