来源：Constitutive and inducer-free production of xanthine oxidase in a Pseudomonas putida cell factory（Journal of Bioscience and Bioengineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
黄嘌呤氧化酶（XOD）在临床诊断和食品工业中应用广泛，但异源表达常受限于诱导剂依赖和代谢负担。本研究在恶臭假单胞菌KT2440中构建了无诱导剂组成型表达系统，通过低拷贝复制起点pSC101替换策略缓解代谢压力，实现CsXodCBA产量5.6 U/mL，较已报道的P. putida系统提高2.4倍。研究还揭示XodC亚基对钼辅因子插入的关键作用，为含钼金属酶的细胞工厂构建提供了新范式。
研究背景
黄嘌呤氧化酶催化次黄嘌呤和黄嘌呤氧化为尿酸，属于单核钼金属酶家族。其异源表达长期受制于两个瓶颈：大肠杆菌缺乏钼辅因子插入的翻译后修饰系统，而传统诱导型表达（如IPTG诱导）在大规模生产中增加成本与操作复杂度。此前报道的XOD异源表达系统均采用双基因簇（xodBA），未包含可能参与辅因子成熟的xodC同源基因。本研究从Cellulosimicrobium sp. TH20基因组中鉴定出完整的三基因簇xodCBA，并在P. putida KT2440中构建组成型表达平台，系统比较xodCBA与xodBA的表达效果，从酶学水平和金属含量两个维度验证XodC的功能。
研究方法
菌株、质粒与培养条件：恶臭假单胞菌KT2440、大肠杆菌JM109以及质粒pUC18和pUCP18保藏于实验室。E. coli JM109在LB培养基中、37°C条件下培养，用于基因克隆和表达实验。
【数据】菌株：E. coli JM109、P. putida KT2440；培养基：LB；温度：37°C；质粒：pUC18、pUCP18
化学试剂：黄嘌呤、尿酸和氧嗪酸购自Acros（中国北京）。其他化学试剂均为分析纯，购自商业渠道。DNA和蛋白质分子量标准品购自Transgen Biotechnology Co., Ltd.（中国北京）。
【数据】底物：黄嘌呤、尿酸、氧嗪酸；纯度：分析纯
基因与引物合成：来自Cellulosimicrobium sp. TH-20的XOD基因簇xodCBA（GenBank: CP020857.1），带有N端6×His标签，由Genscript Biotechnology Co., Ltd.（中国南京）合成。合成序列随后克隆至pUC18质粒，获得pUC18CsXodCBA。所有引物（表S1）由Tsingke Biotech Co., Ltd.（中国北京）提供。
【数据】基因簇：xodCBA；GenBank登录号：CP020857.1；标签：N端6×His
DNA提取与纯化：质粒分离和DNA纯化分别使用TsMini Kit和Tsgel Midi Kit（Tsingke Biotech），严格按制造商方案操作。
【数据】试剂盒：TsMini Kit、Tsgel Midi Kit
常规PCR扩增：常规PCR在25 μL反应体系中进行，包含25 μL 2×Phanta Max Master Mix（Vazyme Biotechnology Co., Ltd.，中国南京）、0.5 μL模板（60 ng/μL）、正反向引物各1 μL，以及22.5 μL去离子水。热循环条件如下：95°C初始变性3 min；随后28个循环，每个循环包括95°C变性30 s、55°C退火30 s、72°C延伸（每kb目标扩增子延伸10 s）。
【数据】PCR体系：25 μL；Master Mix：2×Phanta Max（25 μL）；模板：0.5 μL（60 ng/μL）；引物：各1 μL；变性：95°C 3 min；循环数：28；退火：55°C 30 s；延伸：72°C 10 s/kb
pPegP119质粒构建：pPegP119质粒由Tsingke Biotech采用Gibson组装法构建。构建过程涉及以下步骤，所有DNA片段列于表S2。第一步，将pUCP18质粒中的氨苄青霉素抗性 cassette（位置95–1062）替换为P119-RBS-MCS片段，获得中间质粒pUCP18P119。第二步，将pBR322复制起点（位置1232–1860）替换为来自pSC101质粒的pSC101复制起点和RepA蛋白序列，获得最终质粒pPegP119。
