来源：Whole-cell biosensor engineering based on the transcription factor XylS/Pm for sensitive detection of PCB intermediate chlorobenzoic acid（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
氯代苯甲酸（Cba）是工业化学废弃物及多氯联苯（PCBs）降解途径中常见的有毒氯化污染物。本研究通过对恶臭假单胞菌来源的Cba感应遗传回路各元件进行系统改造，成功构建了高灵敏大肠杆菌全细胞Cba生物传感器XyF10，检测限从野生型的50 μM降至<1 μM，信噪比从4.4倍提升至11.7倍。分子动力学模拟揭示XylS突变体Step13中环状结构灵活性的增加促进了活性二聚体形成及与诱导物的稳定结合，为PCB降解途径的高通量筛选提供了新工具。
研究背景
PCBs是毒性强、在环境中持久存在的有机污染物，广泛分布于生态系统中。沉积在土壤中的PCBs难以降解，可向水体迁移，对人类健康构成严重威胁。化学降解法处理PCBs过程复杂且困难，而生物转化降解具有低成本、高效率的优势。PCBs通过一系列酶的作用转化为氯代芳烃（CA）中间产物，再经其他代谢途径进一步降解。早在1998年，Beyersdorf等人就鉴定了多种能够降解PCBs并产生氯酚前体和苯甲酸的菌株。因此，CA的检测可用于指示PCB降解程度，并为工程化PCB降解途径提供传感支持。
然而，采用高效液相色谱-串联质谱法检测CA耗时且昂贵。传感器因其经济可行性、高灵敏度、自动化能力和适应性，被广泛应用于医疗保健、环境监测和环境污染物检测等领域。因此，利用微生物细胞构建生物传感器来检测CA具有重要的应用前景。
研究方法
4.1 菌株、酶与分子试剂
大肠杆菌BL21(DE3)、JM109(DE3)、DH5α和TOP10感受态细胞购自北京擎科生物科技有限公司。MG1655(DE3)感受态细胞为本实验室保存。用于构建载体的高保真PCR酶（RapidLyse Plasmid Mini Kit）购自南京诺唯赞生物科技有限公司。PCR产物纯化与质粒提取试剂盒（RapidLyse Plasmid Mini Kit）同样购自诺唯赞。氯代苯甲酸、苯甲酸及其同系物购自上海源叶生物科技有限公司。
【数据】菌株：BL21(DE3)、JM109(DE3)、DH5α、TOP10（擎科生物）、MG1655(DE3)（实验室保存）；试剂来源：诺唯赞（南京）、源叶生物（上海）
4.2 质粒构建
来自假单胞菌TOL质粒的Ps-XylS-Pm基因序列经合成后，由擎科公司（北京）直接插入通用载体pUC57中。随后，采用T5核酸外切酶介导的分子克隆方法，将EGFP基因序列插入pUC57-Ps-XylS-Pm质粒中Pm启动子的下游。为在EGFP的3′端连接SsrA降解标签，设计了一对含有ssrA基因序列的引物，用于pUC57-Ps-XylS-Pm-EGFP质粒的反向扩增。经过20轮PCR扩增后，使用DNA纯化试剂盒纯化线性化片段，再用DpnI酶消化去除质粒模板。所得样品直接转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行重组克隆。对于Ps启动子的替换，采用相同方法，但使用含有Ps启动子序列的引物。此外，一系列XylS和Pm突变质粒均采用单点反向PCR方法构建。用于质粒构建的所有引物序列见表S4。
【数据】PCR扩增：20轮；模板去除酶：DpnI；宿主菌：DH5α；方法：T5核酸外切酶介导克隆、单点反向PCR
4.3 大肠杆菌全细胞传感器的培养与检测条件
将传感质粒转化至不同大肠杆菌菌株，并在选择性琼脂平板上培养。挑取生长旺盛的单菌落，接种于含50 μg/ml卡那霉素（Kan）的2 ml LB培养基中。随后，将过夜种子培养物按1:100比例转接至1 ml新鲜培养基中，培养至600 nm光密度（OD600）达到0.4–0.8范围。然后，取198 μL菌悬液转移至96孔板中。为诱导传感系统，计算并加入适当的诱导物浓度（每孔2 μL），随后在37°C下孵育6.5小时。之后，将板置于分光光度计中，分别测量OD600以及在激发波长488 nm、发射波长507 nm下的荧光值。荧光密度除以OD600计算各样本的归一化值。
