来源：Unraveling the chrono-regulatory function of PhoP in nitrogen metabolism: A multi-scale engineering framework aimed at optimizing the synthesis of poly-γ-glutamic acid in Bacillus licheniformis（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
γ-聚谷氨酸（γ-PGA）是一种具有广泛工业应用的微生物聚合物，其合成高度依赖氮源，但缺乏氮源调控机制研究限制了其产量提升。本研究以地衣芽孢杆菌WX-02为对象，通过操纵全局调控因子PhoP实现氮代谢的时序协调，过表达菌株γ-PGA产量提升26.7%。机制解析表明PhoP具有双重工程靶点：直接结合并激活γ-PGA合成酶基因簇pgsBCA，同时通过转录级联动态协调谷氨酸转运、硝酸盐利用及氨同化等多个代谢模块，首次发现PhoP对TnrA的负调控和对GlnR的正调控作用。
研究背景
γ-聚谷氨酸是谷氨酸α-氨基与γ-羧基缩合形成的天然生物聚合物，凭借优异的水溶性、金属结合能力和生物相容性，在环境和生物医学工程领域被视为合成聚合物的可持续替代品。芽孢杆菌属是γ-PGA的主要生产菌株，提升产量的策略涵盖前体供应改善、合成酶表达增强、副产物途径抑制、能量辅因子优化及转录因子工程等。已知调控γ-PGA合成的转录调节因子多与环境变化相关，包括ComP-ComA、DegS-DegU、DegQ、SwrA和CcpA。尽管ComP-ComA和DegU已被证实可在营养胁迫下激活pgsBCA，其调控γ-PGA合成的时间动态特性尚未被探索。已有研究通过敲除枯草芽孢杆菌168的comA和spo0A基因，构建生长依赖性调控途径PhrQ-RapQ-DegU，使γ-PGA产量提升6.53倍。γ-PGA合成主要依赖氮源供给，而链霉菌中磷代谢调控因子PhoP已被证实在氮代谢中发挥调节作用，本研究据此假设PhoP可能参与地衣芽孢杆菌γ-PGA合成的调控。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本研究所用菌株和质粒列于表S1，引物见表S2。大肠杆菌DH5α用于载体构建，大肠杆菌BL21(DE3)用于PhoP诱导表达，地衣芽孢杆菌WX-02作为构建重组菌株的原始菌株。地衣芽孢杆菌和大肠杆菌均在Luria-Bertani（LB）培养基中培养，必要时添加相应抗生素（20 μg/mL四环素或20 μg/mL卡那霉素）。γ-PGA发酵培养基组成如下：80.0 g/L葡萄糖、30.0 g/L谷氨酸钠、18.4 g/L柠檬酸钠、10.0 g/L NaNO₃、8.0 g/L NH₄Cl、1.0 g/L K₂HPO₄、1.0 g/L MgSO₄·7H₂O、1.0 g/L ZnSO₄·7H₂O、0.15 g/L MnSO₄·7H₂O、1.0 g/L CaCl₂·2H₂O，pH 7.2。种子在含50 mL LB培养基的250 mL摇瓶中培养12 h，然后以3%（v/v）接种量转接至γ-PGA生产培养基，于230 rpm振荡培养30 h。用于代谢组学分析的ME培养基（pH 7.0）包含：20.0 g/L葡萄糖、20.0 g/L谷氨酸钠、12.0 g/L柠檬酸钠、7.0 g/L NH₄Cl、0.5 g/L K₂HPO₄、0.5 g/L MgSO₄·7H₂O、0.04 g/L FeCl₃·6H₂O、0.104 g/L MnSO₄·H₂O和0.15 g/L CaCl₂·2H₂O。除单交换过程中的菌株传代外，所有菌株均在37°C培养。
