来源：Antimicrobial peptide SCY2 with its interacting proteins Scyreprocin mediate the innate immune defense of Scylla paramamosain against Pseudomonas putida infection（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）是一种可在拟穴青蟹（Scylla paramamosain）睾丸中定殖的机会致病菌。本研究揭示，雄性青蟹生殖道来源的两种互作抗菌肽SCY2与Scyreprocin具有双重免疫功能：在雄性体内介导系统性先天免疫，在交配后转移至雌性体内建立生殖免疫。重组肽注射可使感染雄蟹存活率提升40–50%，而抗体阻断两种肽后，受感染雌蟹96小时内存活率骤降至仅5–10%。该发现首次将雄性免疫能力与物种繁殖成功直接关联。
研究背景
拟穴青蟹是分布于印度-太平洋海域的重要经济甲壳类，在中国、泰国、马来西亚等国备受青睐。2022年，中国该物种海水养殖面积约24,170公顷，年产量超过154,000吨。其生命周期复杂，交配时精子储存于雄性射精管并转移至雌性纳精囊暂存。随着养殖密度增加，细菌性病原快速增殖常导致急性死亡和重大经济损失。目前防控主要依赖抗生素和化学药物，但耐药性问题日益突出。本研究团队此前从青蟹睾丸中分离到恶臭假单胞菌，并发现其诱导两种性腺抗菌肽SCY2与Scyreprocin表达上调。本文进一步探究这两种肽在雄蟹和雌蟹中的免疫防御功能。
研究方法
2.1 动物采集与驯化
健康成年拟穴青蟹（250 g ± 10 g）采集自中国福建省漳州市沿海渔场。实验前，青蟹在充气盐水（盐度12‰）水泥池中驯化2–3天，水温维持25–27 °C。为减少操作应激并确保人道处理，采样前将青蟹置于冰浴中麻醉1分钟。
【数据】体重：250 g ± 10 g；盐度：12‰；温度：25–27 °C；驯化时间：2–3天；麻醉：冰浴1 min
2.2 菌株制备与攻毒实验
用于感染的恶臭假单胞菌菌株（ATCC 12633）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），在假单胞菌CFC选择性培养基（Hope Bio-Technology Co., Ltd.）上28 °C培养48小时。注射用菌液通过将第二代CFC平板上的菌落悬浮于0.85%生理盐水中制备。测定600 nm处光密度（OD600）估算细菌浓度，通过系列稀释涂板定量菌落形成单位（CFU）。向青蟹（n = 10）注射不同浓度细菌以测定半数致死剂量（LD50），操作遵循EUCAST指南（https://www.eucast.org）。所有感染实验均按照厦门大学机构生物安全规程执行。
【数据】菌株：P. putida ATCC 12633；培养基：CFC选择性培养基；培养温度：28°C；培养时间：48h；注射体积：原文未详述；动物数：n = 10
2.3 细菌载量测定
雄蟹在第三步足基部注射致死剂量恶臭假单胞菌（每只2 × 10⁷ CFU）。对照组注射生理盐水。感染后3、6、12、24、48小时时间点解剖青蟹，收集肝胰腺、胸神经节、中肠、心脏、血淋巴细胞、鳃、睾丸和射精管。血淋巴细胞用预冷抗凝缓冲液分离[34]，4 °C下500 ×g离心5分钟，重悬。固体组织（0.1 g）在1 mL PBS中匀浆。血淋巴细胞悬液和组织匀浆进行十倍系列稀释后涂布于CFC培养基。28 °C孵育24小时后计数菌落，通过16S rRNA基因扩增和测序（Sangon Biotech, China）确认细菌身份。每板菌落数在20–200 CFU之间视为有效。
【数据】攻毒剂量：2 × 10⁷ CFU/只；时间点：3、6、12、24、48h；离心：500 ×g，4°C，5min；组织量：0.1 g；匀浆体积：1 mL PBS；培养：28°C，24h；有效计数范围：20–200 CFU/板
