来源：Engineering of Pseudomonas putida to produce medium-chain-length polyhydroxyalkanoate from crude glycerol（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
中链长度聚羟基脂肪酸酯（MCL-PHA）作为可完全生物降解的高分子材料，在弹性体、涂层及药物释放系统等领域应用前景广阔，但其生产成本长期制约产业化进程。本研究以恶臭假单胞菌EM42为底盘菌株，通过删除内源`phaC1ZC2`操纵子消除竞争与降解途径，结合质粒过表达`phaC2`与`phaG`、启动子筛选与UTR设计优化`acoA`表达、以及基于AlphaFold2与分子动力学模拟的PhaC2底物捕获效应解析与定点改造，系统提升了MCL-PHA合成能力。最终经补料分批发酵，以精制甘油为碳源获得34.9 g/L MCL-PHA（含量44.64 wt%），以粗甘油为唯一碳源更达49.5 g/L（含量45.41 wt%），为目前报道的以甘油为唯一碳源的重组恶臭假单胞菌最高产量。
研究背景
聚羟基脂肪酸酯（PHAs）是微生物合成的碳源与能量储存型可生物降解聚酯。按单体碳链长度可分为短链（SCL-PHA，C3–C5）、中链（MCL-PHA，C6–C14）与长链（LCL-PHA）三类。SCL-PHA由 Cupriavidus 等菌属产生，质脆、熔点高，适用于包装膜、地膜与医用缝线；MCL-PHA则由假单胞菌属等合成，柔韧性好、结晶度低，适用于可降解弹性体、涂层及药物释放系统。由于PHA可完全生物降解且能通过改性获得接近传统合成塑料的材料性能，其研发对缓解塑料污染与减少化石原料依赖具有战略意义。目前聚3-羟基丁酸酯[P(3HB)]及共聚物[P(3HB-co-3HV)]已有产业化应用，但MCL-PHA因产率低、成本高，商业化进程滞后。粗甘油作为生物柴油产业的副产物，价格低廉、供应充足，若能实现高效生物转化，将显著降低MCL-PHA生产成本。
研究方法
2.1 菌株与质粒构建
本研究所用菌株与质粒列于表S1。以大肠杆菌XL1-Blue作为常规基因克隆宿主，以Martínez-García等[34]开发的恶臭假单胞菌EM42作为MCL-PHA生产宿主菌株。PCR扩增使用C1000 Thermal Cycler（Bio-Rad，美国赫拉克勒斯）与PrimeSTAR HS聚合酶（Takara Bio Inc.，日本滋贺）。DNA连接采用T4 DNA连接酶（New England Biolabs，美国伊普斯威奇），按制造商说明书操作。连接产物通过电穿孔法（2.5 kV）导入大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞。电转后细胞在Luria–Bertani（LB）培养基中于37°C、230 rpm振荡复苏1小时，随后涂布于含相应抗生素的LB琼脂平板进行筛选。
`phaC2`与`phaG`基因克隆至pSEVA258载体。首先将带有优化5′非翻译区（UTR）序列的`phaC2`插入AvrII/SacI位点，获得pSEVA258_phaC2；随后将带有优化5′ UTR序列的`phaG`插入pSEVA258_phaC2的KpnI/XbaI位点，获得pSEVA258_phaC2phaG。pSEVA6214a-g系列质粒通过将pSEVA624的lacI与trc启动子元件替换为合成启动子BG28、BG35、BG37、BG51、BG17、BG25和BG42构建而成。各启动子以合成的双链寡核苷酸DNA（Macrogen，韩国首尔）插入pSEVA624的PacI/AvrII位点，获得pSEVA6214a-g[35]。这些构建体分别与来自恶臭假单胞菌的`acoA`基因配对，生成pSEVA6214a-g_acoA系列。标准欧洲载体架构（SEVA）质粒载体图谱见(https://seva-plasmids.com/)[36]。
