来源：Cyanobacterial carbonic anhydrases drive carbon recycling and prodrug biosynthesis in Escherichia coli（Trends in Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
将蓝藻的二氧化碳浓缩机制移植到大肠杆菌中，是合成生物学实现低碳生物制造的前沿方向。本研究从蓝藻 Cyanobacterium aponinum 中筛选出三类碳酸酐酶（ccaA、ccmM、ccmN），与 RuBisCO–Prk 模块在大肠杆菌中构建了完整的 CO₂ 水合与固定耦合回路。通过系统进化分析、CRISPRi 基因抑制、CO₂ 释放定量及 5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）合成验证，研究证明该杂合系统能在限碳条件下增强碳回收效率。平台目前处于技术就绪水平 3（TRL 3），为后续放大验证奠定了基础。
研究背景
工程微生物细胞工厂（MCFs）是可持续生物制造的核心。大肠杆菌凭借生长快、代谢背景清晰、遗传操作工具成熟，已成为生产氨基酸、有机酸、生物燃料等高值化合物的常用宿主。近年来，通过异源表达光合微生物卡尔文–本森–巴塞姆循环中的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO，由 rbcLS 基因编码）和磷酸核酮糖激酶（Prk），大肠杆菌被逐步改造为可固定 CO₂ 的合成平台。Milo 团队曾通过整合 RuBisCO–Prk 模块并结合近一年的适应性实验室进化，成功获得完全自养生长的大肠杆菌菌株——这证明了该宿主作为合成自养底盘的潜力。然而，该策略耗时漫长且依赖反复突变，限制了其推广。本研究另辟蹊径，引入蓝藻羧酶体中的碳酸酐酶系统，旨在不依赖长期进化的前提下实现胞内 CO₂ 的高效回收，并将其与 5-ALA 等生物合成途径直接偶联。
研究方法
羧酶体相关基因的系统进化与操纵子结构分析
通过系统进化与操纵子水平的联合分析，考察了羧酶体相关基因的进化保守性与结构组织。系统进化树在 MEGA 11 软件中构建，使用核心羧酶体组分的串联蛋白比对。对于编码多个基因的 ccmKL，每个基因序列均单独纳入比对，以避免共有序列处理带来的偏差；这确保了 ccmKL 变异体间的序列多样性能够在聚类中得到体现。采用泊松校正模型估算氨基酸替换速率，并使用 1000 次重复的自展分析评估分支支持度与进化稳健性。所有被分析的 ccaA 序列均聚类于 β-CA 进化支 B 内，该进化支包含 Cyan 和 Cah 两个亚群，二者均以保守的 β-CA 基因为特征。为考察操纵子结构，从 NCBI GenBank 数据库检索了六株代表性蓝藻菌株中含羧酶体基因座的基因组区域：Gloeobacter violaceus（GenBank: NC_005125.1）、Cyanobacterium aponinum（CP003947）、Synechocystis sp. PCC 6803（NC_000911）、Synechococcus sp. PCC 7002（CP000951.1）、Synechococcus elongatus PCC 7942（CP130602.1）和 Anabaena sp. PCC 7108（NZ_KB235896.1）。每个操纵子均经注释以识别核心组分，包括 RuBisCO 亚基（rbcL、rbcS）、组装伴侣蛋白（rbcX）、碳酸酐酶（ccaA）以及结构蛋白（ccmM、ccmN、ccmK、ccmL）。构建操纵子示意图以突出跨物种的保守基因顺序与模块化特征。
【数据】软件：MEGA 11；自展重复：1000 次；进化模型：泊松校正；菌株数：6 株蓝藻；ccaA 序列一致性：66–78%
质粒构建与转化
基因序列、引物及质粒详见在线补充信息中的表 S1、S3 和 S4。使用 Taq 聚合酶和含限制性酶切位点的引物，通过 PCR（聚合酶链式反应）扩增目标启动子或目的基因，并克隆至选定载体。使用相同限制性酶切位点进行酶切后，载体与插入片段在 22°C 下连接 90 分钟。连接产物通过热激法转化至大肠杆菌 DH5α，条件为 42°C 处理 90 秒，随后在 LB（Luria Bertani）液体培养基中于 37°C、200 rpm 复苏 1 小时。重组菌落涂布于含相应抗生素的 LB 平板上过夜培养，并通过酶切验证。挑取阳性单菌落于 LB 培养基中预培养 12 小时，使用 FAVORGEN® 试剂盒（台湾）提取质粒。质粒再通过热激法转化至表达菌株。