2.4 组织病理学检查
恶臭假单胞菌感染的雄蟹（n = 10）和健康对照（n = 3）的组织在4%多聚甲醛中固定过夜，经脱水、石蜡包埋后切成10 μm切片。切片置于正电荷玻片上，苏木精-伊红（H&E）染色，使用AxioScan.Z1玻片扫描仪（Carl Zeiss AG, Germany）分析。
【数据】固定液：4%多聚甲醛；固定时间：过夜；切片厚度：10 μm；染色：H&E；动物数：感染组n = 10，对照组n = 3
2.5 重组蛋白表达纯化与抗体制备
重组SCY2（rSCY2）和重组Scyreprocin（rScyreprocin）按照基于先前研究的优化方案[37,38]进行表达和纯化。重组蛋白使用HisTrap FF crude柱在ÄKTA Pure™系统（GE Healthcare Life Sciences, USA）上纯化。SCY2和Scyreprocin的多克隆抗体在厦门大学实验动物中心于兔和小鼠中制备。抗体效价通过ELISA评估，蛋白浓度使用BCA法（Beyotime, China）测定。
【数据】纯化系统：ÄKTA Pure™；层析柱：HisTrap FF crude；抗体宿主：兔和小鼠；蛋白定量：BCA法
2.6 qPCR和Western blotting分析
使用TRIzol（AG, China）从雄蟹组织中提取总RNA，按制造商说明书进行cDNA合成。定量实时PCR（qPCR）使用SYBR Green Master Mix（Vazyme, China）在CFX Opus 384系统（Bio-Rad, USA）上进行。引物序列列于补充表S1–S3。spGAPDH作为SCY2和Scyreprocin表达的参考基因，spef1α用于免疫相关基因。表达水平采用2^–ΔΔCt方法计算[39]。Western blotting中，雄蟹睾丸和射精管组织在低温条件下解剖，于预冷RIPA裂解缓冲液（Solarbio, China）中匀浆。裂解液12,000 ×g离心15分钟（4 °C），收集上清用BCA蛋白定量试剂盒（Beyotime, China）定量。等量蛋白（每泳道20 μg）经SDS–PAGE分离并转移至PVDF膜。膜与小鼠多克隆抗SCY2或兔多克隆抗Scyreprocin抗体（1:5000）作为一抗孵育，随后与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的山羊抗小鼠IgG（H + L）或山羊抗兔IgG（H + L）二抗（1:10000；Thermo Fisher Scientific, USA）孵育。β-actin（Transgen Biotech, China的抗β-actin小鼠单克隆抗体）作为上样对照。蛋白条带使用化学发光成像系统（Tanon, China）可视化并用配套软件分析。
【数据】qPCR系统：CFX Opus 384；内参基因：spGAPDH（SCY2/Scyreprocin）、spef1α（免疫基因）；定量方法：2^–ΔΔCt；离心：12,000 ×g，4°C，15min；蛋白上样量：20 μg/泳道；一抗稀释度：1:5000；二抗稀释度：1:10000
2.7 氧化与抗氧化指标检测
肝胰腺组织按试剂盒说明书进行匀浆和处理。使用商业检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定过氧化物酶（POD）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）、碱性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）的活性。
【数据】检测指标：POD、T-SOD、MDA、AKP、ACP；试剂盒来源：南京建成生物工程研究所
2.8 SCY2和Scyreprocin的免疫荧光检测
