来源：Layered modification for enhancing O-Succinyl-L-homoserine biosynthesis with a non-auxotrophic probiotic Escherichia coli Nissle 1917（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
O-琥珀酰-L-高丝氨酸（OSH）是合成L-蛋氨酸、γ-丁内酯、1,4-丁二醇等平台化学品的关键前体，在医药、饲料、农业和食品领域应用前景广阔。本研究以野生型益生菌大肠杆菌Nissle 1917（EcN）为底盘菌株，通过模块化基因工程实现OSH生物合成途径的分层改造——敲除负调控基因、动态调控副产物合成、解除关键酶反馈抑制、弱化降解途径，并强化前体供给与NADPH辅因子再生。最终工程菌株OSH Y33在5-L生物反应器中44小时内产出80.79 ± 2.10 g/L的OSH，生产强度达1.84 g/L/h，为迄今报道的最高水平。
研究背景
OSH天然作为L-蛋氨酸生物合成的关键前体存在，可在O-琥珀酰-L-高丝氨酸（硫醇）裂解酶催化下与甲硫醇直接反应生成L-蛋氨酸及副产物琥珀酸。随着全球对L-蛋氨酸需求的持续攀升，利用细胞工厂生物合成OSH受到广泛关注。在大肠杆菌中，OSH由L-高丝氨酸经高丝氨酸O-琥珀酰转移酶（HST，由metA基因编码）催化合成，并可在胱硫醚-γ-合酶（CGS，由metB基因编码）作用下进一步代谢为L-蛋氨酸。因此，OSH合成途径的遗传改造可借鉴L-高丝氨酸与L-蛋氨酸的相关研究成果。本研究选择益生菌EcN作为底盘菌株，其生物安全性与生长速率相对其他大肠杆菌表达宿主具有优势。
研究方法
2.1 菌株与质粒
大肠杆菌DH5α用于pTarget质粒文库的构建。大肠杆菌Nissle 1917（EcN）作为OSH生产的初始宿主菌株。本研究所用全部菌株列于表1。具体而言，pTarget、pCas和pTrc99A质粒分别用于基因组编辑和基因表达。
【数据】菌株：E. coli DH5α、E. coli Nissle 1917；质粒：pTarget、pCas、pTrc99A
2.2 基因操作
采用CRISPR-Cas9系统进行基因组编辑，详细操作流程参照文献[24]进行。本研究所用引物列于补充材料表S1。
【数据】基因组编辑系统：CRISPR-Cas9；引物：见表S1（原文未详述具体序列）
2.3 摇瓶分批发酵
工程菌株在MS培养基中培养以生产OSH。MS培养基成分（每升）：30 g葡萄糖、16 g (NH₄)₂SO₄、2.5 g酵母提取物、2 g KH₂PO₄、0.5 g MgSO₄、12 g CaCO₃、10 mg FeSO₄·4H₂O、5 mg MnSO₄、2.5 mg ZnSO₄·7H₂O。摇瓶发酵在500 mL三角瓶中进行，装液量30 mL MS培养基，于30°C或37°C、180 rpm振荡培养48小时。需要时，在接种时向培养基中添加50 mg/L卡那霉素和2 mmol/L IPTG。
【数据】培养基：MS培养基；葡萄糖：30 g/L；温度：30°C或37°C；转速：180 rpm；时间：48h；卡那霉素：50 mg/L；IPTG：2 mmol/L；装液量：30 mL/500 mL摇瓶
2.4 5-L生物反应器补料分批发酵
采用5-L生物反应器（上海保兴生物设备工程有限公司，中国上海）进行OSH补料分批发酵，初始工作体积为2 L。补料分批发酵培养基成分（每升）：25 g葡萄糖、16 g (NH₄)₂SO₄、6 g酵母提取物、1 g KH₂PO₄、0.5 g MgSO₄、0.2 mmol琥珀酸、2 g甜菜碱、4 mg L-精氨酸、3 mg L-谷氨酸、10 mg FeSO₄·4H₂O、5 mg MnSO₄、2.5 mg ZnSO₄·7H₂O。此外，添加50 mg/L卡那霉素和2 mmol/L IPTG以确保质粒的稳定维持与表达。发酵前期温度维持在37°C，中后期调整为30°C。发酵过程中用50%氨水将pH维持在6.8 ± 0.2。通过调节通气量与搅拌速率将溶氧水平维持在20%左右。补料分批发酵采用pH-stat补料策略，补料培养基成分（每升）：500 g葡萄糖、12.5 g KH₂PO₄、8 g (NH₄)₂SO₄、5 g酵母提取物、0.5 g MgSO₄、0.2 mmol琥珀酸和2 g甜菜碱。通过pH-stat补料策略将残余葡萄糖浓度控制在1.0 g/L以下。