【数据】替换片段1：氨苄抗性 cassette（95–1062）→ P119-RBS-MCS；替换片段2：pBR322 ori（1232–1860）→ pSC101 ori + RepA
pUCP18Xod和pPegP119Xod表达质粒构建：表达质粒通过ClonExpress II试剂盒（Vazyme Biotechnology）组装PCR扩增片段构建。对于pUCP18系列载体，xodCBA和xodBA基因簇分别用引物对P1/P2和P3/P2从pUC18CsxodCBA扩增，pUCP18载体用P4/P5扩增。对于pPegP119系列载体，基因簇分别用P6/P7和P8/P7扩增，载体从pPegP119用P9/P10扩增。纯化后的PCR产物连接并化学转化至E. coli JM109。阳性克隆在含25 μg/mL庆大霉素的LB平板上筛选，并在液体培养基中培养以提取质粒和测序验证。该过程成功获得pUCP18xodCBA、pUCP18xodBA、pPegP119xodCBA和pPegP119xodBA四种质粒。同时，采用相同方法组装pUCP18P119xodCBA和pUCP18P119xodBA，此时载体骨架从pUCP18P119模板扩增。
【数据】抗生素：庆大霉素 25 μg/mL；组装试剂盒：ClonExpress II；引物对：P1/P2、P3/P2、P4/P5、P6/P7、P8/P7、P9/P10
XOD在P. putida KT2440中的表达与纯化：重组质粒通过电穿孔导入P. putida KT2440。电感受态细胞制备和转化流程参照Hanahan等描述的方法。转化子在含25 μg/mL庆大霉素的LB琼脂平板上筛选。单菌落接种至5 mL LB液体培养基（含25 μg/mL庆大霉素），30°C培养15 h。随后将种子培养物转接至50 mL新鲜LB培养基（含相同抗生素）。对于需要诱导的构建体（如pUCP18系列），先在30°C培养8 h，然后加入IPTG，再继续培养10 h。对于组成型表达构建体（如pPegP119系列），30°C培养18 h，不添加诱导剂。细胞通过4000 × g离心15 min收集。沉淀重悬后使用超声破碎仪破菌。可溶性组分经10,000 × g离心15 min收集。重组XOD通过His标签亲和层析从可溶性组分中纯化，使用HisTrap FF柱（GE Healthcare，中国上海）。洗脱蛋白的纯度和分子量通过SDS-PAGE分析。
【数据】电转化：P. putida KT2440；种子培养：5 mL LB、30°C、15 h；表达培养：50 mL LB、30°C；诱导条件：IPTG（8 h后添加，再培养10 h）；组成型表达：30°C、18 h、无诱导；离心：4000 × g 15 min；破菌：超声；可溶性组分：10,000 × g 15 min；纯化：HisTrap FF柱
XOD活性测定方法：酶活性通过监测黄嘌呤氧化生成尿酸的量来测定。反应体系包含2.24 mL 100 mM Tris–HCl缓冲液（pH 7.5）、0.08 mL 10 mM黄嘌呤和0.08 mL 1 mM氧嗪酸，在37°C预孵育5 min。加入0.1 mL酶液启动反应，以蒸馏水为空白对照，在293 nm处记录吸光度增加5 min。取时间进程的初始线性部分计算反应速率。在相同条件下生成尿酸标准曲线（1–10 mM）用于定量。一个XOD活性单位定义为每分钟产生1 μmol尿酸所需的酶量。
【数据】缓冲液：100 mM Tris–HCl（pH 7.5）；黄嘌呤：10 mM、0.08 mL；氧嗪酸：1 mM、0.08 mL；预孵育：37°C、5 min；酶液：0.1 mL；检测波长：293 nm；检测时间：5 min；标准曲线：1–10 mM尿酸；酶活单位定义：1 μmol尿酸/min
CsXodCBA和CsXodBA动力学参数测定：纯化XOD的动力学参数在最适条件（pH 7.0、50°C）下，于黄嘌呤浓度0.08–0.40 mM范围内测定酶活性获得。米氏常数K_m和最大反应速率V_max通过将初始速度数据拟合至米氏方程，使用GraphPad Prism（版本8.02；GraphPad Software，San Diego, CA, USA）中的非线性回归分析获得。