为研究恶臭假单胞菌感染后SCY2和Scyreprocin的空间表达模式，收集雄蟹睾丸和射精管组织，冷冻切片后参照先前研究[25,40]的protocol进行免疫荧光分析，并作适当修改。简言之，组织切片在预冷甲醇中−20 °C固定10分钟。PBS洗涤后，切片用7% BSA（Macklin, China）室温封闭30分钟，随后在湿盒中4 °C与SCY2和Scyreprocin一抗（1:800稀释）孵育过夜。阴性对照切片在相同条件下用预免疫兔血清和小鼠血清（1:100稀释）处理。含0.025% Triton X-100的TBS洗涤三次后，切片在避光湿盒中与荧光标记二抗孵育1小时：Dylight® 488偶联的山羊抗小鼠IgG和Alexa Fluor® 647偶联的山羊抗兔IgG（1:1000稀释；Thermo Fisher, USA）。细胞核用含DAPI的封片剂（Solarbio, China）复染。染色切片用盖玻片封片后使用FLUOVIEW FV4000共聚焦激光扫描显微镜（Olympus, Japan）成像。交配后雌蟹的纳精囊组织也进行相同染色程序，以评估交配后SCY2和Scyreprocin的阻断效果。
【数据】固定：预冷甲醇，−20°C，10min；封闭：7% BSA，室温，30min；一抗稀释度：1:800，4°C过夜；阴性对照：预免疫血清1:100；二抗稀释度：1:1000，1h；显微镜：FLUOVIEW FV4000共聚焦
2.9 雌蟹体内抗体阻断实验
雌性拟穴青蟹的生殖孔位于头胸甲腹侧、第三步足基部，每侧各有一个开口。体内阻断实验中，SCY2或Scyreprocin的多克隆抗体用无菌Dulbecco's PBS（DPBS）稀释至每只青蟹80 μg的终浓度。抗体溶液在注射前置于冰上。交配后雌蟹在冰水中短暂麻醉。注射时，每只青蟹腹面朝上以暴露生殖孔。装有6号不锈钢灌胃针的1 mL注射器垂直插入生殖孔约1–2 cm深度。将稀释抗体缓慢注射至纳精囊区域。间隔24小时后，采用相同方法进行第二次注射。阴性对照组青蟹注射等体积DPBS稀释的预免疫兔血清和小鼠血清。所有操作均在无菌条件下进行，所有处理组的动物操作标准化以确保一致性。
【数据】抗体剂量：80 μg/只；注射器：1 mL，6号不锈钢灌胃针；插入深度：1–2 cm；注射间隔：24h（共2次）；对照组：预免疫血清
2.10 纳精囊精子分离
抗体处理后，解剖雌蟹，切除纳精囊……（原文此段后续内容未在节选范围内完整呈现）
【数据】原文未详述
研究结果
3.1 恶臭假单胞菌在雄蟹体内的定位、分布与组织病理学
为确定恶臭假单胞菌对拟穴青蟹的致病性，利用细菌生长曲线建立光密度（OD₆₀₀）与菌落形成单位（CFU）之间的关系。感染青蟹相比健康对照表现出活动力和攻击性降低。感染后七天内，细菌剂量分别为每只4 × 10⁸、8 × 10⁷、1 × 10⁷和3 × 10⁶ CFU时，死亡率分别达到100%、70%、30%和10%。使用log-rank（Mantel–Cox）检验计算半数致死剂量（LD₅₀）为每只2 × 10⁷ CFU（图1A）。感染个体解剖显示病理征象，包括皮肤损伤、深色恶臭腹膜液、心肌收缩无力及鳃部发黑（图S1）。组织匀浆在CFC选择性培养基上培养，菌落通过365 nm紫外光下的绿脓菌素荧光鉴定（图S2）。定量细菌分析以每板20–200 CFU为有效计数（图1B）。
值得注意的是，肝胰腺、胸神经节、中肠、鳃和血淋巴细胞中的细菌定殖水平随时间逐渐增加。相比之下，心脏、睾丸和射精管中的细菌载量在所有时间点保持相对稳定，但始终高于检测阈值（>20 CFU）。感染青蟹的组织学分析显示显著的组织损伤，包括肝胰腺肝小管空泡化、肝胰腺和中肠基底膜破坏、鳃和心肌组织结构紊乱（图1C）。这些发现证实恶臭假单胞菌侵入并定殖于多个器官，引起系统性病理。值得注意的是，与肝胰腺和鳃等主要免疫器官中观察到的高水平定殖相比，血淋巴细胞中的细菌计数相对较低。这与青蟹的半开放循环系统一致——病原体主要被固定组织而非循环血淋巴细胞截留。
【数据】攻毒剂量：4 × 10⁸、8 × 10⁷、1 × 10⁷、3 × 10⁶ CFU/只；7天死亡率：100%、70%、30%、10%；LD₅₀：2 × 10⁷ CFU/只；检测阈值：>20 CFU