【数据】抗生素浓度：20 μg/mL四环素/卡那霉素；发酵培养基：80 g/L葡萄糖、30 g/L谷氨酸钠、18.4 g/L柠檬酸钠、10 g/L NaNO₃、8 g/L NH₄Cl，pH 7.2；接种量：3%（v/v）；转速：230 rpm；培养时间：30 h；ME培养基pH：7.0；培养温度：37°C
2.2 基因过表达菌株的构建
采用pHY300PLK质粒构建PhoP和GFP表达载体，phoP过表达菌株的构建方法基于本课题组前期报道的研究[28,29]。phoP基因从地衣芽孢杆菌WX-02基因组中克隆获得。含有P43启动子和TamyL终止子的pHY300PLK质粒经扩增后作为载体骨架。随后，使用2× MultiF Seamless Assembly Mix（RK21020，ABclonal Technology Co., Ltd.）将phoP基因与质粒载体骨架连接，生成质粒pHY-phoP。最后，将pHY-phoP电转化至WX-02中，获得PhoP表达菌株WX-02/pHY-phoP。作为示例，GFP报告质粒pHY-PpgsB-GFP的构建过程如下：首先分别扩增来自WX-02的特异性启动子片段PpgsB和含有GFP的载体骨架pHY300PLK-gfp；随后使用2× MultiF Seamless Assembly Mix组装上述片段，生成表达质粒pHY-PpgsB-GFP；将该质粒转化至宿主菌株，构建相应的GFP表达菌株。
【数据】组装试剂：2× MultiF Seamless Assembly Mix（RK21020，ABclonal）；启动子：P43；终止子：TamyL；转化方法：电转化
2.3 phoP缺失菌株的构建
采用温度敏感型质粒T2(2)-Ori在地衣芽孢杆菌WX-02中进行phoP基因敲除。首先分别扩增phoP两侧的上游和下游同源臂；随后通过重叠延伸PCR（SOE-PCR）连接两个片段，并按照前述方法克隆至T2(2)-Ori载体中，阳性克隆经PCR筛选并经DNA测序验证。随后将T2-△phoP电转入地衣芽孢杆菌WX-02，阳性克隆在含20 μg/mL卡那霉素的LB培养基中于45°C培养。克隆传代三次获得单交换重组子，随后将重组子在37°C LB培养基中培养多代以去除质粒。最终通过PCR验证和测序获得phoP缺失菌株WX-02△phoP。
【数据】敲除载体：T2(2)-Ori温度敏感型质粒；卡那霉素浓度：20 μg/mL；单交换培养温度：45°C；质粒去除温度：37°C
2.4 PhoP诱导表达与蛋白纯化
PhoP蛋白使用pET-28a(+)质粒（Novagen，丹麦）表达。扩增phoP基因并克隆至pET28a(+)中，获得PhoP诱导表达菌株BL21/pET28a-phoP。为制备C端携带6×His标签的PhoP蛋白，将BL21/pET28a-phoP在含20 μg/mL卡那霉素的5 mL LB培养基中培养12–14 h，取1 mL转接至含20 μg/mL卡那霉素的50 mL LB培养基中。当培养液OD₆₀₀达到0.6–0.8时，加入0.3 mmol/L IPTG诱导PhoP表达。随后在16°C下继续培养8–14 h。使用压力细胞破碎仪（JN-02C，Jnbio，中国）裂解细胞，按照说明书用Ni NTA琼脂糖重力柱（Smart-lifesciences，中国）纯化PhoP蛋白。最终通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测纯化蛋白。
【数据】表达载体：pET-28a(+)；卡那霉素浓度：20 μg/mL；IPTG浓度：0.3 mmol/L；诱导温度：16°C；诱导时间：8–14 h；破碎仪器：JN-02C压力细胞破碎仪
2.5 凝胶迁移率变动分析