【数据】培养基：LB；抗生素：50 μg/ml卡那霉素；接种比：1:100；OD600：0.4–0.8；诱导体积：2 μL/孔；温度：37°C；时间：6.5h；激发波长：488nm；发射波长：507nm
4.4 结构模拟与分子对接
使用Google Colab上的Alphafold2开源在线预测网站预测野生型XylS的结构。随后，以预测的野生型XylS结构为模板，在YASARA软件中模拟其他XylS变体的结构。使用KingDraw软件绘制并生成各诱导物的2D和3D结构。以XylS及其突变体结构为受体，在其N端口袋状空间中心设置边长为25 Å的对接盒。利用YASARA软件对不同变体与小分子进行对接，获得多种对接构象。
【数据】软件：Alphafold2（Google Colab）、YASARA、KingDraw；对接盒边长：25 Å；对接盒位置：N端口袋状空间中心
4.5 XylS及其突变体对接构象的分子动力学模拟与分析
使用YASARA软件进行分子动力学模拟。对XylS蛋白结构进行脱氢和能量最小化预处理，在蛋白-配体结合构象周围5 Å距离处构建立方动力学盒子。盒子中填充0.9% NaCl（生理溶液）水溶液，pH为7.4，环境温度为298 K，系统密度为0.998。动态模拟采用AMBER14力场，总时长为20 ns，每250 ps采样一次。
【数据】软件：YASARA；溶液：0.9% NaCl水溶液；pH：7.4；温度：298K；密度：0.998；力场：AMBER14；时长：20ns；采样间隔：250ps
研究结果
2.1 不同大肠杆菌菌株对3-Cba传感器系统的影响
为开发高性能Cba生物传感器，我们合成了恶臭假单胞菌基因组中CA感应回路（Ps-XylS-Pm）的基因序列。将该序列与EGFP荧光报告基因克隆至pUC57载体中，构建完整的感应质粒（图S1）。考虑到不同底盘菌株间生物传感器性能可能存在差异，我们评估了感应质粒在五种常用大肠杆菌菌株中的响应，包括表达菌株BL21(DE3)、JM109(DE3)、MG1655(DE3)以及克隆菌株DH5α、TOP10。检测浓度（500 μM）和条件（37°C，6小时）依据先前报道和我们的预实验结果确定。
在暴露于相同浓度（500 μM）的诱导物3-Cba后，五种菌株表现出显著不同的响应。具体而言，BL21(DE3)、MG1655(DE3)、DH5α和TOP10菌株的传感系统分别显示出约为未诱导样品1.7倍、2倍、1.2倍和1.1倍的荧光信号增强，而JM109(DE3)菌株的传感器系统对诱导物未表现出任何响应（图1）。这些结果表明，MG1655(DE3)菌株是携带Cba全细胞生物传感器的最佳宿主。
值得注意的是，表达菌株（BL21(DE3)和MG1655(DE3)）的性能明显优于两种克隆菌株。这种改善可能并非由于表达菌株中存在额外的DE3位点，因为这些位点仅与噬菌体T7启动子相关。进一步研究发现，三个低响应菌株（DH5α、TOP10和JM109(DE3)）均为recA-endA基因突变菌株（表S1）。MG1655(DE3)菌株具有两个正常基因recA和endA，分别编码DNA重组酶和核酸内切酶。两者在执行功能前均经历DNA解旋和结合过程。因此，我们推测BL21(DE3)和MG1655(DE3)菌株中功能性recA-endA基因的存在可能促进感应质粒处于更易接近的状态，有利于调控蛋白XylS的结合。因此，表达菌株比recA-endA基因突变的克隆菌株表现出更优异的传感效果。然而，这一假设需要通过更多相关实验进一步验证。
另一方面，我们在实验中反复观察到MG1655的生长状态快于其他菌株。因此，推测菌株内部强大的代谢流也是提高传感效率的原因之一。
【数据】诱导物：3-Cba；浓度：500 μM；温度：37°C；时间：6h；荧光增强倍数：BL21(DE3)约1.7倍、MG1655(DE3)约2倍、DH5α约1.2倍、TOP10约1.1倍；JM109(DE3)：无响应
2.2 Pm和Ps启动子变体对Cba传感器系统的影响
随后，对Pm启动子（XylS调控蛋白的顺式作用元件，用于输出EGFP报告基因）进行修饰，以进一步提升Cba传感器系统的检测性能。此前，Bakke等人通过在包含−10区的24 bp区域引入随机突变，构建了Pm启动子变体文库（图2A）。其中，以3-Cba为诱导物、β-内酰胺酶为报告基因检测时，四个变体表现出超过4倍的诱导效果。我们选择这四个潜在变体（Pm 1–4）替换Cba传感系统中的野生型Pm启动子，并评估它们在3-Cba诱导下的效果。