3.2 SCY2和Scyreprocin在雄蟹中的差异免疫功能
先前研究表明，恶臭假单胞菌感染拟穴青蟹可导致精荚结构损伤并诱导雄性特异性AMP表达[25]。为深入研究其在先天免疫中的功能角色，我们分析了细菌感染后这些肽在雄性性腺中的转录和翻译动态。在睾丸中，Scyreprocin mRNA水平在感染后3小时即显著上调，并持续升高至24小时（图2A）。在蛋白水平上，Scyreprocin表达持续增加，在感染后12、24和48小时观察到显著上调（图2C），表明既有快速的转录激活，又有持续的蛋白积累。相比之下，射精管中SCY2转录本在48小时感染期间呈现持续下调趋势（图2B）。然而，Western blot分析显示SCY2蛋白水平先下降，至感染后24小时恢复到基线水平（图2D）。这提示存在转录后调控机制或蛋白稳定化效应。
免疫荧光分析显示两种肽具有不同的时空表达模式（图2E）。在睾丸中，Scyreprocin（红色）是主要肽，感染后其荧光强度显著增加，与Western blot结果一致。相反，SCY2信号（绿色）主要在射精管中表达，感染后信号保持稳定，也与Western blot数据吻合。这些发现表明SCY2和Scyreprocin对病原体刺激产生差异化的应答，凸显它们在雄性生殖免疫中的特化功能。
【数据】Scyreprocin mRNA上调时间：3h起持续至24h；Scyreprocin蛋白上调时间点：12、24、48h；SCY2蛋白恢复基线时间：24h
3.3 重组SCY2和Scyreprocin增强雄蟹存活率并促进细菌清除
重组SCY2（rSCY2）和重组Scyreprocin（rScyreprocin）通过优化的真核表达系统成功制备（图S3）。为评估其保护效果，雄蟹感染恶臭假单胞菌后注射不同剂量的重组肽，实验流程如图3A所示。注射1、4或8 μg rScyreprocin的青蟹存活率一致为80%，而单纯感染组为40%，表明在所有测试浓度下均具有强保护效力。对于rSCY2，最高剂量（8 μg）使存活率达到90%，而1 μg和4 μg提供部分保护，存活率分别为60%和40%（图3B、C）。这些发现提示rSCY2具有剂量依赖性免疫保护效应，而rScyreprocin即使在较低浓度下也表现出稳健效果。
为进一步评估体内抗菌活性，在多个时间点测定组织细菌载量。rSCY2和rScyreprocin均在注射后12至96小时显著降低肝胰腺、鳃、血淋巴细胞、睾丸和射精管中的细菌定殖（图4A–E），显示出广泛的组织清除能力和强免疫增强效果。此外，初步测试了rSCY2和rScyreprocin的联合注射（各4 μg），与8 μg单独处理相比，在存活率或细菌清除方面未观察到显著协同效应（数据未显示）。
【数据】rScyreprocin各剂量存活率：1/4/8 μg均为80%；rSCY2存活率：8 μg为90%、4 μg为40%、1 μg为60%；感染对照组存活率：40%；细菌清除时间窗：12–96h
3.4 SCY2和Scyreprocin调节免疫基因表达与氧化应激反应
为进一步探索AMP的调控作用，检测了免疫相关基因表达和氧化指标。感染后，与Toll-Dorsal（spPelle、spTRAF6、spDorsal）、Imd-Relish（spImd、spRelish）和JAK/STAT（spSTAT）通路相关的基因——以及AMP基因（spArasin、spCrustin5、spCrustin7）——在3小时显著上调，但12小时后下调，表明存在瞬时免疫激活（图5A–I）。同时，氧化应激标志物的酶活性（POD、T-SOD、MDA、AKP、ACP）在感染后失调，但在肽处理后恢复正常，表明SCY2和Scyreprocin恢复了免疫稳态（图6A–E）。
【数据】免疫基因上调时间点：3h；下调时间点：12h后；检测基因数：9个（spPelle、spTRAF6、spDorsal、spImd、spRelish、spSTAT、spArasin、spCrustin5、spCrustin7）；氧化指标：5项（POD、T-SOD、MDA、AKP、ACP）