EMSA实验使用纯化的PhoP蛋白与DNA探针进行，靶基因的生物素探针使用5′端生物素标记引物（Sangon Biotech，中国）扩增获得。EMSA实验使用化学发光EMSA试剂盒（Beyotime，中国）进行，非特异性竞争DNA poly(dI:dC)购自Thermo Fisher，图像通过Amersham Imager 600（Gelifesciences，美国）获取。
【数据】探针标记：5′生物素；试剂盒：化学发光EMSA试剂盒（Beyotime）；竞争DNA：poly(dI:dC)（Thermo Fisher）
2.6 γ-PGA产量检测
γ-PGA产量采用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法测定[31]。简要步骤如下：取2.00 g发酵液与4 mL 6 mol/L HCl混合，12,000 rpm离心5 min。上清液调至pH 7.5，与18.0 mL无水乙醇混合并剧烈振荡。沉淀干燥后用20.0 mL蒸馏水重悬，取100 μL重悬液与100 μL含0.15 M CTAB的2% NaOH在96孔板中混合，3–5 min后使用SpectraMax iD3多功能酶标仪（Molecular Devices，美国）测定吸光度值（OD₄₀₀）。γ-PGA产量（g/g发酵液）根据γ-PGA标准曲线确定。
【数据】HCl浓度：6 mol/L；离心：12,000 rpm、5 min；无水乙醇体积：18.0 mL；重悬体积：20.0 mL；CTAB浓度：0.15 M；NaOH浓度：2%；检测波长：OD₄₀₀；反应时间：3–5 min
2.7 分析方法
葡萄糖和谷氨酰胺浓度使用SBA-40C生物分析仪（山东省科学院，中国）检测。硝酸盐浓度采用水杨酸法测定[28]，亚硝酸盐浓度采用萘胺比色法测定，方法同前[28]。γ-PGA发酵过程中的转录分析：在对数中期（16 h）收集细胞提取总RNA。简要步骤：取2 mL发酵液于10 mL离心管中，用无菌无RNase水按1:4（v/v）稀释，4°C下12,000 rpm离心5 min。所得沉淀用100 μL 15 mg/mL溶菌酶处理，使用RNA提取试剂盒（FORE GENE，中国）提取RNA。第一链cDNA使用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒（Thermo Fisher，美国）合成。实时荧光定量PCR使用SYBR Select Master Mix（ABI，美国）进行，以16S rDNA和rpsE（30S核糖体蛋白S5）作为内参基因进行数据归一化。目标基因的相对转录水平以比值表示，代表重组菌株相对于对照菌株（设为1.000）的表达量。基因转录显著差异定义为p值<0.05且倍数变化>2或<0.5。GFP荧光强度使用SpectraMax iD3多功能酶标仪测定，激发波长480 nm，发射波长520 nm。细胞生物量通过OD₆₀₀测定，相对荧光强度以OD₆₀₀进行归一化。
【数据】RNA提取时间点：16 h（对数中期）；溶菌酶浓度：15 mg/mL、100 μL；离心条件：12,000 rpm、4°C、5 min；稀释比例：1:4（v/v）；GFP激发波长：480 nm；发射波长：520 nm；显著差异标准：p<0.05且倍数变化>2或<0.5
2.8 代谢物提取、GC-MS与代谢组学数据分析
代谢组学分析中，菌株在ME培养基中培养7.5 h，培养液迅速用液氮反复淬灭约十次以终止生长。随后收集十个OD₆₀₀单位的细胞，用无菌水重悬以分离γ-PGA。离心（8000 rpm，4°C，5 min）后，沉淀用2 mL预冷的0.85%（w/v）NaCl溶液洗涤两次。提取程序和气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析按照Yuan等[30]的方法进行。GC-MS数据首先使用Reifycs Abf Converter转换为abf格式，使用MSDIA软件与Fiehn Bin Base代谢组数据库进行匹配分析。
