来源：Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for redox-assisted co-fermentation of l-rhamnose（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
大型绿藻（Ulva）暴发形成的"绿潮"造成沿海环境与经济双重压力，但其富含的L-鼠李糖却是工业酵母无法利用的碳源。本研究通过CRISPR-Cas9将真菌来源的L-鼠李糖转运蛋白及完整分解代谢途径整合至酿酒酵母基因组，并借助木糖共底物缓解氧化型代谢途径带来的NADH失衡，实现了10 g/L L-鼠李糖与40 g/L木糖的同步共消耗。研究还发现木糖还原酶可混杂催化L-鼠李糖中间产物生成1,2-丙二醇，并通过己糖激酶突变解除葡萄糖抑制，最终实现葡萄糖与L-鼠李糖的同步发酵。
研究背景
大型海藻因高碳水化合物含量、快速生长且不含木质素，被视为有前景的可再生生物质原料。其中Ulva属藻类可爆发性增殖形成"绿潮"，其细胞壁含ulvan、纤维素和淀粉，水解液中含有L-鼠李糖、糖醛酸、木糖和葡萄糖。然而，工业酿酒酵母无法天然代谢L-鼠李糖，限制了以酵母为基础的Ulva混合糖生物转化。在真菌中，L-鼠李糖通过非磷酸化氧化途径分解为丙酮酸和L-乳醛。本研究旨在将来源于毕赤酵母（Pichia stipitis）和黑曲霉（Aspergillus niger）的L-鼠李糖代谢模块引入酿酒酵母，并解决氧化途径带来的还原力平衡问题。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
酿酒酵母D452-2作为构建L-鼠李糖利用菌株的亲本菌株。此前构建的YE9菌株（可发酵D-半乳糖醛酸、L-阿拉伯糖和木糖）作为L-鼠李糖与木糖混合糖发酵的背景菌株。由于YE9含有额外的异源糖利用模块，所有涉及DY30的混合糖比较均以YE9作为匹配对照。本研究所用重组酿酒酵母菌株和质粒均列于补充数据中。酵母菌株在30°C的YPD培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨和20 g/L葡萄糖）中培养。酵母转化后筛选时，YPD琼脂在灭菌冷却后添加G418硫酸盐（300 μg/mL）和/或潮霉素B（300 μg/mL）。大肠杆菌TOP10用于质粒扩增，在37°C的LB培养基（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨和10 g/L NaCl）中培养，添加氨苄青霉素（100 μg/mL；LBA）或卡那霉素（50 μg/mL；LBK）。
【数据】酵母培养基：YPD（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）；温度：30°C；大肠杆菌培养基：LB；温度：37°C；G418浓度：300 μg/mL；潮霉素B浓度：300 μg/mL；氨苄青霉素：100 μg/mL；卡那霉素：50 μg/mL
2.2 基于Cas9的基因组编辑构建菌株
所有酵母菌株均使用此前描述的CRISPR-Cas9系统构建。供体DNA片段使用补充数据中列出的引物进行PCR扩增，设计带有30–50 bp重叠同源臂，以实现体内组装和通过同源重组进行基因组整合。表达盒骨架（int#1::PCCW12-cg#1-TCYC1、int#1::PCCW12-cg#1-TADH2、int#6::PTDH3-cg#1-TTDH3、int#1::PFBA1-cg#1-TFBA1和int#1::PTEF1-cg#1-TTEF1）通过将来自酿酒酵母D452-2基因组的PCR扩增供体DNA片段整合到指定基因间区域（int#1、int#6或int#7）进行组装。例如，用引物Kim209/Kim210和Kim211/Kim212扩增的PCCW12和TCYC1片段在体内组装，在基因间区域#1（int#1）处生成PCCW12-cg#1-TCYC1。
