来源：Development of Komagataella phaffii as a cell factory for efficient de novo production of β-caryophyllene（New Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
β-石竹烯是一种天然双环倍半萜，广泛存在于丁香、肉桂等植物中，具有抗炎、抗癌、镇痛等生物活性，同时因其高能量密度而受到生物燃料领域关注。植物提取法产量低、纯化复杂，微生物合成成为替代方案。本研究首次在Komagataella phaffii（毕赤酵母）中系统构建β-石竹烯生物合成途径，通过蛋白融合、MVA途径强化、分支途径弱化及多拷贝策略，最终获得产量136.4 mg/L的工程菌株AaCPS16，较初始菌株提升37倍。
研究背景
β-石竹烯是一种双环倍半萜，天然存在于丁香、肉桂等多种植物中，常以反式石竹烯形式与少量异石竹烯、α-蛇麻烯等异构体共存。该化合物具有强烈的木质香气，已获FDA和EFSA批准作为食品调味剂使用。作为一种植物大麻素，β-石竹烯可作为有效镇痛剂且无精神副作用，被视为癌症辅助治疗的候选分子——例如，β-石竹烯能增加紫杉醇对细胞膜的渗透性，使其对结肠癌细胞DLD-1的抑制活性提高10倍。在生物能源领域，β-石竹烯添加至合成支链烷烃中可提高生物燃料十六烷值，满足航空燃料需求，曾被视为最有前景的高能量密度航空燃料之一。
然而，植物提取法难以满足生物医药、保健食品和生物燃料对石竹烯的需求。Komagataella phaffii具有强大的转录调控系统，在蛋白表达和高密度培养方面优势明显，适合大规模工业化生产。目前尚无在K. phaffii中高效生物合成β-石竹烯的系统研究报道。
研究方法
菌株与培养条件
本工作使用E. coli DH5α进行质粒构建，E. coli DH5α在LB培养基（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨和10 g/L NaCl）中、37°C、220 rpm条件下培养。K. phaffii菌株在YPD培养基（20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物和20 g/L葡萄糖）中、30°C、220 rpm条件下培养。
【数据】培养基：LB（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl）/YPD（20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖）；温度：37°C（E. coli）/30°C（K. phaffii）；转速：220 rpm
质粒构建
本研究所用质粒和引物列于表S1和S2。密码子优化的AaCPS基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，优化后序列见表S3。来自P. pastoris的基因（ERG20、IDI1、tHMG1、ERG12和ERG19）从K. phaffii基因组中克隆获得。所有质粒通过Gibson assembly反应构建。
基因组编辑采用CRISPR/Cas9系统。首先转化质粒pGAP-Cas9构建具有Cas9编辑能力的K. phaffii菌株。随后，根据前期工作设计含有sgRNA及靶基因同源序列的构建质粒。蛋白表达质粒由一对K. phaffii启动子和终止子组成——所用启动子包括TEF1和GAP，终止子为AOX1和0547 t。构建基因组整合质粒时，选择特异位点上下游500–1000 bp片段作为同源臂，靶基因插入中间位置。最后，含靶基因的同源臂与载体PTEF1-TAOX1融合。sgRNA质粒额外含有K. phaffii复制子。gRNA设计参照Benchling CRISPR工具（https://benchling.com/crispr/）。
【数据】同源臂长度：500–1000 bp；启动子：TEF1、GAP；终止子：AOX1、0547 t
菌株构建
