来源：Engineering the probiotic bacterium Escherichia coli Nissle 1917 as an efficient cell factory for heparosan biosynthesis（Enzyme and Microbial Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
肝素前体（heparosan）是合成抗凝药物肝素的关键原料，传统动物源肝素存在免疫原性与跨物种污染风险。本研究以天然分泌heparosan的益生菌大肠杆菌Nissle 1917（EcN）为底盘，通过系统代谢工程优化两种前体UDP-GlcA与UDP-GlcNAc的供给，并强化heparosan合成酶表达，最终在3-L补料分批发酵中实现11.50 g/L的产量，展示了EcN作为安全微生物底盘的应用潜力。
研究背景
Heparosan是一种酸性多糖，由N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）与葡萄糖醛酸（GlcA）重复二糖单元组成，是肝素生物合成的前体。UDP-GlcA与UDP-GlcNAc是heparosan聚合所需的活性前体形式。在EcN中，葡萄糖经磷酸葡萄糖变位酶（Pgm）、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶（GalU）及UDP-葡萄糖6-脱氢酶（KfiD）转化为UDP-GlcA；而UDP-GlcNAc的合成则由GlmS、GlmM及双功能GlmU逐步催化完成。最终，糖基转移酶KfiA与KfiC分别识别UDP-GlcNAc与UDP-GlcA并延伸heparosan链。
目前临床广泛使用的肝素仍依赖从牛肺或猪肠中提取，动物源肝素引发的免疫反应与跨物种污染问题推动了肝素合成生物学研究的发展。本研究旨在通过代谢工程改造EcN，系统优化前体供给与聚合效率，构建高效的heparosan细胞工厂。
研究方法
2.1 质粒与菌株
本研究所用菌株与质粒列于补充表1与补充表2。大肠杆菌JM109用作DNA克隆宿主，EcN用于构建产heparosan的重组菌株。引物列于补充表3。UDP前体途径基因包括galU（编码葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶）、kfiD（编码UDP-葡萄糖6-脱氢酶）、glmS（编码L-谷氨酰胺-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶）、glmM（编码磷酸葡萄糖胺变位酶）及glmU（编码双功能N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶/氨基葡萄糖-1-磷酸乙酰转移酶），分别从大肠杆菌MG1655（ec）、枯草芽孢杆菌168（bs）、兽疫链球菌WSH-24（se）、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032（cg）及恶臭假单胞菌KT2440（pt）基因组中扩增获得，并已在前期研究中构建至质粒pEC-XK99E[32]。扩增基因分别加前缀“ec”“bs”“se”“cg”“pt”以标示物种来源。
由于pEC-XK99E为穿梭质粒，使用引物pEC-XK99E-F/pEC-XK99E-R从质粒pEC-XK99E中删除repA复制子，所得质粒命名为pERCS。用于pERCS中不同基因片段组合的引物列于补充表3。重组质粒经纯化后转化至EcN感受态细胞。
为构建质粒pETRSF1030，使用引物RSF1030-F/RSF1030-R从质粒pRSFDuet-1扩增RSF1030复制子序列，克隆至pETDuet-1中替换ColE1复制子。此外，以该质粒为模板，使用设计引物tac-F/tac-R通过PCR生成含tac启动子的线性化质粒pETRSF1030-tac。携带5′与3′端同源臂的PCR产物转化至大肠杆菌JM109，获得环化质粒pETRSF1030-tac。为构建质粒pETRSF1030-tac-kfiA-kfiC，使用补充表3所列引物从EcN基因组扩增kfiA与kfiC基因。扩增产物通过TEDA法[33]与线性化质粒pETRSF1030-tac连接，产物5′端含重叠序列。最终，重组质粒pETRSF1030-tac-kfiA-kfiC通过电转化（200 Ω，18 kV/cm，25 μF，脉冲时间4.8 ms）转入EcN-pERCS-bsgalU-eckfiD-ecglmM，并以卡那霉素与氨苄青霉素抗性筛选。
【数据】菌株：E. coli JM109、EcN；质粒：pEC-XK99E、pERCS、pETRSF1030-tac；电转参数：200 Ω，18 kV/cm，25 μF，脉冲4.8 ms；抗生素：卡那霉素50 μg/mL，氨苄青霉素100 μg/mL