为构建异源L-鼠李糖利用模块，将AnrhtA（来自黑曲霉CBS120.49的L-鼠李糖转运蛋白；本研究新测序并提交至GenBank，登录号OR779977）以及来自P. stipitis CBS 6054的PsRHA1（XM_001386397.1）、PsLRA2（XM_001386594.1）、PsLRA3（XM_001386396.1）、PsLRA4（XM_001386595.1）和PsALD5（XP_001382347.1）分别用引物对Kim847/Kim848、Kim726/Kim727、Kim750/Kim751、Kim728/Kim729、Kim730/Kim731和Kim732/Kim733进行PCR扩增并测序验证。这些基因被插入D452-2或YE9菌株中相应表达盒骨架的cg#1位点，分别生成DY29和DY30。通过菌落PCR确认正确组装和整合。酵母转化按前述方法进行。三种己糖激酶突变（mGLK1 A265G、mHXK1 T916C和mHXK2 1364ΔC）按此前报道引入YE9和DY30，分别获得DY22和DY31。
【数据】同源臂长度：30–50 bp；整合位点：int#1、int#6、int#7；AnrhtA GenBank登录号：OR779977；基因来源菌株：A. niger CBS120.49、P. stipitis CBS 6054；突变位点：mGLK1 A265G、mHXK1 T916C、mHXK2 1364ΔC
2.3 摇瓶发酵
酵母细胞在YPD培养基中于30°C、250 rpm预培养24小时，离心收集（3,134 × g，4°C，5分钟），用蒸馏水洗涤。初始细胞浓度调至OD600 = 1.0（OD600 = 1.0相当于0.5 g干细胞/L）。细胞接种于含10 g/L L-鼠李糖单独或含10或40 g/L L-鼠李糖与40 g/L葡萄糖或木糖混合糖的YP培养基中。发酵在30°C、130 rpm条件下进行，使用无挡板50 mL锥形瓶，装液量10 mL，以创造限氧条件。
【数据】预培养：YPD、30°C、250 rpm、24 h；离心：3,134 × g、4°C、5 min；初始OD600：1.0（= 0.5 g DCW/L）；L-鼠李糖浓度：10或40 g/L；共底物浓度：40 g/L葡萄糖或木糖；发酵温度：30°C；转速：130 rpm；装液量：10 mL/50 mL瓶
2.4 酶活测定
所有酵母细胞在YPD肉汤中培养至指数期，离心收集（15,928 × g，4°C，1分钟）。洗涤后的细胞（1.0 × 10⁸个）悬浮于1 mL Y-PER™酵母蛋白提取试剂（Thermo Scientific）中，用匀浆器破碎。细胞碎片通过离心去除（15,928 × g，4°C，5分钟），澄清上清液作为粗提物用于酶活测定。蛋白质浓度使用BCA蛋白测定试剂盒（Pierce Biotechnology）测定。L-乳醛还原酶活性在含50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）、100 mM L-乳醛、2 mM NADH或NADPH及细胞提取物的反应混合物中测定。通过监测340 nm处吸光度跟踪NAD(P)H氧化。1单位（1 U）L-乳醛还原酶活性定义为每分钟氧化1 μmol NAD(P)H。
【数据】破碎试剂：Y-PER™（1 mL/1.0 × 10⁸细胞）；离心：15,928 × g、4°C、5 min；反应缓冲液：50 mM Tris-HCl（pH 7.5）；L-乳醛浓度：100 mM；NAD(P)H浓度：2 mM；检测波长：340 nm；酶活单位定义：1 U = 1 μmol NAD(P)H/min
2.5 胞内NADH/NAD⁺和NADPH/NADP⁺比率分析
使用EnzyChrom NADPH/NADP⁺测定试剂盒和NAD⁺/NADH测定试剂盒（BioAssay Systems）分别定量胞内NADPH/NADP⁺和NADH/NAD⁺水平。工程菌DY30在含10 g/L L-鼠李糖或40 g/L木糖与10 g/L L-鼠李糖混合物的YP培养基中培养。细胞以初始OD600 = 0.1接种，培养至OD600 = 1.0时收集。细胞沉淀重悬于100 μL相应提取缓冲液中，60°C孵育5分钟。随后加入20 μL测定缓冲液和100 μL互补提取缓冲液。样品以18,407 × g离心5分钟，取40 μL澄清上清液转移至新孔中，与80 μL反应试剂混合。反应混合物在室温孵育30分钟，随后用Synergy H1酶标仪（BioTek Instruments）在565 nm处测定吸光度。胞内NADPH/NADP⁺和NADH/NAD⁺比率基于线性外标校准曲线，使用方程(ΔAbs565-b0)/b1计算，其中b0为空白吸光度，b1为标准曲线斜率。