所有β-石竹烯生物合成基因均通过CRISPR/Cas9整合至K. phaffii染色体。含靶基因的同源臂片段与对应gRNA通过电转化同时转入细胞。gRNA质粒通过松弛培养去除。所有重组菌株列于表1。
【数据】转化方法：电转化；整合方式：CRISPR/Cas9基因组整合
发酵条件
挑取构建菌株的单克隆菌落接种至含5 mL YPD培养基的试管中，于30°C、220 rpm条件下培养。生长24 h后，取1%培养液转接至含50 mL YPD的250 mL摇瓶中培养72 h。其中，在培养12–24 h后向YPD中添加10%正十二烷。
【数据】培养基：YPD；接种量：1%；培养体积：50 mL/250 mL摇瓶；温度：30°C；转速：220 rpm；时间：24 h（试管）+ 72 h（摇瓶）；萃取剂：10%正十二烷（12–24 h后添加）
β-石竹烯检测方法
重组菌株发酵结束后，取发酵液上层稀释10–1000倍。十二烷层经适当稀释后，使用GC-MS检测β-石竹烯。仪器为配备火焰离子化检测器（FID）和SH-I-SiI色谱柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 µm）的气相色谱仪（GC-TQ8050 NX；SHIMADZU）。进样口温度维持在240°C。氦气为载气，流速1.08 mL/min。升温程序如下：初始温度60°C保持1 min，以10°C/min升至280°C并保持2 min。离子源温度和接口温度维持在250°C。溶剂延迟时间3 min。
【数据】色谱柱：SH-I-SiI（30 m × 0.25 mm × 0.25 µm）；进样口温度：240°C；载气：氦气，1.08 mL/min；升温程序：60°C保持1 min→10°C/min→280°C保持2 min；离子源/接口温度：250°C；溶剂延迟：3 min；稀释倍数：10–1000倍
研究结果
*K. phaffii*中异源表达AaCPS生产β-石竹烯
根据前期研究，来自黄花蒿（Artemisia annua）的β-石竹烯合酶AaCPS能高效催化FPP生成β-石竹烯，本研究选择AaCPS作为倍半萜合酶元件。首先，根据K. phaffii密码子偏好性对AaCPS基因进行密码子优化。随后，为保持工程菌株的遗传稳定性，将AaCPS基因整合至基因组，构建菌株AaCPS1。如图1和图S1所示，在AaCPS1的摇瓶发酵中检测到β-石竹烯，产量为3.6 mg/L。与前期报道一致，发酵液中几乎没有其他倍半萜副产物。
【数据】菌株：AaCPS1；β-石竹烯产量：3.6 mg/L；副产物：几乎无其他倍半萜
通过AaCPS与ERG20融合提升β-石竹烯生物合成
为促进中间产物利用效率，连续参与两个或多个催化步骤的蛋白质可采用融合策略表达。在β-石竹烯生物合成途径中，FPP由ERG20酶合成，作为β-石竹烯的前体。因此，本研究设计了不同连接肽将ERG20与AaCPS融合，以最小化FPP的竞争消耗（图2）。同时，构建独立表达AaCPS和ERG20的菌株AaCPS2作为对照。结果表明，融合能有效提高β-石竹烯产量，不同连接肽对产量有一定影响，其中以(PA)5为连接肽的AaCPS7表现最佳（图2）。AaCPS7中β-石竹烯产量提高至8.4 mg/L，是原始菌株AaCPS1的2.3倍。
【数据】菌株：AaCPS7（(PA)5连接肽）；β-石竹烯产量：8.4 mg/L；提升倍数：原始菌株AaCPS1的2.3倍
增加FPP代谢通量促进β-石竹烯生产
β-石竹烯由FPP经AaCPS催化环化合成。FPP通过MVA途径合成，优化该途径可提高β-石竹烯产量。为系统优化MVA途径，我们逐一评估每个基因，尝试强化MVA途径中的每一步反应。考虑到IPP与DMAPP之间的平衡对倍半萜合成的重要性，我们在工程菌株AaCPS7中过表达IDI1——该基因参与IPP与DMAPP之间的异构化。出乎意料的是，此次仅观察到发酵产量的小幅提升。
随后，将MVA途径的限速基因HMGR转化为在细胞质中更稳定的截短形式tHMGR，并以强组成型启动子控制其过表达。β-石竹烯产量提高118%，达到23.8 mg/L。这表明HMG-CoA上游的MVA合成是K. phaffii中异戊二烯合成的瓶颈。为克服前体供应不足的问题，进一步在菌株AaCPS9中过表达ERG12和ERG19，β-石竹烯产量显著提高，最高达32.3 mg/L（图3）。这些结果表明，MVA途径基因的协同表达对萜类生物合成至关重要。