2.2 培养基与培养条件
LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）用于常规克隆操作。补料分批发酵的种子培养采用TB培养基（pH 7.0，12 g/L胰蛋白胨、24 g/L酵母提取物、4 mL甘油、17 mM KH2PO4、72 mM K2HPO4），添加5.0 g/L葡萄糖。Heparosan生产采用葡萄糖限定培养基（pH 7.0，含20 g/L葡萄糖、0.1 g/L硫胺素、13.5 g/L KH2PO4、4.0 g/L (NH4)2HPO4、1.4 g/L MgSO4·7H2O、1.7 g/L柠檬酸及10.0 mL微量元素溶液（每升5 M HCl中含10.0 g/L FeSO4·7H2O、2.0 g/L CaCl2、2.2 g/L ZnSO4·7H2O、0.5 g/L MnSO4·4H2O、1.0 g/L CuSO4·5H2O、0.1 g/L (NH4)6Mo7O24·4H2O、0.02 g/L Na2B4O7·10H2O），另补加6 g/L酵母提取物与4 g/L胰蛋白胨[34]。必要时添加抗生素：卡那霉素50 μg/mL、氨苄青霉素100 μg/mL。IPTG终浓度0.2 mM用于诱导质粒携带基因表达。
重组菌株在LB培养基中37℃、220 rpm培养10 h制备种子液，随后转接至含25 mL葡萄糖限定培养基的250 mL摇瓶（初始OD600为0.1），37℃培养至OD600达0.6。随后加入IPTG，37℃继续培养24 h至葡萄糖耗尽。整个培养过程通过添加NaOH（2 M）将pH维持在7左右。葡萄糖浓度使用M-100生物传感器分析仪（深圳西尔曼科技）检测。
补料分批发酵在3-L生物反应器（T&J-Dtype，上海迪必尔生物工程有限公司）中进行。一级种子液在LB培养基中37℃、220 rpm培养8 h。二级种子液将一级种子液接种至TB培养基，37℃、220 rpm培养10 h。二级种子液接种至含1.35 L葡萄糖限定培养基（pH 7.0，补加20 g/L葡萄糖）的发酵罐中。温度控制在37℃，pH以29% NH4OH（v/v）维持在7.0。通气速率设为0.5 L/min，搅拌转速300–1000 rpm，维持溶解氧（DO）为空气饱和值的30%。当OD600达到18时，添加0.2 mM IPTG诱导heparosan合成。3-L补料分批发酵中，补料液含600 g/L葡萄糖、6.02 g/L MgSO4·7H2O、1 mL 100 g/L硫胺素、6 g/L酵母提取物及4 g/L胰蛋白胨，采用pH-stat方式补料[35]。发酵过程中，根据实时葡萄糖消耗动态补加60%（m/v）葡萄糖，使葡萄糖浓度维持在2 g/L至3 g/L之间。
【数据】LB培养基：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl；TB培养基：pH 7.0，12 g/L胰蛋白胨、24 g/L酵母提取物、4 mL甘油、17 mM KH2PO4、72 mM K2HPO4，5.0 g/L葡萄糖；葡萄糖限定培养基：20 g/L葡萄糖、0.1 g/L硫胺素、13.5 g/L KH2PO4、4.0 g/L (NH4)2HPO4、1.4 g/L MgSO4·7H2O、1.7 g/L柠檬酸；IPTG：0.2 mM；温度：37℃；转速：220 rpm（摇瓶）/300–1000 rpm（发酵罐）；时间：10 h（种子）/24 h（摇瓶培养）；pH：7.0；DO：30%；OD600诱导点：18
2.3 细胞生长测定与heparosan纯化
重组菌株的生长通过OD600监测，实时葡萄糖浓度由M-100生物传感器分析仪（深圳西尔曼科技）测定。Heparosan的纯化按前期描述的方法进行[32]。发酵上清液经12,000 ×g离心15 min收集，与四倍体积乙醇在−20℃混合4 h。上清液与水不溶性组分通过12,000 ×g离心8 min分离。沉淀置于25℃直至残余乙醇挥发，溶于去离子水后离心去除不溶性组分。沉淀过程重复三次以提高heparosan纯度。
【数据】离心：12,000 ×g，15 min；乙醇沉淀：4倍体积，−20℃，4 h；二次离心：12,000 ×g，8 min；干燥温度：25℃；沉淀重复次数：3次
2.4 Heparosan浓度测定
Heparosan浓度采用糖醛酸咔唑反应测定[36]。简要步骤：纯化heparosan（1 mL）加入硫酸试剂溶液（5 mL）于试管中，沸水浴孵育10 min。冰上冷却后，加入250 μL咔唑试剂（0.125%，w/v），沸水浴孵育15 min。最后记录530 nm波长处的吸光度，以葡萄糖醛酸为标准品建立校准曲线计算heparosan浓度。以heparosan合成缺陷菌株（EcN ΔkfiABC）的上清液作为空白对照。