【数据】初始OD600：0.1；收菌OD600：1.0；提取条件：60°C、5 min；离心：18,407 × g、5 min；检测波长：565 nm；孵育：室温、30 min；校准方程：(ΔAbs565-b0)/b1
2.6 HPLC分析
胞外代谢物（葡萄糖、木糖、L-鼠李糖、木糖醇、甘油、L-乳酸、1,2-丙二醇和乙醇）通过高效液相色谱（HPLC；Agilent 1260系列）定量，配备示差折光检测器和Rezex ROA-Organic Acid H⁺（8%）色谱柱（150 mm × 4.6 mm；Phenomenex Inc.）。色谱柱以0.005 N H₂SO₄为流动相，流速0.6 mL/min，柱温50°C。
【数据】色谱柱：Rezex ROA-Organic Acid H⁺（8%），150 mm × 4.6 mm；流动相：0.005 N H₂SO₄；流速：0.6 mL/min；柱温：50°C
2.7 GC/MS分析
代谢物衍生化参照此前方法稍作修改。真空干燥的上清液加入10 μL盐酸甲氧胺吡啶溶液（40 mg/mL；Sigma-Aldrich），30°C处理90分钟，随后加入40 μL N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（Sigma-Aldrich），37°C处理30分钟。GC/MS分析使用Agilent 6890气相色谱仪，配备Agilent 5973质量选择检测器（MSD）和RTX-5Sil MS色谱柱（30 m × 0.25 mm，膜厚0.25 μm；Restek）。1 μL样品以分流模式（51:1）进样，氦气为载气（1.0 mL/min）。柱温箱程序：50°C保持1分钟，以20°C/min升至330°C，330°C保持5分钟。离子源和传输线温度分别设为250°C和290°C。电离能量70 eV，检测器以扫描模式运行，质量范围m/z 50–550。
【数据】衍生化：10 μL甲氧胺盐酸盐（40 mg/mL吡啶）、30°C、90 min；40 μL MSTFA、37°C、30 min；色谱柱：RTX-5Sil MS（30 m × 0.25 mm，0.25 μm膜厚）；进样量：1 μL；分流比：51:1；载气：He，1.0 mL/min；升温程序：50°C（1 min）→20°C/min→330°C（5 min）；离子源：250°C；传输线：290°C；电离：70 eV；扫描范围：m/z 50–550
2.8 基本通量模式（EFM）分析
为从计算角度评估木糖作为共底物对L-鼠李糖代谢的影响，进行了基本通量模式（EFM）分析（原文节选至此，后续细节原文未详述）。
【数据】分析方法：EFM（基本通量模式）；分析目的：评估木糖共底物对L-鼠李糖代谢的影响
研究结果
3.1 酿酒酵母中异源真菌L-鼠李糖途径的构建
氧化型、非磷酸化的L-鼠李糖分解代谢途径已在毕赤酵母中得到表征。该途径将L-鼠李糖转化为丙酮酸和L-乳醛，L-乳醛随后可被氧化为L-乳酸。为在酿酒酵母中重建该途径，利用Cas9辅助的体内组装策略，将L-鼠李糖转运蛋白（来自黑曲霉的AnrhtA）以及五个P. stipitis途径基因（PsRHA1、PsLRA2、PsLRA3、PsLRA4和PsALD5）整合到酿酒酵母D452-2背景中，生成菌株DY29。
为确定哪些异源组分是L-鼠李糖利用所必需的，构建了缺失单个途径组分的菌株（ΔrhtA、Δrha1、Δlra2、Δlra3、Δlra4和Δald5），并在仅添加L-鼠李糖的YP培养基中进行评估。DY29和Δald5菌株表现出有限的生长，消耗约1.5 g/L L-鼠李糖，而野生型菌株（D452-2）以及缺失转运蛋白或任一上游途径酶的菌株（ΔrhtA、Δrha1、Δlra2、Δlra3和Δlra4）在这些条件下均无生长（图2）。值得注意的是，Δald5菌株表现出明显的菌落间差异。缺失AnrhtA的菌株不生长，与酿酒酵母极低的天然L-鼠李糖摄取能力一致，表明转运蛋白表达是将L-鼠李糖引入异源途径的先决条件。同样，缺失任一途径酶均不生长，表明内源活性不足以补偿缺失步骤；特别是，尽管第二个中间产物（L-鼠李糖酸-1,4-内酯）可被内源内酯酶活性水解，但这种天然活性似乎不足以在缺乏异源酶组的情况下支持途径通量达到生长所需水平。Δald5菌株残留但高度可变的生长与L-乳醛（一种有毒中间产物）的胞内积累以及跨菌落的不完全/异质解毒作用一致。这些发现支持以下结论：酿酒酵母中可测量的L-鼠李糖同化需要异源转运蛋白和完整重建的途径酶组。
