来源：Microbial synthesis of picolinic acid via retro-biosynthetic pathway engineering（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
吡啶甲酸（PA）是一种天然存在的吡啶衍生物，在动物体内经犬尿氨酸途径由色氨酸分解代谢产生，其金属盐类（如吡啶甲酸铬、吡啶甲酸锌）广泛用于膳食补充剂和动物饲料。然而，传统化学合成法依赖高温、危险试剂，环境负担沉重。本研究通过逆向生物合成策略，在大肠杆菌中仅用两种异源酶替代天然途径的十一步反应，实现了PA从葡萄糖和甘油的从头生物合成，摇瓶产量分别达635.03 ± 31.19 mg/L和474.37 ± 3.20 mg/L。这是PA微生物从头生物合成的首次报道。
研究背景
吡啶甲酸（PA，即吡啶-2-羧酸）是动物体内色氨酸经犬尿氨酸途径分解代谢产生的天然吡啶衍生物。结构上，PA在吡啶环2位连有羧基，可作为双齿螯合剂，与锌、铬、锰、铁等金属离子形成稳定配合物。其金属盐应用广泛：吡啶甲酸铬是改善胰岛素敏感性和血糖控制的人体膳食补充剂；吡啶甲酸锌因生物利用度优越，用于免疫功能支持和锌缺乏治疗。在农业领域，两者可提升畜禽饲料效率和动物健康。商业需求的增长推动了对可持续生产方法的探索。传统化学合成路线（如2-甲基吡啶氨氧化或硝酸氧化）需要高温、危险试剂和能源密集型条件，产生显著环境负担。自然界中仅发现一条PA生物合成途径——人和动物体内的犬尿氨酸途径，从色氨酸经七步反应（六种酶加一个非酶促反应）生成PA。若在大肠杆菌中重建该途径用于从头生产，还需引入五步色氨酸合成模块，总步骤将延长至12步，路线冗长复杂，且ACMS自发环化会使大量碳流转向QA，进一步降低PA产量。
研究方法
关于化学品、试剂、材料、实验程序和分析方法的详细信息见补充材料。
菌株构建方面，以大肠杆菌BW25113（F′）为出发菌株。为将碳流从葡萄糖导向邻氨基苯甲酸（AA），通过敲除关键丙酮酸生成基因pykA、pykF、ptsG和trpE，以及trpD基因，构建了平台菌株PAU01，该菌株在含葡萄糖培养基中生长不良。将中等拷贝数质粒pMK-TrpEfbrG（过表达trpEfbr——trpE的反馈抑制抗性突变体M293T——和trpG）导入PAU01，得到菌株PAU02，细胞生长得以恢复并实现高效AA生产。平行地，通过敲除pykA、pykF、gldA和trpE（另加trpD），构建了基于甘油的平台菌株PAY01。将pMK-trpEfbrG导入PAY01得到菌株PAY02，也能高效生产AA。
ABH酶活性验证实验中，编码ABH的基因经合成后亚克隆至高拷贝质粒pHA-GFP，得到表达载体pHA-ABH。将pHA-ABH和pMK-TrpEfbrG共转化至宿主菌PAY01，命名为菌株PAY03。摇瓶实验中，PAY03发酵30小时后产生1121.36 ± 42.90 mg/L的2-AP。培养物中残留AA（250.64 ± 37.46 mg/L）证实前体供给并非限制因素。
【数据】菌株：PAU01（敲除pykA、pykF、ptsG、trpE、trpD）；PAY01（敲除pykA、pykF、gldA、trpE、trpD）；质粒：pMK-TrpEfbrG（中等拷贝）、pHA-ABH（高拷贝）；突变：trpEfbr为M293T突变体；时间：30 h；2-AP产量：1121.36 ± 42.90 mg/L；残留AA：250.64 ± 37.46 mg/L
AmnAB活性评价实验中，amnAB基因经合成后克隆至低拷贝质粒pLC-GFP，生成pLC-AmnAB。将该构建体导入PAY01，得到菌株PAY04。当与1 g/L（9.16 mM）2-AP共孵育时，PAY04在24小时内转化全部2-AP并产生968.49 ± 15.72 mg/L（7.86 mM）PA，对应摩尔产率为86%。PA经MSTFA三甲基硅烷基（TMS）衍生化后通过GC-MS鉴定，在m/z 180、136和78处观察到特征碎片离子，与TMS衍生化吡啶-2-羧酸的碎裂模式一致，并通过NIST质谱库比对进一步确认。将2-AP浓度提高至2 g/L时，同样被完全转化，24小时内PA滴度达1561.48 ± 46.13 mg/L。