【数据】培养时间：7.5 h；淬灭方式：液氮反复淬灭约10次；细胞量：10个OD₆₀₀单位；离心条件：8000 rpm、4°C、5 min；洗涤：2 mL预冷0.85% NaCl洗涤两次
研究结果
3.1 phoP过表达和缺失对γ-PGA产量的影响
预实验中，在三种不同培养基（γ-PGA发酵培养基、ME培养基和LB培养基）中评估了WX-02的生物量和γ-PGA产量（图1A-B）。WX-02在γ-PGA培养基中表现出最大的生物量和γ-PGA产量，因此选择该培养基进行后续发酵和转录分析。ME培养基支持较低的生物量，γ-PGA产量较γ-PGA培养基降低约50%。然而，ME培养基中降低的γ-PGA积累有利于细菌细胞与γ-PGA的高效分离，使其更适合GC-MS检测前的菌株培养。
为研究phoP过表达和缺失对γ-PGA产量的影响，构建了phoP过表达菌株WX-02/pHY-phoP、缺失菌株WX-02△phoP和回补菌株WX-02△phoP/pHY-phoP。经30 hγ-PGA发酵，WX-02/pHY-phoP的γ-PGA产量（27.65±0.64 g/g）比WX-02/pHY300（21.82±0.92 g/g）高26.69%（P<0.01）（图1C）。此外，在5 L发酵罐中，WX-02/pHY-phoP的γ-PGA产量达到32.19 g/g，较WX-02/pHY300（28.90 g/g）提高11%（图1D）。发酵罐中γ-PGA产量提升幅度小于摇瓶，可能归因于溶解氧供应等与规模相关的差异及其他潜在调控因素[31,32]。WX-02△phoP的γ-PGA产量为17.86±0.69 g/g，较WX-02降低19.37%（P<0.01）。回补菌株的γ-PGA合成能力得到恢复，WX-02△phoP/pHY-phoP的γ-PGA产量恢复至20.83±0.34 g/g，与WX-02无显著差异（P>0.05）（图1C）。由此证实PhoP对γ-PGA合成具有显著调控作用。
进一步评估phoP缺失对γ-PGA合成的影响，在整个发酵过程中测定了WX-02△phoP和WX-02△phoP/pHY-phoP的生物量和γ-PGA产量。与WX-02相比，WX-02△phoP的生物量在对数后期（15–21 h）下降，但在稳定期（24–30 h）增加（图1E）。WX-02△phoP与WX-02之间的γ-PGA产量最大差异出现在18 h，WX-02△phoP的γ-PGA产量（6.42±0.40 g/g）较WX-02（16.12±1.84 g/g）降低60.16%（P<0.01）（图1F）。此外，WX-02△phoP在12–30 h间的单位细胞γ-PGA产量显著低于对照（表S3）。值得注意的是，pHY-phoP回补使OD₆₀₀和γ-PGA产量均恢复至野生型水平，无显著差异（图1E-F）。综上，phoP缺失显著降低γ-PGA产量，对数期生物量下降而稳定期生物量增加。
【数据】γ-PGA产量（WX-02/pHY-phoP）：27.65±0.64 g/g；γ-PGA产量（WX-02/pHY300）：21.82±0.92 g/g；提升幅度：26.69%；P<0.01；5 L发酵罐产量（WX-02/pHY-phoP）：32.19 g/g；5 L发酵罐产量（WX-02/pHY300）：28.90 g/g；提升幅度：11%；γ-PGA产量（WX-02△phoP）：17.86±0.69 g/g；降低幅度：19.37%；P<0.01；回补菌株产量：20.83±0.34 g/g；P>0.05；18 h时WX-02△phoP产量：6.42±0.40 g/g；18 h时WX-02产量：16.12±1.84 g/g；降低幅度：60.16%；P<0.01
3.2 PhoP对γ-PGA合成酶基因簇的正调控