【数据】连接温度：22°C；连接时间：90 min；热激：42°C、90 s；复苏：37°C、200 rpm、1 h；预培养：12 h；质粒提取试剂盒：FAVORGEN®
利用 CRISPRi 敲低 can 基因
为抑制大肠杆菌 BL21(DE3) 内源 can 基因表达，通过将 dCas9 整合至染色体建立了 CRISPRi 系统。dCas9 片段使用位点特异性重组策略插入 HK022 噬菌体附着位点，方法如前人所述 [47]。该菌株与携带 sgRNA 的质粒偶联，sgRNA 靶向 can 基因的启动子区域，从而实现 CRISPRi 介导的 can 基因敲低 [51]。
【数据】dCas9 整合位点：HK022 attB；靶标：can 基因启动子区；宿主：E. coli BL21(DE3)
培养条件
克隆实验和预培养使用 LB 培养基（Difco，美国），除非另有说明。2% 重组细胞接种于 4 ml LB 培养基（含相应抗生素：50 μg/ml 卡那霉素、100 μg/ml 氨苄青霉素或 25 μg/ml 氯霉素），于 37°C、200 rpm 过夜培养。限碳供应评估时，5% 接种量转接至 60 ml TAP 培养基中，使用 100 ml Photon Systems Instruments（PSI）培养装置，CO₂ 供应浓度分别为 0、0.5 和 1%，温度 30°C，流速 40 ml/min。TAP 培养基组成为：0.0375 g/l NH₄Cl、0.05 g/l CaCl₂·2H₂O、0.1 g/l MgSO₄·7H₂O、0.108 g/l K₂HPO₄、1 ml/l 冰醋酸、0.05 g/l EDTA 二钠盐、0.022 g/l ZnSO₄·7H₂O、0.0114 g/l HBO₃、5.1 mg/l MnCl₂·4H₂O、1.62 mg/l CoCl₂·6H₂O、1.6 mg/l CuSO₄·5H₂O、1.1 mg/l (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、5 mg/l FeSO₄·7H₂O、17 g/l KOH。此外，0 h 时加入 0.1 mM IPTG 诱导剂和相应抗生素。细胞生长通过 SpectraMax Mini（Molecular Devices，美国）监测 600 nm 处 OD600，并通过细胞干燥换算为生物量。重组菌株在设定温度和培养时间下生长。所有实验均设生物学和技术二重或三重重复。
【数据】预培养：LB、37°C、200 rpm、过夜；限碳培养：TAP 培养基、30°C、40 ml/min、CO₂ 0/0.5/1%；IPTG：0.1 mM；抗生素：50 μg/ml Kan / 100 μg/ml Amp / 25 μg/ml Cm；检测波长：OD600
CO₂ 释放系统的搭建与评估
建立了一个模块化系统，使用含 100 ml 密闭瓶的 M9 基础培养基培养体系，碳源分别为 4 g/l 的葡萄糖、木糖或甘油。限定培养基（M9）组成为：16 g/l NaH₂PO₄·7H₂O、3 g/l KH₂PO₄、2 g/l NH₄Cl、1 g/l MgSO₄、0.01 g/l MnSO₄。0 h 时加入 5% 接种量、0.1 mM IPTG 诱导剂和相应抗生素，于 30°C 持续搅拌培养。密闭瓶释放的 CO₂ 经气体管路导入含 10 ml NaOH（0.02 M）的另一管中。使用微电极 pH 计（InLab Micro，Mettler-Toledo，美国）在细胞培养 0 h 和 24 h 时记录 NaOH 溶液 pH 值，通过以下方程量化指示 CO₂ 吸收的酸碱变化 [50]：
pH + pOH = 14
pH = −log[H⁺] → [H⁺] = 10⁻ᵖᴴ mol/L
pOH = −log[OH⁻] → [OH⁻] = 10⁻ᵖᴼᴴ mol/L
[OH⁻] mol = [OH⁻] × 管初始体积
Δ[OH⁻] mol = [OH⁻]终 − [OH⁻]初
Δ[OH⁻] mol = ΔCO₂ mol
ΔCO₂ mol / 管终体积 L = mol/L × MW CO₂ = g/L
【数据】碳源：4 g/l 葡萄糖/木糖/甘油；培养基：M9；NaOH 浓度：0.02 M、10 ml；培养温度：30°C；pH 记录时间点：0 h、24 h；接种量：5%；IPTG：0.1 mM