【数据】样品量：1 mL；硫酸试剂：5 mL；沸水浴：10 min；咔唑试剂：250 μL，0.125%（w/v）；沸水浴：15 min；检测波长：530 nm；标准品：葡萄糖醛酸；空白对照：EcN ΔkfiABC上清
2.5 Heparosan化学结构分析
采用Waters Quattro Premier XE质谱仪（Micromass，曼彻斯特，英国）[37]与Bruker 600 MHz NMR波谱仪（Bruker，德国）[14,38]分析heparosan二糖。不同二糖的HPLC分离采用XSelect CSH C18色谱柱（130 Å，1.7 µm，2.1 mm × 50 mm；Waters），柱温40℃，流动相A（10 mM乙酸铵）与B（乙腈）。洗脱液在负离子模式下监测m/z 20–1500质量范围的总离子流，数据由Mass Lynx软件（4.1版，ScN870；Waters）处理。二十毫克纯化heparosan溶于0.55 mL D2O（99.96%，Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯），转移至标准5 mm NMR管。所有谱图在25℃下记录，数据使用MestReNova软件处理。
【数据】质谱仪：Waters Quattro Premier XE；NMR：Bruker 600 MHz；色谱柱：XSelect CSH C18（130 Å，1.7 µm，2.1 mm × 50 mm）；柱温：40℃；流动相：A=10 mM乙酸铵，B=乙腈；检测范围：m/z 20–1500；样品量：20 mg；溶剂：0.55 mL D2O（99.96%）；谱图温度：25℃
2.6 Heparosan分子量测定
采用高效液相色谱-体积排阻色谱（HPLC-SEC），色谱柱为Ultrahyfrogel™（300 mm × 7.8 mm内径，Waters Corp）。
【数据】色谱柱：Ultrahyfrogel™（300 mm × 7.8 mm内径）；方法：HPLC-SEC
研究结果
3.1 优化UDP-GlcA生物合成以提高heparosan产量
为构建高效的heparosan生物合成细胞工厂，首先聚焦EcN中UDP-GlcA前体的生物合成途径。葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶（GalU）与UDP-葡萄糖6-脱氢酶（KfiD）是以葡萄糖为底物合成UDP-GlcA的两个关键酶[40,41]。GalU是大肠杆菌CPS生物合成所必需的[42]；KfiD催化UDP-葡萄糖氧化为UDP-GlcA，该反应被普遍认为是heparosan生物合成途径中的限速步骤[40]。已有报道指出，在乳酸乳球菌中过表达GalU使UDP-糖水平提高8倍[43]，在枯草芽孢杆菌中过表达KfiD显著提高了软骨素与heparosan的产量[17]。
为提高UDP-GlcA的通量，将来源于大肠杆菌MG1655、枯草芽孢杆菌168、兽疫链球菌、谷氨酸棒杆菌及恶臭假单胞菌的GalU与KfiD编码基因分别过表达，考察其对heparosan合成的影响（图2A）。
如图2B所示，单独过表达bsgalU3（枯草芽孢杆菌168）、segalU1（兽疫链球菌）与cggalU（谷氨酸棒杆菌）显著提高了heparosan产量（分别为0.34 g/L、0.30 g/L与0.32 g/L）。此外，过表达bsgalU2（枯草芽孢杆菌168）与segalU2（兽疫链球菌）仅将heparosan产量提高至0.21 g/L与0.20 g/L。相比之下，引入来自大肠杆菌MG1655（ecgalU）、枯草芽孢杆菌168（bsgalU1）及恶臭假单胞菌（ptgalU）的其他GalU酶均未能改善heparosan合成。
对于限速酶UDP-葡萄糖6-脱氢酶，研究发现当过表达eckfiD（大肠杆菌MG1655）、bskfiD（枯草芽孢杆菌168）、cgkfiD1、cgkfiD2（谷氨酸棒杆菌）或ptkfiD（恶臭假单胞菌）时，heparosan产量从0.15 g/L（图2B）分别提高至0.39 g/L、0.29 g/L、0.37 g/L、0.30 g/L与0.32 g/L（图2C）。相比之下，bsGalU3与ecKfiD在EcN中表现出最佳的heparosan产量提升效果。二糖heparosan的化学结构通过HPLC-MS/MS及1H NMR、13C NMR分析表征（补充图2）。负离子扫描模式下观察到m/z 378.10 [M-H]-峰，代表heparosan二糖[Δ4,5-GlcA-O-GlcNAc]-（补充图2A与B）。1H与13C谱的质子信号（补充图2C与D）与此前发表的heparosan谱图一致[14,17]。