【数据】反应器：5-L生物反应器；工作体积：2 L；温度：前期37°C，中后期30°C；pH：6.8 ± 0.2（50%氨水调节）；溶氧：约20%；补料策略：pH-stat；残余葡萄糖：<1.0 g/L；补料培养基葡萄糖浓度：500 g/L
2.5 RT-qPCR
使用Total RNA Isolation Kit从工程大肠杆菌菌株中提取总RNA。使用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（碧云天生物技术有限公司，中国上海）通过逆转录合成cDNA。选择16S rRNA作为内参基因进行归一化。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix在实时荧光定量PCR系统上定量转录水平。数据采用2^(-ΔΔCT)方法分析。RT-qPCR引物列于补充材料表S2。
【数据】RNA提取试剂盒：Total RNA Isolation Kit；逆转录试剂：HiScript II Q RT SuperMix；内参基因：16S rRNA；定量方法：2^(-ΔΔCT)；引物：见表S2
2.6 RBS强度表征
将携带eGFP报告基因的pTrc99A质粒转化至相应底盘菌株中，挑取单菌落接种于10 mL含50 mg/L卡那霉素的LB培养基中，于37°C培养12小时。随后按2%接种量转接至50 mL含50 mg/L卡那霉素的LB培养基中，于37°C培养4小时，然后用2 mmol/L IPTG在30°C下诱导8小时。收集1 mL培养物的细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.0）洗涤两次，重悬于1 mL PBS中。取200 μL重悬细胞，测定600 nm处光密度（OD₆₀₀）及488 nm激发/520 nm发射波长下的相对荧光单位（RFU）。RBS强度通过计算RFU/OD₆₀₀值进行量化。RBS强度表征引物列于补充材料表S3。
【数据】诱导条件：2 mmol/L IPTG，30°C，8h；检测波长：激发488 nm/发射520 nm；RBS强度计算：RFU/OD₆₀₀；引物：见表S3
2.7 分析方法
通过测量600 nm处吸光度（OD₆₀₀）监测细胞生长，1个OD₆₀₀单位相当于0.33 g/L大肠杆菌细胞干重。残余葡萄糖浓度采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定[25]。OSH和L-高丝氨酸产量通过高效液相色谱（HPLC）测定，使用C18色谱柱（4.6×250 mm，5 μm，Welchrom®Vantage C18），采用邻苯二甲醛（OPA）柱前衍生化法。NADPH/NADP⁺比值采用WST-8法测定[26]。具体而言，按照试剂盒说明书步骤获得上清液，在450 nm处测定其吸光度。参照标准曲线计算NADP⁺和NADPH的总量。为测定NADPH含量，将提取液在60°C加热30分钟以分解NADP⁺，随后按照相应说明书进行测定。
【数据】OD₆₀₀与细胞干重换算：1 OD₆₀₀ = 0.33 g/L；葡萄糖测定：DNS法；OSH/L-高丝氨酸测定：HPLC-OPA柱前衍生化，C18柱（4.6×250 mm，5 μm）；NADPH/NADP⁺测定：WST-8法，检测波长450 nm；NADP⁺分解条件：60°C，30 min
研究结果
3.1 基于EcN构建OSH生产底盘菌株
野生型EcN不具备积累OSH的能力，因此首先通过以下策略构建OSH生产的底盘菌株：敲除负调控基因、动态调控副产物合成、解除关键酶的反馈抑制以及弱化降解途径。在EcN的代谢途径中，L-蛋氨酸的过量积累可导致蛋白质毒性，并可能扰乱tRNA负载的稳态[27]。已有报道指出，敲除编码大肠杆菌蛋氨酸MetD吸收转运系统的metI基因，可显著降低菌株对胞外蛋氨酸的吸收效率[28]。因此，首先在EcN中敲除metI基因以降低蛋氨酸引起的细胞毒性，获得菌株OSH Y1。
L-苏氨酸是与产物竞争碳源的一种必需氨基酸，因此对其合成途径进行动态调控是最为合适的方法。自调控启动子在细菌生长的延迟期和对数前期具有转录活性，但在对数后期和稳定期其转录强度下降[29]。利用这些启动子对L-苏氨酸分支途径进行下调。具体而言，将天然启动子P_thrB替换为自调控启动子P_fliC、P_flgC和P_fliA，获得菌株OSH Y2-OSH Y4。菌株OSH Y1-OSH Y4的发酵结果如图2A所示。结果表明，菌株OSH Y1-OSH Y3中未积累OSH或L-高丝氨酸，而整合P_fliA的菌株OSH Y4实现了0.99 ± 0.04 g/L的L-高丝氨酸产量，同时细胞生长几乎未受影响。这些发现共同表明，使用自调控启动子P_fliA进行动态调控是重新分配工程菌株代谢通量的有效策略。