体内前体药物 5-ALA 生产
使用添加 2 g/l 酵母提取物的改良限定培养基（即 MM9Y）生产 5-ALA。该培养基基于 M9 培养基，分别添加 10 或 20 g/l 葡萄糖，用于表达单一或三联 β-羧酶体 CA 的重组菌株。传代培养时使用 5% 接种量，培养过程中加入相应抗生素。直接空气捕获（DAC）条件（环境 CO₂，约 0.04%）下培养的细胞在含 30 ml M9C6 培养基的 100 ml 挡板摇瓶中生长，摇床转速 200 rpm。细胞生长通过 SpectraMax Mini（Molecular Devices，美国）监测 600 nm 处 OD600，并通过细胞干燥换算为生物量。当 OD600 达到 0.6 时，使用 0.1 mM IPTG 诱导，并添加共底物 1 g/l 琥珀酸盐、3 g/l 甘氨酸，以及辅因子 30 mM PLP 和 0.1 g/l 柠檬酸铁。重组菌株在设定温度和培养时间下培养 [21,36]。所有实验均设生物学和技术二重或三重重复。
【数据】培养基：MM9Y（M9 + 2 g/l 酵母提取物）；葡萄糖：10 或 20 g/l；接种量：5%；DAC 条件：环境 CO₂ ~0.04%；培养基体积：30 ml/100 ml 摇瓶；转速：200 rpm；诱导 OD600：0.6；IPTG：0.1 mM；共底物：1 g/l 琥珀酸盐、3 g/l 甘氨酸；辅因子：30 mM PLP、0.1 g/l 柠檬酸铁
SDS-PAGE 与 Western blot 蛋白分析
收获的细胞调整至所需浓度后，使用 OneShot®（Constant Systems，英国）在 30 kpsi 高压下进行机械裂解。可溶性蛋白取自细胞裂解液上清。蛋白表达通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS–PAGE）分析。蛋白样品在 SDS 上样缓冲液存在下于 100°C 变性 10 分钟，上样至 10%（w/v）SDS 聚丙烯酰胺凝胶。Western blot 分析中，蛋白样品经 SDS–PAGE 分离后，在 300 mA 条件下电转 1 小时至 PVDF 膜。膜在含 0.05% Tween-20 的 Tris 缓冲盐溶液（TBST）和 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）中室温轻柔振荡封闭 2 小时。His 标签蛋白使用一抗（anti-His 抗体，0.01% 于 TBST 中）孵育 2 小时检测，随后在相同条件下以二抗（0.01% 于 TBST 中）孵育 1 小时。信号显色使用 Western Lightning® ECL Pro 化学发光底物，膜成像使用 MultiGel-21 系统（EBL® Biotechnology，台湾）。
【数据】裂解压力：30 kpsi；变性条件：100°C、10 min；凝胶浓度：10%（w/v）；电转：300 mA、1 h；封闭：室温、2 h；一抗孵育：2 h；二抗孵育：1 h
CA 活性测定
CA 活性使用改良的 Wilbur-Anderson 测定法（WAU）测量。将 200 μl 可溶性蛋白样品与 9 ml 冰浴 Tris-HCl 缓冲液（20 mM，pH 8.3）在搅拌小瓶中混合。随后加入 6 ml 冰浴饱和 CO₂ 溶液，记录时间……
【数据】样品体积：200 μl；缓冲液：20 mM Tris-HCl、pH 8.3、9 ml；CO₂ 溶液：6 ml 饱和 CO₂
研究结果
β-羧酶体 CA 基因的进化与结构筛选
CA 在蓝藻 CO₂ 浓缩机制（CCM）中通过催化脱水反应发挥关键作用，从而富集胞内 CO₂ 水平以支持 RuBisCO 介导的碳固定。为进行异源表达，研究开展了定向筛选，重点关注具有高质量基因组注释和明确 β-羧酶体结构的菌株，包括 Gloeobacter violaceus（NC_005125.1）、Cyanobacterium aponinum（CP003947）、Synechocystis sp. PCC 6803（NC_000911）、Synechococcus sp. PCC 7002（CP000951.1）、Synechococcus elongatus PCC 7942（CP130602.1）和 Anabaena sp. PCC 7108（NZ_KB235896.1）。