【数据】对照产量：0.15 g/L；bsgalU3过表达：0.34 g/L；segalU1过表达：0.30 g/L；cggalU过表达：0.32 g/L；bsgalU2过表达：0.21 g/L；segalU2过表达：0.20 g/L；eckfiD过表达：0.39 g/L；bskfiD过表达：0.29 g/L；cgkfiD1过表达：0.37 g/L；cgkfiD2过表达：0.30 g/L；ptkfiD过表达：0.32 g/L；质谱峰：m/z 378.10 [M-H]-
3.2 优化UDP-GlcNAc生物合成以提高heparosan产量
除UDP-GlcA外，UDP-GlcNAc是heparosan的另一前体，其从果糖-6-磷酸合成涉及GlmS（L-谷氨酰胺-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶）、GlmM（磷酸葡萄糖胺变位酶）与GlmU（N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶/氨基葡萄糖-1-磷酸乙酰转移酶）（图1）[40]。
为提高UDP-GlcNAc的通量，将上述五种来源的glmS、glmM与glmU扩增并导入EcN，考察其对heparosan产量的影响（图3）。显然，单独过表达所有GlmS、GlmM与GlmU均增强了heparosan生物合成。当过表达seglmS（兽疫链球菌）、ecglmM（大肠杆菌MG1655）与ecglmU（大肠杆菌MG1655）时，heparosan产量从0.15 g/L分别提高至0.26 g/L（图3B）、0.37 g/L（图3C）与0.30 g/L（图3D）。
【数据】seglmS过表达：0.26 g/L；ecglmM过表达：0.37 g/L；ecglmU过表达：0.30 g/L；对照：0.15 g/L
3.3 协同优化UDP-GlcA与UDP-GlcNAc生物合成以提高heparosan产量
在分别考察UDP-GlcA与UDP-GlcNAc生物合成对heparosan产量影响的基础上，同时优化UDP-GlcA与UDP-GlcNAc的前体库。为此，构建了14株含不同途径基因组合的重组菌株（图4，补充表S1）。
不同基因组合赋予的heparosan产量如图4B所示。共过表达bsgalU、eckfiD与ecglmM的菌株EC038在摇瓶培养中产生最高浓度的heparosan（0.80 g/L）。相反，在UDP-GlcA途径中共过表达bsgalU与eckfiD的菌株EC302仅产生0.33 g/L heparosan。类似地，在UDP-GlcNAc生物合成途径中，ecglmM与ecglmU（EC036）及seglmS与ecglmM-ecglmU（EC041）的基因组合仅分别赋予heparosan合成0.13 g/L与0.21 g/L的产量（图4B）。结果表明，更高水平的前体UDP-GlcA与UDP-GlcNAc供给更有利于heparosan聚合。
【数据】EC038（bsgalU+eckfiD+ecglmM）：0.80 g/L；EC302（bsgalU+eckfiD）：0.33 g/L；EC036（ecglmM+ecglmU）：0.13 g/L；EC041（seglmS+ecglmM+ecglmU）：0.21 g/L
3.4 上调heparosan合成酶以加速heparosan聚合
在提高前体UDP-GlcA与UDP-GlcNAc生物合成后，染色体编码的heparosan合成酶可能无法及时聚合这些UDP-糖。因此，将heparosan合成酶编码基因kfiA与kfiC导入EC038，构建重组菌株EC046（补充表1）。然而，heparosan的产量仅从0.80 g/L提高至0.89 g/L（图5B）。
为保证KfiA与KfiC的高效协调表达，在KfiC（EC047）或KfiA（EC048）的核糖体结合位点上游插入翻译增强子（TTTGTTTAACTTTAAG）（补充图4）[44]（图5A）。有趣的是，KfiA表达水平更高的重组菌株EC048产生了1.29 g/L的heparosan，为EC038的1.61倍。
【数据】EC046（+kfiA+kfiC）：0.89 g/L；EC048（KfiA增强表达）：1.29 g/L，为EC038的1.61倍；翻译增强子序列：TTTGTTTAACTTTAAG
3.5 Heparosan分子量随途径工程波动