【数据】底物：2-AP 1 g/L（9.16 mM）和2 g/L；时间：24 h；PA产量：968.49 ± 15.72 mg/L（7.86 mM）和1561.48 ± 46.13 mg/L；摩尔产率：86%；质粒：pLC-AmnAB（低拷贝）；GC-MS特征离子：m/z 180、136、78
从头PA生物合成实验中，将所有测试途径酶在大肠杆菌中共表达，测试两种初始质粒配置：（1）pHA-ABH-AmnAB（高拷贝质粒，ABH和AmnAB分别以独立操纵子表达）加pMK-TrpEfbrG；（2）pHA-ABH-AmnAB加pLC-TrpEfbrG（TrpEfbrG置于低拷贝质粒）。这些构建体导入PAY01后分别生成菌株PAY05和PAY06。令人意外的是，尽管AA大量积累，两种菌株均未产生可检测的PA或2-AP。推测高拷贝质粒共表达ABH和AmnAB造成代谢负担并破坏途径平衡。为解决此问题，通过改变三个模块（ABH、AmnAB和TrpEfbrG）的质粒拷贝数优化基因表达，生成六种组合（表1）。
【数据】质粒配置：pHA-ABH-AmnAB + pMK-TrpEfbrG（PAY05）；pHA-ABH-AmnAB + pLC-TrpEfbrG（PAY06）；模块组合数：6种；结果：PAY05和PAY06均无可检测PA或2-AP
研究结果
在逆向生物合成设计方面，迄今自然界仅发现一条PA生物合成途径。该途径存在于人类和动物中，通过犬尿氨酸途径将外源色氨酸转化为PA，涉及七步反应（六种酶加一个非酶促反应）（图1）。若在大肠杆菌中重建此途径用于从头生产PA，需从莽草酸途径中间体分支酸出发，引入五步色氨酸生物合成模块（trpEDCBA），总途径将延长至12步。如此冗长的路线带来显著复杂性，可能导致低生物合成效率，给途径构建和优化带来巨大挑战。更不利的是，ACMS的自发环化会将大量碳流通向QA，进一步降低PA产量（图1）。为克服这些局限，受已报道的2-氨基苯酚（2-AP）降解反应启发，采用逆向生物合成策略设计了仅涉及两种异源酶的非天然捷径途径（图1）。该路线中，PA通过1,6-双加氧酶催化的2-AP开环加氧反应生成，随后开环产物AMS自发环化为PA。逆向推导，下一步寻找能将2-AP与大肠杆菌初级代谢物连接的反应。基于2-AP的分子结构，推测脱羧羟基化反应可将大肠杆菌内源邻氨基苯甲酸（AA）转化为2-AP。已有研究报道黄素依赖性羟化酶如水杨酸1-羟化酶和4-氨基苯甲酸羟化酶可催化该转化。其中，来自双孢蘑菇的4-氨基苯甲酸羟化酶（ABH，GenBank: BAA07468.1）是一种FAD依赖的宽底物单加氧酶，据报道可在NADH和O2存在下催化AA和4-氨基苯甲酸的脱羧羟基化反应，并已用于2-乙酰氨基酚和N-乙酰对氨基苯酚的生物合成。最后，通过过表达TrpEfbr（邻氨基苯甲酸合酶组分1的反馈抑制抗性突变体）和TrpG（邻氨基苯甲酸合酶组分2）增强细胞内AA供给，并破坏trpD以消除AA消耗，实现了从简单碳源从头生物生产PA（图1）。
【数据】天然途径步骤：7步（6种酶+1个非酶促反应）；大肠杆菌重建后总步骤：12步；人工捷径途径异源酶数：2种；来源酶：ABH（Agaricus bisporus，GenBank: BAA07468.1）、AmnAB（Comamonas CNB-1）
AA向2-AP的转化是人工途径中最关键的一步，因此首先在体内验证了ABH活性。为保证充足前体供给，构建了以葡萄糖或甘油为碳源的AA过量生产菌株。采用已建立的丙酮酸介导代谢驱动力策略——删除参与丙酮酸生成的关键基因形成丙酮酸缺陷型宿主细胞（生长缓慢），引入以丙酮酸为副产物的异源生物合成途径可恢复细胞生长，从而将生长与目标产物形成偶联，提高产量和产率。本例中，涉及TrpEG的AA和PA生物合成途径以丙酮酸为副产物。摇瓶实验中，PAU02在48小时内积累928.71 ± 25.34 mg/L AA（图2A）。同时，PAY02在48小时内从甘油产生1209.76 ± 20.99 mg/L AA（图2A），优于葡萄糖基菌株。鉴于其更高的AA生产率，选择PAY02进行后续ABH活性测试。摇瓶实验中，PAY03发酵30小时后产生1121.36 ± 42.90 mg/L的2-AP（图2D、E）。培养物中残留AA（250.64 ± 37.46 mg/L）（图2E）证实前体可用性并非限制因素。