【数据】菌株AaCPS8（过表达tHMG1）：23.8 mg/L，较AaCPS7提高118%；菌株AaCPS9（过表达ERG12+ERG19）：32.3 mg/L
通过削弱FPP分支代谢途径精细调控合成回路
角鲨烯合酶（ERG9）是平衡细胞生长与石竹烯合成的关键节点。当以FPP为底物合成萜类时，角鲨烯与前体之间的竞争会影响目标产物的产量。由于角鲨烯的下游产物麦角甾醇是细胞膜的必要组分，敲除ERG9基因会影响细胞生长，因此通常通过启动子替换的方式下调ERG9基因的表达。本工作中，通过截短ERG9天然启动子（Perg9）来减弱ERG9表达。如图4所示，比较了不同截短长度对β-石竹烯产量的影响，发现当启动子上游截短100 bp时（菌株AaCPS13），产量提高38%，达到44.3 mg/L。这些结果表明，限制角鲨烯合成有利于FPP代谢通量流向β-石竹烯生产。
【数据】菌株：AaCPS13（ERG9启动子上游截短100 bp）；β-石竹烯产量：44.3 mg/L；提升幅度：38%
ERG20-(PA)5-AaCPS多拷贝策略进一步提高β-石竹烯产量
多拷贝策略是提高工程菌株生产目标产物效率的有效方法。前期工作中，我们成功筛选到合适连接肽(PA)5的融合蛋白ERG20-AaCPS，使β-石竹烯产量在原始菌株基础上提高2.3倍。为进一步提高β-石竹烯产量，在已获得最高产量的菌株AaCPS13中构建了不同拷贝数的ERG20-(PA)5-AaCPS重组K. phaffii。分别额外整合1、2、3个拷贝至AaCPS13中，获得工程菌株AaCPS14、AaCPS15和AaCPS16。结果表明，ERG20-(PA)5-AaCPS的拷贝数对β-石竹烯产量提升非常有效，表明β-石竹烯的转化速率是主要的限速步骤。逐一增加拷贝数后，β-石竹烯最终产量可达136.4 mg/L（图5），是AaCPS13的3倍以上，是原始菌株AaCPS1的37倍。
【数据】菌株AaCPS14（+1拷贝）：原文未详述具体值；菌株AaCPS15（+2拷贝）：原文未详述具体值；菌株AaCPS16（+3拷贝）：136.4 mg/L；提升倍数：AaCPS13的3倍、AaCPS1的37倍
讨论与解读
倍半萜类化合物具有多种生理功能，是植物天然药物开发的重要来源。然而，植物中倍半萜含量极低且组成复杂，难以获得足够量高纯度的化合物单体，严重限制了其应用。β-石竹烯作为一种双环倍半萜，因特殊香气及抗菌、抗炎、抗癌、镇痛等生物功能，在食品、化妆品和医药领域备受关注。β-石竹烯及其异构体也被视为地面交通和航空燃料的可再生能源候选分子。K. phaffii是优良的化学品生产底盘微生物，适合大规模生产。据目前所知，尚无在K. phaffii中生物合成β-石竹烯的报道。
本研究首先将密码子优化的AaCPS整合至K. phaffii基因组，成功实现β-石竹烯合成，且发酵液中几乎没有其他倍半萜副产物，表明K. phaffii可作为微生物细胞工厂用于倍半萜的工业生产。
编译者解读： 该研究展示了典型的代谢工程系统优化路径——从异源基因表达、蛋白融合、前体通量强化、分支途径弱化到拷贝数调整，层层递进、逻辑清晰。选择K. phaffii作为底盘菌株，看中的是其蛋白表达与高密度培养优势，但MVA途径各基因的逐一筛选与组合过表达策略对其它萜类合成同样具有借鉴价值。136.4 mg/L的摇瓶产量虽仍需进一步发酵优化，但作为首例报道，为K. phaffii中倍半萜合成奠定了方法学基础。后续若能在 bioreactor 中放大并优化发酵条件，有望进一步释放该菌株的生产潜力。
参考来源
Cheng J. Development of Komagataella phaffii as a cell factory for efficient de novo production of β-caryophyllene. New Biotechnology, 2025.
DOI: 10.1016/j.nbt.2024.12.002
DOI: 10.1016/j.nbt.2024.12.002