【数据】底物浓度范围：0.08–0.40 mM；条件：pH 7.0、50°C；软件：GraphPad Prism 8.02
电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定Mo含量：酶样品中的Mo含量使用Agilent 7800 ICP-MS（Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）定量。仪器在以下优化条件下运行：射频功率1550 W；等离子体气流15 L/min；辅助气流0.9 L/min；雾化气流1.0 L/min。碰撞/反应池以氦气模式运行，流速5 mL/min。样品引入30 s，蠕动泵速度对应约1 mL/min的吸入速率，随后用酸空白进行30 s冲洗/稳定。每质量积分时间0.3 s。分析前，仪器按制造商标准操作规程进行调谐和校准。使用2%（v/v）硝酸配制的系列Mo标准溶液建立校准曲线。在线引入内标以校正基质效应和仪器漂移。校准曲线通过绘制Mo信号与内标信号的比值对已知Mo浓度作图，并应用线性回归。校准后分析酶样品。系统用稀硝酸冲洗至获得稳定基线信号。酶样品（来源于5 mg蛋白）经消解并用2%硝酸适当稀释，确保Mo浓度落在校准曲线线性范围内。若存在显著多原子干扰，按制造商建议使用氦气模式碰撞/反应池进行校正。各样品消解液中的Mo浓度根据校准曲线计算，以μg/L表示。最终金属与蛋白的化学计量比由Mo浓度和蛋白浓度计算得出。
【数据】仪器：Agilent 7800 ICP-MS；RF功率：1550 W；等离子体气流：15 L/min；辅助气流：0.9 L/min；雾化气流：1.0 L/min；碰撞气：He 5 mL/min；积分时间：0.3 s/质量；样品量：5 mg蛋白；稀释液：2%硝酸
研究结果
Cellulosimicrobium sp. TH-20 XOD基因簇分析：Cellulosimicrobium sp. TH-20的XOD基因簇包含三个基因：xodC、xodB和xodA。xodB编码的小亚基（31 kDa）含有FAD结合结构域；xodA编码的大亚基（106 kDa）含有两个[2Fe–2S]簇结合结构域和一个MPT结合结构域，酶的活性中心也位于该亚基。xodC编码的XODC亚基（43 kDa）功能尚未明确表征，推测其可能促进MPT辅因子插入活性位点。该推测得到Rhodobacter capsulatus XDH同源蛋白XdhC的支持——xdhABC基因簇同样为三基因排列但基因方向相反，该系统中xdhC缺失导致活性中心缺乏MPT辅因子，酶活性完全丧失。本研究首先构建含完整xodCBA基因簇的表达质粒，随后构建xodC缺失变体以评估XodC的功能角色。这一对比策略的动机在于，此前报道的异源XOD表达系统均未纳入xodC同源基因。
【数据】基因簇组成：xodC（43 kDa）、xodB（31 kDa，FAD结合）、xodA（106 kDa，2×[2Fe–2S] + MPT结合）；对照系统：R. capsulatus xdhABC
pUCP18质粒上的XOD表达：最初尝试使用广宿主范围质粒pUCP18进行XOD基因簇的异源表达。选择该穿梭载体作为起点，是因为其在包括P. putida在内的假单胞菌属中功能明确。与许多E. coli特异性表达载体不同，pUCP18含有在假单胞菌中有功能的lac启动子，以及允许在该宿主中稳定维持质粒的复制起点。经IPTG诱导后，pUCP18xodCBA和pUCP18xodBA均在P. putida KT2440中实现了可溶性XOD的表达，SDS-PAGE上在大亚基XODA预期分子量（约106 kDa）处出现清晰蛋白条带（图1）。然而，较小的XodB和XodC亚基的表达水平肉眼不可见，可能因其信号被宿主蛋白背景掩盖。pUCP18xodCBA和pUCP18xodBA的细胞培养物酶活性分别为2.1 U/mL和1.6 U/mL，证明产生了功能组装的酶。
【数据】pUCP18xodCBA活性：2.1 U/mL；pUCP18xodBA活性：1.6 U/mL；XODA条带：约106 kDa