【数据】PAU02（葡萄糖）：AA产量928.71 ± 25.34 mg/L，48 h；PAY02（甘油）：AA产量1209.76 ± 20.99 mg/L，48 h；PAY03：2-AP产量1121.36 ± 42.90 mg/L，30 h；残留AA：250.64 ± 37.46 mg/L
PA生物合成的最后一步是将2-AP经两个反应转化为PA（图2F）。2-AP的开环裂解反应已在Pseudomonas pseudoalcaligenes JS45、P. knackmussii B13、P. putida HS12、Burkholderia xenovorans LB400和Comamonas CNB-1的好氧2-AP分解代谢途径中有所描述。其中，来自Comamonas CNB-1的2-氨基苯酚1,6-双加氧酶（AmnAB）由α亚基（CnbCa，NCBI: WP_012478203.1）和β亚基（CnbCb，NCBI: WP_012478204.1）组成，被选用于本研究评价。当与1 g/L（9.16 mM）2-AP孵育时，PAY04在24小时内转化全部2-AP并产生968.49 ± 15.72 mg/L（7.86 mM）PA（图2H、I、S1），对应摩尔产率86%。当2-AP浓度提高至2 g/L时，同样被完全转化，24小时内PA滴度达1561.48 ± 46.13 mg/L（图2I）。这些结果表明AmnAB对2-AP表现出强加氧活性，中间体AMS优先将碳流导向PA生成。
【数据】底物2-AP：1 g/L（9.16 mM）和2 g/L；时间：24 h；PA产量：968.49 ± 15.72 mg/L（7.86 mM）和1561.48 ± 46.13 mg/L；摩尔产率：86%；菌株：PAY04（含pLC-AmnAB）
从头PA生物合成中（图3A），将所有测试途径酶在大肠杆菌中共表达，测试两种初始质粒配置。两种菌株PAY05和PAY06均未产生可检测PA或2-AP，尽管AA大量积累。推测高拷贝质粒共表达ABH和AmnAB造成代谢负担并破坏途径平衡。通过改变三个模块的质粒拷贝数生成六种组合（表1），将这些质粒组合导入PAY01后获得一系列菌株。经过模块化优化，最终实现了PA的高效从头生物合成——从葡萄糖获得635.03 ± 31.19 mg/L、从甘油获得474.37 ± 3.20 mg/L的PA滴度。
【数据】PAY05/PAY06：无可检测PA或2-AP；优化后葡萄糖来源PA：635.03 ± 31.19 mg/L；甘油来源PA：474.37 ± 3.20 mg/L；时间：48 h
讨论与解读
传统PA合成依赖化石燃料衍生底物（如吡啶或2-甲基吡啶）且需有机溶剂，引发环境、安全和健康关切。本研究利用逆向生物合成途径工程策略，在大肠杆菌中以可再生原料（葡萄糖和甘油）建立了合理设计的人工捷径途径用于PA生产。该人工路线始于AA，仅用两种异源酶，比天然途径缩短了八步。通过酶验证、途径组装以及基因表达、前体供给和辅因子可用性的优化，实现了PA的微生物从头生产，摇瓶培养中葡萄糖来源滴度达635.03 ± 31.19 mg/L，甘油来源达474.37 ± 3.20 mg/L。据作者所知，该工作首次证明了PA的微生物从头生物合成。合理设计的人工途径克服了天然途径的复杂性和低效性。
编译者解读：本研究是典型的逆向生物合成案例——不从天然途径出发做延长，而是从目标分子倒推最短酶促路线，将11步天然反应压缩为2步异源催化。这种"断舍离"式设计思维值得借鉴：合成生物学有时不是做加法而是做减法。选择ABH和AmnAB两种酶分别承担脱羧羟化和开环双加氧功能，巧妙利用了中间体AMS的自发环化化学。不过，目前摇瓶产量仍处于毫克级，距离工业化尚有距离；此外，2-AP中间体的潜在毒性、高拷贝质粒带来的代谢负担等问题在放大生产中可能更加突出。后续若能在酶工程改造（提高ABH对AA的催化效率）和发酵工艺优化（补料分批、原位产物移除）上继续推进，该人工途径有望成为PA绿色制造的可行平台。
DOI: 10.1016/j.cej.2026.173937