采用pK19mobSacB质粒的卡那霉素抗性/蔗糖敏感性选择系统，通过同源重组从染色体删除`phaC1ZC2`基因簇[37]。为此，以全细胞沉淀为模板，PCR扩增恶臭假单胞菌染色体上`phaC1ZC2`上、下游各500 bp DNA序列。PCR片段经XbaI酶切后克隆至pK19mobSacB的XbaI位点，获得pK19mobSacB_phaC1ZC2（表S1）。该质粒经电穿孔（2.5 kV）转化恶臭假单胞菌感受态细胞，以卡那霉素筛选pK19mobSacB_phaC1ZC2整合菌株。重组细胞随后在含20%蔗糖的培养基中培养，进行SacB介导的反选择[37]。`phaC1ZC2`缺失通过PCR验证并经PCR产物测序确认。
【数据】电转电压：2.5 kV；复苏条件：37°C、230 rpm、1 h；同源臂长度：各500 bp；蔗糖浓度：20%；抗生素：卡那霉素
2.2 摇瓶培养与MCL-PHA生产
野生型与重组恶臭假单胞菌EM42首先在30°C的LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl）中培养。过夜培养后，将恶臭假单胞菌EM42细胞接种至含20 g/L甘油（唯一碳源）和10 mg/L硫胺素的25 mL或200 mL化学成分明确的MR培养基中，置于125 mL或1 L摇瓶。培养条件为30°C、200 rpm振荡[38]。MR培养基（pH 7.0）每升含：6.67 g KH₂PO₄、4 g (NH₄)₂HPO₄、0.8 g MgSO₄·7H₂O、0.8 g柠檬酸及5 mL痕量金属溶液。痕量金属溶液每升0.5 M HCl含：10 g FeSO₄·7H₂O、2 g CaCl₂、2.2 g ZnSO₄·7H₂O、0.5 g MnSO₄·4H₂O、1 g CuSO₄·5H₂O、0.1 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O及0.02 g Na₂B₄O₇·10H₂O。甘油（或粗甘油）与MgSO₄·7H₂O分别灭菌。培养重组恶臭假单胞菌EM42菌株时，向培养基中添加卡那霉素（50 mg/L）或庆大霉素（15 mg/L）。当光密度（OD₆₀₀）达到2.5时，添加3-甲基苯甲酸酯（0.15 mM）诱导xylS/Pm系统。粗甘油由生物柴油生产企业GS Caltex（韩国首尔）提供，使用前经0.2 μm聚偏氟乙烯（PVDF）膜过滤去除所有可见杂质。
【数据】LB培养基配方：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl；甘油浓度：20 g/L；硫胺素：10 mg/L；培养温度：30°C；转速：200 rpm；MR培养基pH：7.0；卡那霉素：50 mg/L；庆大霉素：15 mg/L；诱导剂3-甲基苯甲酸酯：0.15 mM；诱导时机：OD₆₀₀=2.5；过滤膜孔径：0.2 μm PVDF
2.3 同源基因表达系统的计算机模拟优化
包含核糖体结合位点（RBSs）的5′ UTR序列以计算机模拟方式生成，采用RBS计算器(https://salislab.net/software/predict_rbs_calculator)按服务器说明设定最大起始速率，以获得恶臭假单胞菌EM42的最优序列[39]。
【数据】工具：RBS计算器（Salis Lab）；优化目标：最大翻译起始速率
2.4 生物聚合物分析方法
MCL-PHA含量定量步骤如下：细胞以13,000 rpm离心10 min收集，所得细胞沉淀于105°C干燥箱中干燥超过2天至完全脱水。完全干燥的细胞沉淀经匀浆后分装为50–60 mg样品。按Jung和Lee[38]报道的方法进行甲醇解反应，将PHA转酯化为甲基-3-羟基链烷酸酯。随后用氯仿萃取甲基-3-羟基链烷酸酯，采用配备聚乙二醇毛细管柱（DB-WAX，30 m × 0.53 mm内径，1.00 μm膜厚；Agilent，美国圣克拉拉）的Shimadzu GC-2030气相色谱仪（Shimadzu，日本京都）进行分析。以甲基苯甲酸酯为内标。MCL-PHA含量（细胞干重wt%）定义为MCL-PHA浓度与细胞浓度之比。甲基-3-羟基己酸酯（C6）、3-羟基辛酸（C8）、3-羟基癸酸（C10）、3-羟基十二烷酸（C12）和3-羟基十四烷酸（C14）均购自Sigma-Aldrich（美国圣路易斯），用作定量与定性标准。