如图2B所示，除Pm1略有优势外，其他三个变体在我们的系统中表现出与野生型Pm启动子相似甚至更低的诱导效果。显然，这一结果与文献中4倍的提升幅度差异很大。我们推测这种差异可能源于报告基因的不同——先前实验使用β-内酰胺酶作为报告基因，而本研究使用EGFP。β-内酰胺酶通过裂解底物发出信号，表现出级联放大效应。
Pm启动子是被XylS C端结构域内两个α螺旋识别的序列，相应碱基序列与各氨基酸残基表现出特异性结合亲和力。XylS蛋白结合该序列形成二聚体，诱导DNA弯曲，促进RNA聚合酶的募集以进行下游基因表达。通过在Pm中引入若干序列突变，可以增强α螺旋与特定碱基之间的特异性和结合强度，从而加速募集过程并提高系统灵敏度。基于这些发现，我们在后续实验中引入Pm1突变。
在Cba感应系统中，Ps启动子是负责调控蛋白XylS表达的关键元件。多项研究报道，调控蛋白的浓度可显著影响生物传感器的检测性能。例如，Wan等人通过将J101启动子替换为较弱的J109启动子来表达调控蛋白ArsR，显著改善了As3+砷生物传感器的动态范围和检测限（LOD）。因此，我们考察了在Cba传感系统中使用一组已知强度的组成型启动子（包括J112、J109、J110、J118和J100）来调节XylS蛋白表达水平的影响。然而，当我们将Ps启动子替换为这些组成型启动子后，传感器系统的动态范围和LOD均低于野生型Ps（图S2）。
进一步分析揭示，这是因为Ps启动子的功能不易被单一组成型启动子所替代。具体而言，Ps启动子很可能由诱导型Ps1启动子和组成型Ps2启动子组成，两者在Ps启动子的调控中均发挥作用。在没有配体的情况下，XylS通过Ps2低水平表达；而当存在外源诱导物激活XylS时，Ps1被激活以高水平表达XylS，从而使传感系统产生更强的响应信号。因此，Ps启动子被单一组成型启动子替换后性能大幅下降。
【数据】Pm突变区域：24bp（含−10区）；变体数量：4个（Pm1–4）；报告基因差异：β-内酰胺酶（文献）vs EGFP（本研究）；Ps替换启动子：J112、J109、J110、J118、J100
2.3 XylS变体对传感系统的影响
基于先前的研究发现，我们构建了三个XylS变体：Step13（F3Y/I50T/F97L/E195G/M196T）、A111V以及Step13/A111V组合变体，并以3-Cba为诱导物测试了这些变体的传感效果。Step13变体相比野生型XylS表现出3倍的荧光强度增加。A111V突变体的响应荧光增加了1.9倍，但背景信号同时升高，传感系统的信噪比与野生型组保持一致。出乎意料的是，Step13/A111V双变体在有无3-Cba诱导的情况下均表现出下游基因的高水平表达，导致响应丧失（图3）。
A111残基和Step13突变位点均位于XylS蛋白N端配体结合区域。因此，这些位点的突变可能显著增强蛋白质募集和结合诱导物的能力，从而提高其变构活性。在这些位点中，A111位点位于二聚体接触界面，因此该位点也被认为通过影响XylS二聚体形成来影响下游启动子的激活。Step13/A111V突变体诱导效应的丧失证实了这些位点不仅可能影响蛋白质的配体结合口袋亲和力，还可能影响活性二聚体形成的过程。两种突变的组合导致自发形成活性二聚体的倾向增大，超过了底物诱导形成活性二聚体的概率。
【数据】Step13突变位点：F3Y/I50T/F97L/E195G/M196T；荧光增强：Step13为野生型3倍；A111V为野生型1.9倍（背景同步升高）；Step13/A111V：响应丧失
2.4 XylS与诱导物3-Cba结合的分子动力学模拟
为探究Step13突变增强传感效率的分子机制，我们对野生型XylS、Step13和A111V变体在有无诱导物3-Cba条件下进行了分子动力学模拟分析。均方根波动（RMSF）曲线显示，在无诱导物条件下，Step13变体在一个环状结构区域表现出比野生型更高的灵活性。该环状结构位于配体结合口袋附近，其灵活性的增加可能有利于诱导物的进入和结合。在加入3-Cba后，Step13变体的该环状结构区域RMSF值降低，表明诱导物结合后该区域趋于稳定。