3.5 阻断SCY2和Scyreprocin导致雌蟹免疫失衡
在雌蟹纳精囊中的精子获能过程中，精子响应钙离子、孕酮及其他生理信号发生顶体反应（AR），最终实现受精[25,44]。为研究SCY2和Scyreprocin在雌性中的免疫功能，我们设计了结合体内抗体阻断、顶体反应诱导和流式细胞术的实验流程（图7A；图S4）。免疫荧光染色结果显示SCY2和Scyreprocin均定位于纳精囊腔内。鉴于这些肽不在雌性组织中表达[25]，该观察为它们在交配过程中从雄性成功转移提供了直接证据。相比之下，肽阻断组的荧光强度显著降低，证实了体内抑制的有效性（图7B；图S5）。
流式细胞术分析使用PNA-FITC和PI染色评估活精子的顶体反应（AR）。结果显示，ASW和ASW + PG处理组中AR阳性精子数量显著高于FASW组。钙离子的存在显著增强了AR，孕酮提供额外刺激。然而，抗体介导的SCY2或Scyreprocin阻断导致AR阳性精子显著减少，表明这些肽对最佳顶体功能至关重要（图8A–F；图S6）。
为进一步研究其生理学意义……（原文此部分后续内容未在节选范围内完整呈现）
【数据】AR阳性精子：ASW和ASW + PG组显著高于FASW组；钙离子增强AR；孕酮额外刺激；阻断后AR阳性精子显著减少
讨论与解读
细菌感染是拟穴青蟹集约化养殖中的严重威胁。高放养密度和环境应激常诱发疾病暴发，尤其是弧菌属病原可导致大规模死亡。本研究所用恶臭假单胞菌是公认的机会致病菌，可在其他受胁迫水生动物中引起急性高死亡率暴发。该病原与本研究模型尤为相关——实验室此前直接从拟穴青蟹睾丸中分离到一株毒力菌株[25]。LD₅₀攻毒剂量（2 × 10⁷ CFU/只）用于模拟急性严重感染，高于高毒力病原如副溶血弧菌的有效剂量（10⁴–10⁶ CFU/只[49,50]），符合机会致病菌需突破宿主基础免疫的更高感染阈值特征。
该剂量引发严重病理和高死亡率（图1A、C），建立了模拟自然流行病的细高细菌载量状态，为评估免疫效应物的保护效力提供了有效系统。这种来自定殖于性腺的环境病原体的特异性攻毒[25]，与青蟹独特的繁殖策略天然关联。交配后，精子储存在雌性纳精囊中数周至数月，在此期间依赖雄性转移的免疫分子维持存活。本研究揭示SCY2和Scyreprocin正是这类"雄性提供、雌性受益"的免疫效应分子——它们既在雄性体内清除多种组织中的病原体，又随交配转移至雌性纳精囊，保障精子顶体反应正常进行并抵御病原定殖。
【编译者解读】该研究巧妙利用了青蟹"精子储存"这一生殖生物学特征，将抗菌肽功能从传统的个体免疫拓展到"生殖免疫互惠"层面。重组肽体内回补与抗体阻断双向验证的设计逻辑严谨，尤其是通过流式细胞术将顶体反应与抗菌肽功能直接关联，方法学上具有示范价值。局限在于：SCY2与Scyreprocin的协同机制尚未完全阐明（联合注射无显著协同效应），且从甲壳类到脊椎动物的跨物种保守性仍需验证。对合成生物学而言，这对互作肽的"转移型免疫"机制为开发抗病育种标记和新型抗菌策略提供了独特靶点。
参考来源
Li H. Antimicrobial peptide SCY2 with its interacting proteins Scyreprocin mediate the innate immune defense of Scylla paramamosain against Pseudomonas putida infection. International Journal of Biological Macromolecules, 2026. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2025.149596
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2025.149596