图2A 展示了六株蓝藻物种与 β-羧酶体区室之间的系统进化关系。一个保守的 ccaA 进化支被用于突出序列相似性，其范围为 66% 至 78%，表明 ccaA 在不同蓝藻谱系中具有功能稳健性。操纵子比较进一步揭示了关键 β-羧酶体基因的进化稳定性和保守模块化排列：rbcLSX（RuBisCO 基因簇）、ccaA（β-CA）、ccmM 和 ccmN（γ-CA 样支架蛋白）以及 ccmK 和 ccmL（壳蛋白）。为阐明机制意义，图2B 展示了 β-羧酶体的结构 [23,28,37]。壳主要由 ccmK 和 ccmL 组成，形成多面体边界以限制气体扩散，从而维持内部高 CO₂ 浓度。最小壳基因区室的存在表明，完全包封可能并非催化增强的严格必要条件。然而，支架蛋白（ccmM 和 ccmN）组织酶堆积和壳组装，将 CA 产生的 CO₂ 导向 RuBisCO 活性位点，同时限制其竞争的加氧酶反应。支架蛋白在无需完全封闭壳的前提下介导酶共定位，可能倾向于功能邻近性而非结构复杂性。这种构型可能反映了对 CO₂ 水平相对稳定或升高的环境的适应，在这些环境中，紧密包封对维持高局部 CO₂ 浓度的必要性较低 [33]。在代表性蓝藻中，C. aponinum 作为淡水蓝藻，因其能在高温、酸性 pH 和高 CO₂ 浓度下生长而受到碳减排策略的关注 [38,39]。三种 C. aponinum CA（以下简称 capoCA；图 S1，在线补充信息）的分子模型揭示了不同的催化环境。β-CA（ccaA）通过一个组氨酸和两个半胱氨酸残基配位锌离子，而 γ-CA 样蛋白（ccmM 和 ccmN）使用三个组氨酸 [40,41]。有趣的是，ccaA 和 ccmM 均显示出锌结合氢氧化物与 CO₂ 之间的短距离，这与高效亲核攻击和高催化潜力（k_cat/K_M）一致。相比之下，ccmN 将关键残基置于距底物更远的位置，表明其 CO₂ 水合活性较弱。这些比较为蓝藻 CA 的合理选择及在大肠杆菌中的进一步过表达提供了指导。
【数据】菌株数：6 株蓝藻；ccaA 序列一致性：66–78%；锌配位：ccaA（1 His + 2 Cys）、ccmM/ccmN（3 His）
工程大肠杆菌中 capoCA 催化性能与细胞适应性的关联
图3A 展示了表达 ccaA、ccmM 和 ccmN 的大肠杆菌 BL21(DE3)（即 BD，Ø）的生长曲线。图3B 为 SDS-PAGE 和 Western blot 分析结果。M、wc 和 s 分别表示蛋白分子量标准（kDa）、全细胞和可溶形式（裂解液）。CA 表达……
限碳条件下大肠杆菌中杂合 CO₂ 水合与固定系统的组装与表征
图4 展示了在限碳供应条件下，单个 capoCA（ccaA、ccmM 或 ccmN）在（A）BD、（B）dCA、（C）CBB 和（D）dCA+CBB 中的示意及生物量谱图。（E）从全细胞定量 CA 活性……
碳源与杂合 CO₂ 水合固定系统对大肠杆菌 CO₂ 释放效率的调控
图5A 展示了使用闭环装置的 CO₂ 释放测定示意。释放的气体通过气体管路导入碱性 NaOH 捕获阱，基于 pH 变化进行 CO₂ 捕获与定量。图5B 显示了……
讨论与解读
本研究将蓝藻来源的 β-CA（ccaA）和 γ-CA 样支架蛋白（ccmM、ccmN）与 RuBisCO–Prk 模块整合至大肠杆菌中，构建了一个不依赖完整羧酶体壳的杂合 CO₂ 回收平台。系统进化分析表明 ccaA 在蓝藻中高度保守（序列一致性 66–78%），而支架蛋白的共定位功能可在无壳条件下将 CO₂ 有效导向 RuBisCO。通过酶活测定、气体捕获定量和 5-ALA 合成验证，该平台在摇瓶尺度上实现了碳回收与产物合成的功能耦合。当前平台处于技术就绪水平 3，即实验室规模的概念验证。向 TRL 4–5 推进需解决副产物积累、拓展大肠杆菌以外的宿主适用性，并验证中试规模的稳健性。该策略为适应性实验室进化提供了互补替代方案，为气候适应性生物制造奠定了基础。
编译者解读：这项工作的巧妙之处在于"拆解"了蓝藻羧酶体——舍弃了完整的壳结构，仅保留 CA 与支架蛋白的功能核心，从而降低了异源表达的复杂度。将 CO₂ 水合（CA）与固定（RuBisCO–Prk）解耦联表达的策略值得借鉴，它保留了酶的底物可及性。不过，TRL 3 的现实意味着距离工业应用尚有距离——副产物积累和宿主普适性仍是硬约束。未来若能与动态调控元件或进化策略联用，或可加速该平台向规模化迈进。
DOI: 10.1016/j.tibtech.2026.04.020