【数据】L-鼠李糖消耗量：~1.5 g/L（DY29和Δald5，48 h）；生长表现：DY29和Δald5有限生长；D452-2、ΔrhtA、Δrha1、Δlra2、Δlra3、Δlra4无生长
3.2 工程酵母的木糖辅助L-鼠李糖利用
当L-鼠李糖作为唯一外加糖时，DY29菌株仅表现出有限的底物利用，L-鼠李糖消耗在约12小时后停滞。在氧化型真菌L-鼠李糖途径中，L-鼠李糖转化为丙酮酸和L-乳醛，同时产生还原当量。虽然丙酮酸来源的乙醛还原为乙醇有助于NADH再氧化，但L-乳醛氧化为L-乳酸会产生额外的NADH，导致净氧化还原失衡，可能在限氧条件下限制途径通量。由于仅L-鼠李糖条件下L-鼠李糖消耗有限，无法对仅L-鼠李糖与混合底物发酵之间的产物谱进行定量比较。因此，研究聚焦于引入氧化还原互补的共底物是否能改善L-鼠李糖利用。
为确定部分引入木糖代谢能否缓解这一限制，将XYL1引入DY29。然而，单独表达XYL1并未改善L-鼠李糖利用，表明单独表达XYL1不足，功能性木糖代谢可能是支持氧化还原再平衡所必需的。基于这一结果，将L-鼠李糖分解代谢途径引入能利用木糖的YE9菌株，生成DY30，并以YE9和DY30分别为对照菌株和工程菌株评估L-鼠李糖/木糖共发酵。
对照菌株在36小时内完全消耗40 g/L木糖，但无法利用L-鼠李糖。相比之下，工程菌株DY30在36小时内同步消耗完40 g/L木糖和10 g/L L-鼠李糖，乙醇滴度较对照菌株提高1.2倍（13.7 g/L），同时积累L-乳酸（0.74 g/L）（图3）。由于DY30较YE9额外消耗了10 g/L L-鼠李糖，乙醇滴度的增加应被解读为混合底物发酵的结果，而非乙醇得率改善的直接证据。
尽管木糖和L-鼠李糖被高效共消耗，DY30的细胞生长较对照菌株降低（图3c）。为进一步考察木糖代谢是否影响胞内氧化还原状态，在仅L-鼠李糖和木糖/L-鼠李糖混合条件下培养了DY30，并测定其NADH/NAD⁺和NADPH/NADP⁺比率（图3f）。共发酵期间，NADH/NAD⁺比率显著低于仅L-鼠李糖培养时的水平，而两种条件下NADPH/NADP⁺比率无显著差异。这些结果表明，木糖共发酵主要与NADH/NAD⁺氧化还原状态的调节相关，而非NADPH/NADP⁺比率。尽管仅L-鼠李糖条件下有限的L-鼠李糖消耗阻碍了基于产物的定量氧化还原比较，但上述结果表明木糖共发酵主要通过增强NADH再氧化促进L-鼠李糖利用。进一步的代谢通量分析将有助于验证该模型，相关实验已列入未来工作计划。
DY30对L-鼠李糖和木糖的同步消耗表明，共底物利用可部分缓解氧化型L-鼠李糖分解代谢相关的氧化还原限制。类似策略已被用于解决D-半乳糖醛酸发酵中的氧化还原失衡——木糖被选为有效共底物，D-半乳糖醛酸的利用持续至木糖耗尽。在两种情况下，共发酵可能为NADH再氧化提供了额外的代谢灵活性，从而维持了原本受氧化还原限制的途径通量。其他氧化还原平衡方法，如异源表达NADH氧化酶（noxE），也已被证明能增强NADH周转并改善底物利用。
尽管木糖和L-鼠李糖被共消耗，DY30的细胞生长较对照菌株降低。这表明木糖代谢支持但并未完全解决与L-鼠李糖分解代谢相关的胞内应激，可能是因为有毒中间产物（如L-乳醛）的积累和/或碳源及还原当量向副产物分流，下文将对此进行讨论。
【数据】木糖消耗：40 g/L（36 h内完全消耗）；L-鼠李糖消耗：10 g/L（36 h内完全消耗，DY30）；乙醇滴度：13.7 g/L（DY30，较对照高1.2倍）；L-乳酸积累：0.74 g/L；细胞生长：DY30较对照降低；NADH/NAD⁺比率：共发酵条件下显著低于仅L-鼠李糖条件；NADPH/NADP⁺比率：两条件间无显著差异
3.3 木糖还原酶促进L-乳醛生成1,2-丙二醇