【数据】离心：13,000 rpm、10 min；干燥：105°C、>2天；样品量：50–60 mg；色谱柱：DB-WAX（30 m × 0.53 mm × 1.00 μm）；内标：甲基苯甲酸酯
2.5 分子对接与动力学计算模拟
恶臭假单胞菌EM42野生型PhaC2及其工程变体的全长结构使用ColabFold v1.5.2中实现的AlphaFold2进行计算机模拟预测[40,41]。在对接前，对AlphaFold2预测的PhaC2模型进行5 ns短时分子动力学（MD）模拟以松弛结构。受体对接以PhaC2的代表性低能MD模型（t = 4.50 ns时）为对象，使用AutoDock Tools 1.5.7进行。配体3HDCoA（PubChem CID 91825739）的三维构象生成与对接准备使用Open Babel 3.1.1完成[42,43]。AutoDock Vina 1.2.3用于搜索PhaC2与3HDCoA的前500个低能结合模式，3HDCoA搜索空间限定为覆盖PhaC2全蛋白的总体积1728 nm³[44,45]。模型根据3HDCoA硫酯碳与PhaC2保守催化三联体距离的目视检查进行筛选。选择模型5作为后续MD分析的初始结合构象。所有MD模拟使用配备全原子CHARMM 36力场与TIP3P水模型的GROMACS 2023进行[46–52]。3HDCoA的CHARMM参数使用CGenFF71或SwissParam计算[53]。目标蛋白在十二面体晶胞中溶剂化并施加周期性边界条件，在实际模拟前于300 K依次进行NVT与NPT系综平衡。电荷中性通过随蛋白一同溶剂化的Na⁺/Cl⁻离子维持。使用距离约束时，通过在力场中引入以目标原子间距离为中心的极大弹簧常数k = 5000 kJ mol⁻¹ nm⁻²的吸引谐波势项实现。所有原子模型使用UCSF ChimeraX 1.5可视化[54,55]。PhaC2 A477A478变体的初始坐标使用ChimeraX 1.5中的swapaa工具生成[54,55]。该工具使用Dunbrack 2010平滑主链依赖旋转异构体文库，在保持主链结构的同时预测点突变最可能的侧链构象。
【数据】MD松弛时间：5 ns；对接模型选取时间点：t=4.50 ns；搜索空间：1728 nm³；温度：300 K；力场：CHARMM 36；水模型：TIP3P；弹簧常数：k=5000 kJ mol⁻¹ nm⁻²；软件：AlphaFold2（ColabFold v1.5.2）、AutoDock Tools 1.5.7、AutoDock Vina 1.2.3、GROMACS 2023、Open Babel 3.1.1、UCSF ChimeraX 1.5
2.6 补料分批培养
补料分批培养按照以下方法进行——原文节选此处中断，后续步骤原文未详述。
【数据】原文未详述
研究结果
3.1 构建PHA非产生/非降解菌株
本研究聚焦恶臭假单胞菌中PHA生物合成与降解途径的关键酶。这些酶包括负责MCL-PHA产生的PHA合酶I（PhaC1；`phaC1`）与PHA合酶II（PhaC2；`phaC2`），以及负责将PHA酶促降解为单体的PHA解聚酶（PhaZ；`phaZ`）（图1A）[3]。
为减轻内源PhaC1、PhaZ和PhaC2对工程菌株PHA生产可能产生的干扰效应，利用pK19mobSacB质粒与SacB反选择方法将完整`phaC1ZC2`簇从恶臭假单胞菌染色体DNA中删除。该过程获得`phaC1ZC2`缺失菌株，命名为恶臭假单胞菌Δ`phaC1ZC2`。该工程菌株不产生PHA（图2A）。
【数据】菌株：恶臭假单胞菌ΔphaC1ZC2；PHA产量：0（不产生PHA）
3.2 同源PHA合成基因的表达
为构建高效的PHA生产菌株，将同源`phaC2`基因克隆至pSEVA258质粒，获得pSEVA258_phaC2（图S1A，表S1）。pSEVA258载体含有xylS/Pm表达系统——一种在恶臭假单胞菌中广泛应用的成熟诱导调控框架。此外，该载体具有RSF1010复制起点，拷贝数为130 ± 40，为恶臭假单胞菌中最高，可实现高表达水平[56]。