平均结合能计算结果显示，Step13变体与3-Cba的结合能显著低于野生型XylS与3-Cba的结合能，表明Step13变体与诱导物形成更稳定的结合。A111V变体的结合能介于野生型和Step13之间。这些结果与实验观察到的传感性能变化趋势一致——Step13变体表现出最高的荧光响应和最低的检测限。
【数据】方法：分子动力学模拟（20ns）；分析指标：RMSF、平均结合能；比较对象：野生型XylS、Step13、A111V
2.5 XyF10系统与原始系统的浓度响应比较
我们将优化后的传感系统（命名为XyF10，即MG1655(DE3)-Ps-XylS(Step13)-Pm1-EGFP）与原始野生型系统在不同浓度3-Cba诱导下进行了比较。在0–500 μM浓度范围内，经6小时诱导后，XyF10系统表现出显著改善的剂量-响应特性。XyF10系统的检测限<1 μM，而原始系统为50 μM。信噪比方面，XyF10系统达到11.7倍，远高于原始系统的4.4倍。
【数据】3-Cba浓度范围：0–500μM；诱导时间：6h；检测限：XyF10 <1μM vs 野生型 50μM；信噪比：XyF10 11.7倍 vs 野生型 4.4倍
2.6 XyF10系统对多种芳香化合物的响应特异性
为评估XyF10系统的底物特异性，我们测试了该系统对500 μM不同芳香族化合物的荧光响应，包括几种不同的苯甲酸衍生物和类似物。结果显示，XyF10系统对间位取代的3-Cba表现出明显的偏好性。对水杨酸的两种甲基取代物（3-MS和4-MS）、苯甲酸的三种甲基取代物（2-MA、3-MA和4-MA）以及其他苯甲酸衍生物和类似物的检测结果显示，XyF10系统对3-Cba的响应最为强烈。
【数据】测试浓度：500μM；底物类型：苯甲酸衍生物及类似物；偏好底物：间位取代3-Cba
2.7 底物2-Cba、3-Cba和4-Cba与Step13变体间的相互作用力与结合能
为进一步阐明XyF10系统对3-Cba偏好性的分子基础，我们分析了2-Cba、3-Cba和4-Cba三种位置异构体与Step13变体之间的相互作用力和结合能。分子对接和动力学模拟结果表明，3-Cba与Step13变体活性位点之间存在更强的相互作用。深蓝色表示π-π相互作用，浅绿色表示氢键相互作用，浅粉色表示其他相互作用类型。3-Cba与Step13变体之间表现出更丰富的π-π相互作用和氢键网络，这解释了XyF10系统对3-Cba的底物偏好性。
【数据】底物：2-Cba、3-Cba、4-Cba；相互作用类型：π-π相互作用（深蓝色）、氢键（浅绿色）；偏好底物：3-Cba
讨论与解读
全细胞生物传感器利用活细胞检测特定物质，与基于抗体的生物传感器相比，在工业检测领域具有独特优势：适用性广，可检测多种分子种类；可再生性强，细胞可在适宜条件下生长和再生；传感器制备和维护成本相对较低。然而，全细胞生物传感器也存在局限性——灵敏度和响应时间通常不及抗体传感器，特异性相对不足。早在1998年，就有基于Clark电极信号的Cba生物传感器被设计出来，可检测低至7 μM的3-Cba，但需要将微生物固定在氧电极上，且依赖特定仪器检测电信号。
本研究通过系统改造Cba感应回路的多个元件，成功获得了目前报道中对Cba检测限最低的全细胞传感器XyF10。Step13突变通过增强环状结构灵活性促进活性二聚体形成和诱导物稳定结合，这一机制层面的解析为转录因子类传感器的理性设计提供了参考。
【编译者解读】该研究展示了一个典型的全细胞传感器多维优化案例——底盘菌株筛选、启动子工程、调控蛋白突变三个层面依次推进，每一层的改造都有明确的实验依据和机制解释。将分子动力学模拟引入调控蛋白突变机制分析是亮点，使"哪个突变有效"升华为"为什么有效"。值得注意的是，Pm启动子变体在不同报告基因体系中的效果差异提示，传感器元件优化不能脱离最终输出模块孤立进行。XyF10对3-Cba的底物偏好性虽然限制了通用性，但对PCB降解途径中特定中间产物的监测而言反而可能成为优势。未来若能将此传感器与PCB降解菌株共培养，或可实现对降解效率的实时报告与高通量筛选。
参考来源
期刊：Biochemical Engineering Journal, 2024
DOI: 10.1016/j.bej.2023.109153
DOI: 10.1016/j.bej.2023.109153