高丝氨酸O-琥珀酰转移酶（HST，由metA基因编码）是OSH生物合成的关键酶，但其表达和活性受到负转录调控因子MetJ及终产物（包括L-蛋氨酸和S-腺苷甲硫氨酸）的严格调控[30]。为解除HST的反馈抑制，需要引入对抑制性产物不敏感的HST突变体。据报道，由metA Q64E和metA T242A基因编码的HST突变体具有减弱的反馈抑制[11]。因此，在菌株OSH Y4中分别表达metA Q64E、metA T242A和metA Q64E-T242A突变基因，构建菌株OSH Y5-OSH Y7（图2B）。图2B所示发酵结果表明，菌株OSH Y5和OSH Y6均积累L-高丝氨酸但未合成OSH。然而，携带metA Q64E-T242A突变基因的OSH Y7实现了2.35 ± 0.08 g/L的OSH产量且无L-高丝氨酸积累，同时OSH Y7的细胞生长从11.49增加至12.25（OD₆₀₀）。这说明组合突变有效缓解了HST的反馈抑制，从而显著提高了L-高丝氨酸向OSH的转化效率。该发现进一步表明，菌株的产品合成能力与早期细胞生长的积累之间存在正相关性。
由metB基因编码的胱硫醚-γ-合酶（CGS）可催化OSH转化为L-蛋氨酸。L-蛋氨酸也是细胞生长所必需的氨基酸，同样会与产物竞争碳源[31]。类似地，将菌株OSH Y7中的天然启动子P_metB分别替换为P_fliA、P_fliC和P_flgC（图2C），获得菌株OSH Y8-OSH Y10。此外，已有研究鉴定出两个改变CGS酶活性的定点突变，R106A和N148A突变体分别保留其催化活性的20%和50%[32]。因此，将菌株OSH Y7中的天然metB基因分别替换为metB R106A和metB N148A，获得菌株OSH Y11和OSH Y12（图2C）。图2C中菌株OSH Y9-OSH Y12的发酵结果均显示OSH产量较菌株OSH Y7有所提高。具体而言，整合P_flgC的OSH Y10和携带N148A突变体的OSH Y12的OSH产量分别增加了143.83%和201.28%，达到5.73 ± 0.19 g/L和7.08 ± 0.64 g/L。可以得出结论，这两种改造策略成功抑制了OSH的消耗。然而，这两种菌株的生物量略有下降，OD₆₀₀从12.25降至约10.80。这一现象可能与必需氨基酸（如L-蛋氨酸）生物合成的抑制以及营养供给受限有关。
MetJ是L-蛋氨酸合成的关键阻遏蛋白。它与S-腺苷甲硫氨酸结合后，抑制metL、metA和metB基因的表达[33]。本研究分别在OSH Y10和OSH Y12中敲除metJ基因，获得菌株OSH Y13和OSH Y14（图2D）。发酵结果如图2D所示。敲除metJ基因后，还通过RT-qPCR检测了thrA、metL和metA基因的转录水平，结果如图2E所示。删除metJ基因后，菌株OSH Y13的OSH产量可达7.50 ± 0.10 g/L，thrA、metL和metA基因的转录水平分别为OSH Y10中的4.9倍、9.1倍和4.4倍。此外，菌株OSH Y14的OSH产量达到7.69 ± 0.09 g/L，thrA、metL和metA基因的转录水平分别为OSH Y12中的3.5倍、11.3倍和1.9倍。这表明敲除metJ基因解除了对thrA、metL和metA的阻遏，使其转录水平升高，从而增加了前体L-高丝氨酸的供给。同时，更多的碳代谢通量被导向L-高丝氨酸合成途径，导致在生长早期积累了一些必需氨基酸（如L-苏氨酸）。因此，菌株的生物量也呈现显著提升。鉴于其更高的生产能力，OSH Y14被优先选作后续研究的底盘菌株。
【数据】OSH Y4：L-高丝氨酸 0.99 ± 0.04 g/L；OSH Y7：OSH 2.35 ± 0.08 g/L，OD₆₀₀从11.49增至12.25；OSH Y10：OSH 5.73 ± 0.19 g/L，较OSH Y7提高143.83%；OSH Y12：OSH 7.08 ± 0.64 g/L，较OSH Y7提高201.28%；OSH Y13：OSH 7.50 ± 0.10 g/L，thrA/metL/metA转录水平分别为OSH Y10的4.9/9.1/4.4倍；OSH Y14：OSH 7.69 ± 0.09 g/L，thrA/metL/metA转录水平分别为OSH Y12的3.5/11.3/1.9倍；CGS突变体催化活性：R106A保留20%，N148A保留50%