以甘油为唯一碳源进行摇瓶规模PHA生产评估。携带pSEVA258_phaC2的恶臭假单胞菌Δ`phaC1ZC2`过表达PhaC2后，在无任何营养限制条件下MCL-PHA含量达1.76%（w/w）（图2A，表1）。
采用代谢工程策略进一步提升MCL-PHA产量。将编码(R)-3-羟基酰基-ACP:CoA转酰基酶（PhaG）的`phaG`基因克隆至pSEVA258_phaC2，获得pSEVA258_phaC2phaG（图S1，表S1）。PhaG催化3-羟基酰基-ACP转化为3-羟基酰基-CoA，是MCL-PHA生物合成途径中的关键前体步骤（图1）。一个关键考量涉及中间代谢物3-羟基酰基-ACP——它是从头脂肪酸合成途径的组成部分。过表达PhaG对于重定向代谢流并促进该中间产物的外排是必要的。PhaG的5′ UTR序列使用RBS计算器优化，旨在最大化PhaG表达[39]。
氮、氧和磷限制常被用于促进微生物中PHA积累——如Cupriavidus necator和假单胞菌属野生型菌株只能在营养限制条件下大量产生PHA[57–62]。然而，通过基于质粒的PhaC2与PhaG过表达，恶臭假单胞菌Δ`phaC1ZC2`的MCL-PHA产量在60 h后显著增至18.27%（w/w），与单独表达PhaC2（1.76%，w/w）相比提高10.38倍，且无需任何营养限制（图2A，表1）。PhaG过表达还导致MCL-PHA单体摩尔组成发生显著变化——C12组分比例降低，C8与C10组分比例升高。Matsumoto等观察到类似现象[63]：在假单胞菌属61-3中过表达PhaG使总PHA中mcl-单体（C6–C12）整体组成增加，C12摩尔分数下降，C8和C10摩尔分数上升。Hoffmann等[64]证明，过表达铜绿假单胞菌的`phaG`基因可提高铜绿假单胞菌总PHA含量并改变其摩尔组成——C8摩尔组成从36.2%升至47.2%，C12从10%降至5.1%。随后Hoffmann等[65]指出，过表达食油假单胞菌的`phaG`基因使C8摩尔比从0%显著升至25%，C12摩尔组成从25%大幅降至6.1%。Hoffmann等[66]的进一步研究表明，恶臭假单胞菌PhaG对3-羟基酰基-CoA表现出体内底物特异性——C6为2.5%、C8为24.1%、C10为68.7%、C12为4.7%。基于本研究结果与既往发现，PhaG的底物特异性倾向于将C8和C10 3-羟基酰基-ACP转化为3-羟基酰基-CoA，而非将3-羟基十二烷酰基-ACP转化为3-羟基十二烷酰基-CoA，这促成了观察到的效应。这一显著增强凸显了PhaG在促进MCL-PHA生物合成中的关键作用，验证了其作为代谢工程核心靶点的重要性。
`acoA`基因（编码丙酮酸脱氢酶亚基A，AcoA）的过表达同样被实施。AcoA促进丙酮酸转化为乙酰-CoA——从头脂肪酸合成途径的基础前体（图1）。如既往研究所证实的，基因表达的定量调控显著影响目标产物的整体生产力[67–72]。这种调控可通过启动子[67–70]、RBS[71]或双顺反子系统[72]实现。鉴于丙酮酸作为基础代谢物——多种代谢途径的共同底物——的核心地位，战略性增强AcoA表达有望通过乙酰-CoA分支强化流向从头脂肪酸合成的代谢通量。本研究使用RBS计算器设计具有最高预测翻译速率的5′ UTR，具体使用5′-CATCGGATACCCGACGCGCCAACCACTCATAAGGAGGTATTTTT-3′序列。为优化`acoA`表达，开发了使用合成启动子的可调表达系统（图S1）。借鉴Zobel等[35]设计的涵盖不同转录水平的创新合成启动子，本研究寻求确定最有利的`acoA`表达强度。此外，精细调控`acoA`表达的理由源于丙酮酸介导的竞争途径复杂网络——过度的`acoA`表达可能破坏细胞稳态。