pPegP119质粒构建及XOD在pPegP119上的表达：为构建组成型表达XOD基因簇的pUCP18P119质粒，将pUCP18中的氨苄青霉素抗性cassette替换为合成的P119-RBS-MCS片段。然而，将XOD基因簇克隆至该载体以获得pUCP18P119xodCBA（9.7 kb）和pUCP18P119xodBA（8.5 kb）在大肠杆菌中十分困难。转化子中观察到的严重生长抑制表明，高拷贝质粒上强启动子的低水平组成型表达即造成显著代谢负担，阻碍了稳定克隆的建立。为解决该问题，将pBR322复制起点替换为低拷贝pSC101复制起点和RepA复制蛋白。这一修饰成功缓解了大肠杆菌中的生长抑制。所得质粒命名为pPegP119（图2），用于后续所有XOD表达构建。xodCBA和xodBA基因簇分别连接至pPegP119，获得pPegP119xodCBA和pPegP119xodBA。两者均在P. putida KT2440中无需诱导即成功表达。与pUCP18质粒构建体相比，XODA表达水平进一步提高，SDS-PAGE上条带更强（图1）。表达培养物的酶活性分别达到5.6 U/mL和2.1 U/mL，较相应pUCP18构建体显著提高。值得注意的是，pPegP119xodCBA构建体的产量（5.6 U/mL）超过了此前报道的P. putida中2.3 U/mL和R. erythropolis中1.5 U/mL的XOD产量，凸显了该表达系统的效率。
【数据】pUCP18P119xodCBA质粒大小：9.7 kb；pUCP18P119xodBA质粒大小：8.5 kb；pPegP119xodCBA活性：5.6 U/mL；pPegP119xodBA活性：2.1 U/mL；文献对照：P. putida 2.3 U/mL、R. erythropolis 1.5 U/mL
Cellulosimicrobium sp. TH-20 XOD纯化：选择XODA亚基产量较高的pPegP119xodBA和pPegP119xodCBA构建体进行蛋白纯化。超声破碎后，澄清裂解液经His标签亲和层析纯化。所得蛋白分别命名为CsXodBA和CsXodCBA。SDS-PAGE分析显示CsXodBA和CsXodCBA的条带模式一致，均仅出现两条明显条带，对应XODA（106 kDa）和XODB（30 kDa）亚基（图1）。相应培养物的粗提液总活性分别为2080 U/L和5590 U/L。纯化后比活性分别达到15.3 U/mg和28.1 U/mg，最终蛋白产量分别为88.4 mg/L和117.4 mg/L。据此计算，总活性回收率约为65%和59%。
【数据】粗酶总活性：CsXodBA 2080 U/L、CsXodCBA 5590 U/L；比活性：CsXodBA 15.3 U/mg、CsXodCBA 28.1 U/mg；蛋白产量：CsXodBA 88.4 mg/L、CsXodCBA 117.4 mg/L；活性回收率：CsXodBA约65%、CsXodCBA约59%；亚基：XODA 106 kDa + XODB 30 kDa
pPegP119xodCBA和pPegP119xodBA构建体XOD的催化常数：以黄嘌呤为底物测定纯化CsXodBA和CsXodCBA的动力学参数。CsXodCBA的米氏常数（K_m）与CsXodBA相近，但最大反应速率（V_max）显著更高，因此催化效率更优（表1）。
【数据】CsXodCBA：K_m = 85 ± 4 μM，V_max = 20.6 ± 1.3 μM/min
XOD酶复合物中亚化学计量Mo掺入：XOD家族是单核钼酶的重要类别，每个成员通常在每个活性位点含一个Mo原子，对应理论Mo与蛋白化学计量比为1:1。该结构特征得到牛乳黄嘌呤氧化酶晶体结构的证实。为评估实际金属掺入情况，通过ICP-MS定量蛋白样品的Mo含量。使用等量蛋白（5 mg）时，CsXodCBA的Mo含量约为CsXodBA的2.6倍（2.8 μg对1.1 μg）。值得注意的是，即使生长培养基中补充不同浓度的钼酸钠，这一差异仍保持一致（数据未显示）。然而，化学计量计算显示两种复合物均未达到完全Mo饱和：纯化CsXodCBA中Mo与蛋白比约为0.8:1，而纯化CsXodBA中仅为0.3:1。
【数据】Mo含量（5 mg蛋白）：CsXodCBA 2.8 μg、CsXodBA 1.1 μg；Mo/蛋白比：CsXodCBA约0.8:1、CsXodBA约0.3:1；倍数差异：约2.6倍