3.2 强化L-高丝氨酸生物合成途径
在EcN的代谢途径中，L-天冬氨酸通过天冬氨酸激酶（由metL、thrA和lysC基因编码）、天冬氨酸-半醛脱氢酶（由asd基因编码）和高丝氨酸脱氢酶（由metL和thrA基因编码）依次转化为L-高丝氨酸。据报道，高丝氨酸脱氢酶是L-高丝氨酸生物合成中的关键酶[8]。因此，在菌株OSH Y14的基础上，用trc启动子强化metL和thrA基因，构建菌株OSH Y15和OSH Y16（图3A），这两种菌株的发酵结果如图3B所示。结果表明，过表达metL基因后，OSH产量可略微提高至7.84 ± 0.60 g/L。然而，如果进一步过表达thrA基因，产量则降至7.44 ± 0.29 g/L。造成这一结果的原因可能是thrA基因编码的高丝氨酸脱氢酶受到苏氨酸和异亮氨酸的反馈抑制[8]。在后续研究中，将来源于谷氨酸棒状杆菌的抗反馈抑制高丝氨酸脱氢酶（由hom R398Q基因编码）分别引入菌株OSH Y15和OSH Y16的假基因位点（图3A），生成菌株OSH Y17和OSH Y18。如图3B所示，hom R398Q的引入使菌株OSH Y17的产量增加了5.61%，达到8.28 ± 0.60 g/L（原文此处截断，后续数据未完整呈现）。
【数据】OSH Y15：OSH 7.84 ± 0.60 g/L（过表达metL）；OSH Y16：OSH 7.44 ± 0.29 g/L（过表达thrA）；OSH Y17：OSH 8.28 ± 0.60 g/L（引入hom R398Q），较OSH Y15提高5.61%
3.3 关键节点PEP-OAA-ASP的RBS策略平衡调控
（原文此节内容在提供节选中不完整，以下根据已有信息忠实呈现可获取部分——原文未完整提供该节正文内容）
【数据】原文未详述
3.4 NADPH生成途径及其改造对OSH合成的影响
（原文此节内容在提供节选中不完整，以下根据已有信息忠实呈现可获取部分——原文未完整提供该节正文内容）
【数据】原文未详述
3.5 5-L生物反应器中菌株OSH Y33的补料分批发酵
（原文此节内容在提供节选中不完整，以下根据已有信息忠实呈现——原文结论部分提及OSH Y33在5-L生物反应器中的发酵结果）
【数据】菌株：OSH Y33；反应器：5-L生物反应器；OSH产量：80.79 ± 2.10 g/L；发酵时间：44 h；生产强度：1.84 g/L/h
讨论与解读
本研究选择益生菌EcN作为底盘菌株，其生物安全性与生长速率相对其他大肠杆菌表达宿主更具优势。采用动态调控启动子和起始密码子替换策略来调控必需氨基酸副产物的合成，构建了非营养缺陷型菌株，避免了传统基因敲除方法带来的生产成本增加和操作复杂性。经过发酵优化，本研究所构建的微生物细胞工厂在5-L生物反应器中实现了80.79 ± 2.10 g/L的OSH产量，并达到目前最高的1.84 g/L/h生产强度。该研究将OSH代谢途径划分为产物合成、前体供给和辅因子再生三个模块进行分别优化，并通过启动子替换、关键酶突变和RBS策略在转录和翻译水平上实施分层调控。
编译者解读
该研究的核心价值在于"分层改造"的系统性思维——将复杂的代谢网络拆解为产物合成、前体供给与辅因子再生三个模块逐一优化，这种模块化策略为其他非天然高产菌株的工程化改造提供了可复制的范式。选用益生菌EcN而非传统工业菌株，兼顾了生物安全性与生产性能，对食品级氨基酸及其衍生物的绿色制造具有直接的产业参考价值。值得注意的是，动态调控启动子替代传统基因敲除来削弱副产物途径，成功避免了营养缺陷型的生长代价，这一设计思路值得在其他生产体系中推广。然而，80.79 g/L的产量虽创下纪录，但摇瓶与5-L反应器之间的放大效应仍需更多菌株验证；此外，原文对RBS平衡调控及NADPH模块的部分数据呈现不完整，其具体贡献度尚待进一步评估。
参考来源
Niu K. Layered modification for enhancing O-Succinyl-L-homoserine biosynthesis with a non-auxotrophic probiotic Escherichia coli Nissle 1917. Biochemical Engineering Journal, 2025. DOI: 10.1016/j.bej.2025.109852
DOI: 10.1016/j.bej.2025.109852