共表达`phaC2`、`phaG`与`acoA`的重组恶臭假单胞菌Δ`phaC1ZC2`菌株在125 mL摇瓶中培养72 h。随后的MCL-PHA产量评估提供了有力证据：具体而言，在BG35启动子调控下表达`acoA`（含pSEVA6214b）的菌株获得最高MCL-PHA积累量，达19.93%（w/w）（图2B）。Zobel等[35]此前报道，使用BG42启动子时绿色荧光蛋白表达量最大，其后依次为BG25、BG17、BG51、BG37、BG35和BG28。然而，基因表达水平必须针对不同基因进行优化。尽管BG35启动子最初被预测为弱表达，但本研究却获得最高MCL-PHA生产力。由此成功建立了通过启动子定量调控实现生产力优化的基因表达系统。`acoA`表达失衡导致PHA生产力下降，这强调了代谢通量平衡的重要性以及精细调控基因表达策略对实现理想结果的意义。与`phaG`过表达不同，`acoA`的表达不影响MCL-PHA的单体组成（表1）。值得注意的是，与`phaG`不同，`acoA`表达不影响3-羟基酰基-ACP链的延伸，其主要增强单体前体丙二酰-CoA的供应池。
【数据】PhaC2单独表达：MCL-PHA含量1.76%（w/w）；PhaC2+PhaG共表达：18.27%（w/w），60 h，提高10.38倍；PhaC2+PhaG+acoA（BG35启动子）：19.93%（w/w），72 h；pSEVA258拷贝数：130 ± 40；5′ UTR序列：5′-CATCGGATACCCGACGCGCCAACCACTCATAAGGAGGTATTTTT-3′；PhaG底物特异性：C6 2.5%、C8 24.1%、C10 68.7%、C12 4.7%
3.3 鉴定与改造PhaC2底物结合的结构瓶颈以提高MCL-PHA生产力
尽管MCL-PHA相关酶（PhaG和AcoA）的过表达大幅提高了MCL-PHA产量（如前节所述），本研究仍旨在通过直接改造关键聚合酶PhaC2来进一步提升MCL-PHA生产的动力学特性。该方法——原文节选在此中断，后续结果原文未详述。
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究通过组合代谢工程策略实现了以粗甘油为碳源的高水平MCL-PHA生产：优化关键基因过表达以补充MCL-PHA前体、对PhaC2进行酶工程改造以提升活性、并采用补料分批培养策略。最终工程菌株经补料分批发酵，以精制甘油为碳源生产34.9 g/L MCL-PHA，以粗甘油为碳源生产49.5 g/L MCL-PHA——这是目前以甘油为唯一碳源的重组恶臭假单胞菌菌株获得的最高MCL-PHA浓度。本研究是首个也是唯一基于MD模拟对PHA合酶II进行酶改良的研究，首次通过MD模拟识别PhaC2的底物捕获效应并成功解决该问题。研究结果不仅揭示了PhaC2的结构复杂性，还阐明了特定残基的功能意义。基于PhaC2工程与代谢途径工程改造的恶臭假单胞菌，可作为高水平MCL-PHA生产的有效宿主菌株，从廉价非脂肪酸碳源（即粗甘油）获得迄今报道的最高MCL-PHA滴度。使用经济高效的粗甘油作为碳源有助于降低工艺成本、推动MCL-PHA商业化，并为环保塑料的发展作出贡献。
【编译者解读】该研究以"前体供应—聚合酶改造—发酵工艺"三层策略系统解决了MCL-PHA生产成本高的核心瓶颈。将计算模拟（AlphaFold2+MD）引入PHA合酶工程并识别出底物捕获效应，是方法学上的亮点——从结构生物学视角为酶改造提供了精准靶点。49.5 g/L的产量数据在非脂肪酸碳源体系中具有显著竞争力。值得注意的是，粗甘油与精制甘油产量差异不大（49.5 vs 34.9 g/L），说明该菌株对工业级底物耐受性良好，具备放大潜力。但MD指导的酶工程是否具有普适性、粗甘油中杂质对长期发酵的影响等问题，仍有待后续研究验证。
参考来源
Hur, D. H. (2024). Engineering of Pseudomonas putida to produce medium-chain-length polyhydroxyalkanoate from crude glycerol. International Journal of Biological Macromolecules. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2024.136411
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2024.136411