phoP过表达菌株与WX-02之间的γ-PGA产量呈正相关（图1C）。为确定PhoP对γ-PGA合成酶基因簇pgsBCA的调控模式，测定了pgsB基因的转录水平——pgsB是pgsBCA操纵子中的第一个基因（图2A）。结果显示，WX-02△phoP中pgsB的转录水平降低（0.546±0.106），而在phoP过表达菌株中显著升高（图2B）。这些结果表明PhoP在转录水平上调pgsB基因。
为确认PhoP与pgsBCA之间的相互作用，使用生物素标记探针Bio-PpgsB和纯化的PhoP蛋白进行EMSA实验（图2C）。加入40 μM PhoP后探针出现显著迁移（图2D泳道2），重要的是该结合具有良好的特异性——添加非特异性竞争DNA后不受影响（泳道4）。这些结果表明PhoP直接结合pgsBCA启动子区域。为进一步确认PhoP对pgsBCA的正调控，进行了绿色荧光蛋白（GFP）表达实验。使用pgsBCA的启动子（PpgsB）介导报告基因gfp在WX-02△phoP和WX-02中的表达，分别获得菌株WX-02△phoP/pHY-PpgsB-GFP和WX-02/pHY-PpgsB-GFP，使用LB培养基培养上述菌株，每3 h取样测定绿色荧光强度。与WX-02/pHY-PpgsB-GFP相比，WX-02△phoP/pHY-PpgsB-GFP的荧光强度从6 h起显著降低，进一步证实PhoP正调控pgsBCA（图2E）。综上所述，PhoP直接正调控pgsB表达以促进γ-PGA合成。
【数据】WX-02△phoP中pgsB转录水平：0.546±0.106；EMSA中PhoP浓度：40 μM；GFP取样间隔：3 h；荧光差异起始时间：6 h
3.3 phoP缺失对胞内代谢途径的影响
据文献报道，PhoP在链霉菌中发挥全局调控作用[33]。为确定PhoP在γ-PGA合成中更多可能的间接调控途径，对WX-02△phoP和WX-02进行了代谢组学分析。菌株在含10 g/L NaNO₃的ME培养基中培养，在对数期（7.5 h）精确取样（图3A）。GC-MS共检测到98种具有精确InChIKey值的代谢物，其中73种通过KEGG数据库鉴定。随后通过OPLS-DA分析WX-02和WX-02△phoP的代谢谱，两组间存在显著差异（图3B）。
使用SIMCA分析软件，通过PCA分析获得33种变量投影重要性得分>1的代谢物（图3C），使用材料与方法中描述的方法鉴定出19种差异代谢物（表1）。其中尿嘧啶、谷氨酸、熊果苷、4-氨基丁酸和脯氨酸的差异最为显著。使用MetaboAnalyst软件鉴定出地衣芽孢杆菌中与上述19种差异代谢物相关的35条代谢途径。如图3D所示，这些途径以从黄色到红色的颜色表示其影响显著程度，主要差异代谢途径为丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（P<0.01），其次是精氨酸和脯氨酸代谢（P<0.01）、氨基糖和核苷酸糖代谢（P<0.05）、精氨酸生物合成（P<0.05）和氨酰-tRNA生物合成（P<0.05）。基于已知的γ-PGA生物合成途径（图3E），研究了PhoP的间接调控机制。在地衣芽孢杆菌中，γ-PGA前体谷氨酰胺通过两条主要途径供给：从胞外游离谷氨酸转运，或从葡萄糖代谢从头合成。谷氨酰胺的转运需要谷氨酸转运蛋白，而从葡萄糖合成谷氨酰胺涉及三羧酸循环中α-酮戊二酸通过氨同化途径的转化。因此，选择谷氨酸利用、氮源利用和氨同化三条特定代谢途径来分析PhoP对γ-PGA合成的间接调控模式。
【数据】ME培养基NaNO₃浓度：10 g/L；取样时间：7.5 h（对数期）；检出代谢物总数：98种；KEGG鉴定数：73种；VIP>1代谢物数：33种；差异代谢物数：19种；显著差异途径：丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢（P<0.01）、精氨酸/脯氨酸代谢（P<0.01）、氨基糖与核苷酸糖代谢（P<0.05）、精氨酸生物合成（P<0.05）、氨酰-tRNA生物合成（P<0.05）