在10 g/L L-鼠李糖和40 g/L木糖共发酵期间，DY30出现一个显著的额外HPLC峰（保留时间8.806分钟），而对照菌株在相同条件下未出现该峰（图4a）。GC/MS分析将该化合物鉴定为1,2-丙二醇（图4b）。定量分析显示，在10 g/L L-鼠李糖和40 g/L木糖完全消耗后，DY30在48小时产生2.5 g/L 1,2-丙二醇和0.9 g/L L-乳酸，对应表观得率分别为0.25和0.09 g/g L-鼠李糖。相比之下，对照菌株中未检测到1,2-丙二醇和L-乳酸。由于L-乳醛是L-鼠李糖分解代谢过程中产生的关键中间产物，可被异源醛脱氢酶PsAld5氧化为L-乳酸，研究进一步考察了L-乳醛是否可能被还原为1,2-丙二醇。
【数据】额外HPLC峰保留时间：8.806 min（仅DY30）；1,2-丙二醇产量：2.5 g/L（48 h）；L-乳酸产量：0.9 g/L（48 h）；1,2-丙二醇表观得率：0.25 g/g L-鼠李糖；L-乳酸表观得率：0.09 g/g L-鼠李糖；对照菌株：未检测到1,2-丙二醇和L-乳酸
3.4 1,2-丙二醇形成的酶学与计算分析（基于原文节选内容）
（原文节选在此处中断，以下内容基于可获得的原文信息进行翻译。）
研究进一步通过酶活测定和基本通量模式（EFM）分析对1,2-丙二醇的形成机制进行了探究。EFM分析在厌氧条件下预测了不同底物条件下可行的生物质和乙醇得率分布（图5a），并展示了木糖/L-鼠李糖混合利用时所有可行的通量模式（图5b）。
【数据】分析方法：酶活测定、EFM分析；预测内容：生物质和乙醇得率分布（木糖、L-鼠李糖及混合底物条件）
3.5 葡萄糖与L-鼠李糖的共发酵
在10 g/L L-鼠李糖和40 g/L葡萄糖共发酵条件下，DY30表现出（原文节选在此处中断，以下基于可获得信息翻译）。为解除葡萄糖抑制，通过己糖激酶突变（mGLK1 A265G、mHXK1 T916C和mHXK2 1364ΔC）构建了DY31菌株（DY30 mGLK1-mHXK1-mHXK2）。DY30和DY31在含10 g/L L-鼠李糖和40 g/L葡萄糖的YP培养基中、限氧条件（130 rpm）、初始生物量0.5 g DCW/L下培养。DY31表现出改善的L-鼠李糖与葡萄糖共利用能力（图6）。
【数据】培养基：YP + 10 g/L L-鼠李糖 + 40 g/L葡萄糖；转速：130 rpm；初始生物量：0.5 g DCW/L；菌株：DY30（对照）与DY31（DY30 mGLK1-mHXK1-mHXK2）
讨论与解读
本研究通过Cas9介导的基因组整合，在酿酒酵母中建立了功能性异源L-鼠李糖利用模块。遗传解析表明，转运蛋白表达加上完整途径酶组是实现生长和可测量L-鼠李糖消耗所必需的。由于氧化型L-鼠李糖分解代谢在限氧条件下造成净NADH负担，将L-鼠李糖利用与木糖代谢耦合，可在木糖/L-鼠李糖共发酵期间实现10 g/L L-鼠李糖的同步完全消耗，并在混合糖发酵中获得更高的乙醇滴度。研究进一步鉴定出1,2-丙二醇作为发酵副产物，可能通过PsXR相关和/或内源还原酶对L-乳醛的还原形成。最后，通过己糖激酶突变解除葡萄糖抑制，实现了葡萄糖与L-鼠李糖的共发酵，并提高了生长和产物形成。据作者所知，这是首篇证明工程酿酒酵母在木糖/L-鼠李糖混合糖共发酵中实现高效L-鼠李糖消耗的报道。
编译者解读
该研究在菌株设计上体现了"氧化还原感知"的工程思维——没有简单堆砌异源途径，而是识别出氧化型L-鼠李糖途径的NADH净生成瓶颈，并巧妙利用木糖代谢作为还原力汇。1,2-丙二醇的意外发现提示，异源途径中间产物可能被宿主内源酶混杂转化，这在代谢工程中既是副产物损失风险，也可能成为新的产物分支点。以绿藻水解液为目标的底物谱扩展策略，对海洋生物质 valorization 具有实际价值。局限在于仅L-鼠李糖条件下的低消耗量仍待解决，未来若能在单一底物条件下实现高效利用，将进一步提升该平台的应用灵活性。
参考来源
Jeong, D. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for redox-assisted co-fermentation of l-rhamnose. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135138
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135138