Cellulosimicrobium sp. TH-20 XOD的表征：鉴于其显著更高的比活性，选择纯化的CsXodCBA酶而非CsXodBA进行后续全面生化表征。该酶在pH 7.0和50°C条件下显示最适活性。尽管最适温度较高，该酶明显不耐热，在50°C及以上温度迅速失活。相比之下，其在pH 5.0–9.0范围内相对稳定（图3）。黄嘌呤是该纯化酶的偏好底物。酶也能利用次黄嘌呤和鸟嘌呤作为底物，但活性显著低于黄嘌呤；对腺苷和嘌呤未检测到活性（图4）。Cu²⁺、Hg²⁺和Zn²⁺等金属离子强烈抑制该酶，而Ni²⁺、Fe²⁺和Mn²⁺仅造成轻微抑制（图4）。Cu²⁺、Hg²⁺和Zn²⁺的强抑制可能源于其干扰酶必需的金属辅因子。Cu²⁺和Hg²⁺对硫具有高亲和力，可能通过结合并失活铁硫（[2Fe–2S]）簇来破坏电子传递途径。Hg²⁺还可能引起一般蛋白变性。Zn²⁺抑制可能源于其在活性位点与Mo中心的竞争。这种特异性离子敏感性凸显了无机辅因子在CsXOD活性中的关键作用，也为维持酶效力的实际操作方案提供了参考。
【数据】最适pH：7.0；最适温度：50°C；pH稳定性范围：5.0–9.0；底物偏好：黄嘌呤 > 次黄嘌呤、鸟嘌呤；无活性底物：腺苷、嘌呤；强抑制离子：Cu²⁺、Hg²⁺、Zn²⁺；弱抑制离子：Ni²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺
结构比对分析：对CfXODA、CsXODA和CcXODA进行结构比对。CsXODA结构以青色卡通模型显示，与黄色卡通模型的CfXODA比对；CfXODA上的插入片段以紫色标示，CsXODA上的插入片段以红色标示。为清晰起见，CcXODA的四级结构未予描绘（图5A、5B）。
【数据】比对对象：CfXODA、CsXODA、CcXODA；CsXODA插入片段：红色；CfXODA插入片段：紫色
讨论与解读
本研究最初将xodCBA或xodBA基因簇密码子优化后克隆至多种表达载体（pET30a、pGEX和pMAL系列）尝试在大肠杆菌中异源表达。尽管SDS-PAGE分析确认部分构建体产生了可溶性蛋白，但相应细胞裂解液中未检测到酶活性。这一结果与此前报道一致——大肠杆菌缺乏组装活性CsXOD所需的特异性翻译后修饰机制。基因组数据库检索也支持这一观察，大肠杆菌中不存在直接的XOD同源物，仅有醛氧化还原酶等远缘家族成员。
本研究选用Cellulosimicrobium sp. TH20基因组作为候选XOD基因来源，因其未发现相关专利，减少了商业化限制。鉴定到的XOD基因为三基因簇（xodCBA），而此前报道的Cellulosimicrobium cellulans（Cc）和Cellulosimicrobium funkei（Cf）异源表达XOD均由双基因簇（xodBA）编码。CsxodBA基因簇与Cf（97.1%）和Cc（98.5%）的核苷酸序列一致性很高。三个Cellulosimicrobium菌株间XOD亚基的比对分析显示不同程度的同源性。CsXODB亚基高度保守，与其同源物序列一致性达98.6%和99.3%。
编译者解读：本研究的技术路线颇具巧思——面对组成型强启动子在高拷贝质粒上的毒性效应，采用"降拷贝"策略而非削弱启动子，在维持高转录水平的同时减轻代谢负担，这一思路对其他毒性蛋白的微生物生产具有借鉴价值。XodC亚基功能的生化验证（Mo含量2.6倍差异）为三基因簇XOD的系统性应用提供了理论依据。值得注意的是，0.8:1的Mo饱和度仍未达理论值，提示辅因子供给或插入效率仍有优化空间——未来若能在培养基优化或共表达Mo插入辅助蛋白方面突破，该平台产量有望进一步提升。从合成生物学角度看，无诱导剂组成型系统在放大生产中具有显著成本优势，但pSC101来源的低拷贝质粒在工业规模下的质粒稳定性仍需长期传代验证。
参考来源
Guo, X. Constitutive and inducer-free production of xanthine oxidase in a Pseudomonas putida cell factory. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2026.
DOI: 10.1016/j.jbiosc.2026.03.006
DOI: 10.1016/j.jbiosc.2026.03.006