3.4 PhoP介导的谷氨酸利用正调控
为确定PhoP在谷氨酸利用中的作用，定量了γ-PGA发酵过程中的残余谷氨酸含量。WX-02△phoP的残余谷氨酸含量（图4A实线）高于WX-02，WX-02△phoP的谷氨酸利用率（图4A虚线）在对数早期（18 h前）较慢，但在对数后期（18 h后）较快。WX-02/pHY-phoP的谷氨酸含量呈现相反模式（图4B）。这些结果表明PhoP可能影响用于γ-PGA合成的谷氨酸利用。进一步定量了谷氨酸转运蛋白基因gltT和gltP的转录水平[34]。
【数据】谷氨酸利用率转折时间点：18 h；残余谷氨酸趋势：WX-02△phoP高于WX-02
3.5 PhoP介导的氮源利用调控
【数据】原文未详述——该段对应原文结果3.5节，涉及硝酸盐和亚硝酸盐浓度与利用率测定，具体数值需参照原文图5。
3.6 PhoP通过GlnR和TnrA正调控氨同化
【数据】原文未详述——该段对应原文结果3.6节，涉及rocG、glnA、gltA转录水平及GFP时序表达实验，具体数值需参照原文图6。
3.7 PhoP介导调控的整合模型
【数据】原文未详述——该段对应原文结果3.7节，涉及PhoP调控网络的整合模型总结。
讨论与解读
本研究聚焦具有广泛工业应用价值的生物大分子γ-PGA，从代谢调控机制入手提升其发酵产量。尽管已有多个γ-PGA合成代谢调控网络被报道，实际生产仍面临挑战。由于γ-PGA合成需要充足氮源，而磷代谢调控因子PhoP在链霉菌中已被证实参与氮代谢调控[26,33]，研究者假设PhoP可能对γ-PGA合成发挥调控作用。通过代谢组学与生理学联合分析，该假设得到证实：PhoP不仅能正调控γ-PGA合成基因簇pgsBCA，还影响谷氨酸吸收、硝酸盐利用和氨同化过程。研究首次检测到PhoP对氮饥饿调控因子TnrA的负调控，同时确认了对GlnR的正调控。最终阐明了PhoP在γ-PGA合成中的具体调控机制（图7A），丰富了PhoP在芽孢杆菌中的调控网络。γ-PGA合成所需谷氨酸来源于培养基中的胞外谷氨酸钠和菌体自身合成的胞内谷氨酸两个途径，本研究对总谷氨酸消耗的分析为理解这一复杂过程提供了新视角。
编译者解读：该研究将传统的"单靶点代谢工程"升级为"全局调控因子时序协调"策略，PhoP作为连接磷代谢与氮代谢的交叉节点，其双重调控模式（直接结合启动子+间接级联调控）为其他氮依赖性生物聚合物的菌株改造提供了可借鉴的范式。尤其值得关注的是PhoP对TnrA-GlnR的差异化调控——同一转录因子对不同调控子施加相反效应，这种"调控的调控"策略在工业菌株设计中具有独特价值。但研究也存在局限：5 L发酵罐中产量增幅（11%）明显低于摇瓶（26.69%），提示规模放大过程中的氧气传质等因素可能削弱PhoP过表达的效果，未来需结合发酵工艺优化释放该策略的工业潜力。时间分辨GFP报告系统的引入则为动态调控研究提供了有力工具。
参考来源
Zhang Q. Unraveling the chrono-regulatory function of PhoP in nitrogen metabolism: A multi-scale engineering framework aimed at optimizing the synthesis of poly-γ-glutamic acid in Bacillus licheniformis. Chemical Engineering Journal, 2025.
DOI: 10.1016/j.cej.2025.165782
DOI: 10.1016/j.cej.2025.165782