除heparosan产量外，还通过HPLC-SEC-RI分析了工程重组菌株产生的heparosan分子量与多分散指数（Ip，Ip = Mw/Mn，Mw为重量平均分子量，Mn为数均分子量）。表2显示了菌株EC001、EC006、EC011、EC019、EC022、EC027、EC038与EC048产生的heparosan的重量平均分子量（Mw）、数均分子量（Mn）与Ip。相比之下，在UDP-GlcNAc途径中较低的heparosan浓度导致较低的Ip，而在UDP-GlcA途径中则产生相反效果。EC019、EC022与EC027合成的heparosan显示出比EC001更小的Mn值。通过过表达heparosan合成途径酶可获得不同的Ip（1.27–2.78）。EC038合成的heparosan分子量明显大于EC001，Mw从312.39 kDa提高至410.84 kDa，Mn从199.18 kDa提高至258.04 kDa。重组菌株EC048产生的heparosan具有最大的Mw（624.52 ± 7.90 kDa）与Mn（335.44 ± 10.10 kDa），分别为EC038的1.52倍与1.30倍。值得注意的是，重组菌株EC048在较高heparosan浓度下实现了更高的Mw，且Mw为624.52 kDa的heparosan片段的Ip仅为1.86，表明粒径分布较窄。上述结果表明，过表达KfiAC提高了heparosan产量，且Mw/Mn越高，分子量分布越宽。
【数据】EC001：Mw 312.39 kDa，Mn 199.18 kDa；EC038：Mw 410.84 kDa，Mn 258.04 kDa；EC048：Mw 624.52 ± 7.90 kDa，Mn 335.44 ± 10.10 kDa，为EC038的1.52倍（Mw）与1.30倍（Mn）；Ip范围：1.27–2.78；EC048的Ip：1.86
3.6 Heparosan补料分批发酵
接下来评估了工程菌株EC048在补料分批培养中的heparosan生产能力。使用20%（v/v）种子接种量以缩短延滞期。在补料分批发酵中，碳源葡萄糖维持在2 g/L至3 g/L的低浓度范围。Heparosan产量从0 h至24 h迅速增加至5.07 g/L，最高干细胞重量（DCW）在48 h达到125 g/L。当生物量达到最大积累时，DO降至最低水平10%（图6）。
在发酵过程中，heparosan的积累与细胞生长紧密偶联。最终，最大heparosan产量在72 h达到11.50 g/L，葡萄糖转化为heparosan的转化率为25.5 mg/g。
【数据】接种量：20%（v/v）；24 h产量：5.07 g/L；最高DCW：125 g/L（48 h）；最低DO：10%；最大产量：11.50 g/L（72 h）；葡萄糖转化率：25.5 mg/g
讨论与解读
本研究将生物安全的EcN开发为高效生产heparosan的微生物细胞工厂，系统优化了UDP-GlcA与UDP-GlcNAc两种前体的供给与聚合。与谷氨酸棒杆菌及枯草芽孢杆菌中透明质酸和软骨素生物合成的已有研究一致，UDP-葡萄糖6-脱氢酶是UDP-GlcA合成的限速酶[17,32,45]。本研究发现kfiD编码的UDP-葡萄糖6-脱氢酶对EcN中UDP-GlcA及heparosan合成同样关键（图2C）。此外，过表达ecGlmM将heparosan产量提高至0.37 g/L（图3C），表明催化氨基葡萄糖-6-磷酸异构化为氨基葡萄糖-1-磷酸的GlmM也是UDP-GlcNAc生物合成的关键酶。
尽管单独上调UDP-GlcA与UDP-GlcNAc途径的其他酶均对heparosan产量产生了明显效果（图2与图3），但共表达或组合表达却产生了截然不同的结果。有趣的是，GalU与KfiD的共过表达对UDP-GlcA及heparosan合成至关重要。在优化UDP-GlcA通量的基础上，单独表达UDP-GlcNAc途径中的GlmM对heparosan合成最大化最为有利。相反，进一步上调GlmU则显著降低了heparosan产量。
【编译者解读】本研究展示了"安全菌株+系统代谢工程"策略在复杂多糖合成中的可行性。值得注意的是，作者对五个物种的同源酶进行了系统筛选，而非仅依赖模式菌株的直觉选择——bsGalU与ecKfiD的组合优势说明同源酶的跨物种筛选仍是途径优化的高效手段。翻译增强子的巧妙应用提示，在多基因共表达体系中，各基因表达水平的精细匹配有时比简单叠加更关键。不足之处在于，分子量分布随途径工程波动（Ip 1.27–2.78）的机制尚不清楚，这可能是后续精细调控产品质量的重要切入点。
参考来源
Hu S. Engineering the probiotic bacterium Escherichia coli Nissle 1917 as an efficient cell factory for heparosan biosynthesis. Enzyme and Microbial Technology, 2022. DOI: 10.1016/j.enzmictec.2022.110038
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2022.110038