来源：Ribosome engineering enhances genetic code expansion in Saccharomyces cerevisiae（Synthetic and Systems Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
遗传密码扩展技术可在蛋白质特定位点引入非天然氨基酸，但其在真核生物中的效率瓶颈长期未解。本研究构建了一套基于LacZ显色反应的可视化筛选平台，对酿酒酵母18S核糖体DNA进行随机突变与高通量筛选，获得编号为ribo-hyper的核糖体突变株。该菌株使非天然氨基酸依赖的GFP产量提高2.9倍，且效果可推广至多种正交aaRS/tRNA系统。研究还揭示了核糖体救援途径对非天然氨基酸高效掺入的支撑作用，为真核生物翻译装置工程化提供了新路径。
研究背景
遗传密码扩展（GCE）借助生物正交的氨酰-tRNA合成酶（aaRS）/tRNA对，实现非天然氨基酸（ncAA）在蛋白质合成中的位点特异性共翻译掺入。目前已成功编码数百种携带不同化学、物理及生物学功能基团的ncAA，推动了蛋白质工程、化学生物学、生物催化等领域的发展。然而，ncAA掺入效率低下——尤其在真核细胞中——始终是限制该技术广泛应用的瓶颈。
既有优化策略多聚焦于正交翻译组件本身，如工程化aaRS和抑制型tRNA。但宿主翻译因子同样影响ncAA掺入效率——改造延伸因子或释放因子可改善终止密码子通读。这些证据表明，ncAA掺入并非仅由正交aaRS/tRNA对决定，宿主翻译机器的整体特性同样关键。核糖体因此成为提升GCE效率的诱人靶点。细菌中核糖体工程已取得显著进展——正交核糖体、体外筛选系统及高通量筛选方法催生了多种性能提升的核糖体变体。然而在真核生物中，核糖体工程仍面临技术挑战。
研究方法
2.1 菌株与质粒构建
本研究所用菌株、质粒及引物列于补充表S2–S4。以酿酒酵母BY4741（MATa his3Δ0 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0）为亲本菌株。在本实验室前期研究中，BY4741染色体上的全部rDNA簇已被删除，细胞存活通过引入携带野生型rDNA单元的多拷贝质粒pRDNwt-U（URA3标记）维持。纯合18S rDNA突变菌株通过以下方式获得：以突变型rDNA质粒替换野生型rDNA质粒，然后在含5-氟乳清酸（5-FOA）的琼脂平板上对pRDNwt-U进行反选择。涉及翻译相关质量控制途径的基因删除采用CRISPR-Cas9介导的基因组编辑，并辅以含同源臂的供体DNA片段。编码进化型氨酰-tRNA合成酶/tRNA对的质粒由刘实验室惠赠。含琥珀终止密码子的密码子优化GFP基因（yeGFP）置于TEF1启动子和CYC1终止子控制下，通过Gibson组装插入上述质粒。tRNA表达盒的四个拷贝通过四轮连续的限制性酶切-连接反应生成。琥珀突变型LacZ报告基因通过重叠延伸PCR构建，随后置于TEF1启动子和TEF1终止子控制下，插入单拷贝质粒。
【数据】亲本菌株：BY4741；反选择试剂：5-FOA；基因编辑：CRISPR-Cas9；启动子：TEF1；终止子：CYC1/TEF1；tRNA拷贝数：4
2.2 18S rDNA突变质粒文库构建
18S rDNA突变文库通过易错PCR生成，方法参照前期报道并略作修改。具体而言，使用低保真度EasyTaq DNA聚合酶（全式金生物，中国北京）扩增18S rDNA。通过添加核苷酸类似物dPTP和8-oxo-dGTP（Biorbyt，英国）促进突变引入。第一轮PCR反应总体积为20 μL，包含1.6 μL 2.5 mM dNTPs、0.4 μL 10 mM dPTP、0.4 μL 10 mM 8-oxo-dGTP、0.2 μL EasyTaq DNA聚合酶及100 ng模板质粒。PCR按制造商说明书进行四个扩增循环。PCR产物经纯化后用DpnI消化以去除模板质粒。纯化后取1 μL产物作为第二轮PCR扩增的模板，使用Phanta超保真DNA聚合酶（诺唯赞，中国南京）按制造商方案进行。所得PCR产物纯化后用BsmBI过夜消化，并连接到经消化的受体载体中。受体载体含有除18S rDNA序列之外的有序rDNA亚集，通过Golden Gate组装生成。在该载体中，18S rDNA区域被RFP表达盒替换以方便质粒构建。文库构建时，将BsmBI消化的载体与BsmBI消化的18S rDNA突变片段用T4 DNA连接酶（Thermo Fisher Scientific）在室温连接2小时。连接产物转化至XL10-Gold化学感受态细胞。转化子在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上铺板，30°C培养至菌落达到合适大小。通过洗涤平板收集全部菌落，提取质粒即得18S rDNA突变质粒文库。该易错PCR策略预计可在1.8-kb的18S rDNA序列上引入最多约十个突变。
【数据】易错PCR聚合酶：EasyTaq（低保真度）；核苷酸类似物：dPTP 10 mM、8-oxo-dGTP 10 mM；第一轮PCR体积：20 μL；循环数：4；模板量：100 ng；第二轮聚合酶：Phanta超保真DNA聚合酶；限制酶：BsmBI；连接酶：T4 DNA连接酶；连接时间：室温2 h；宿主菌：XL10-Gold；筛选标记：氨苄青霉素；预期突变数：约10个/1.8 kb
2.3 酵母培养基与生长条件
酵母菌株在YPD培养基或合成缺陷型（SD）培养基中培养。YPD培养基含2%葡萄糖、2%蛋白胨和1%酵母提取物。SD培养基含0.67%酵母氮源和2%葡萄糖，并补充所需氨基酸。固体培养基添加1.5%琼脂，需要时将pH调至6.5。酵母菌株在30°C下培养。
【数据】YPD成分：2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母提取物；SD成分：0.67%酵母氮源、2%葡萄糖；固体培养基琼脂：1.5%；pH：6.5（如需）；培养温度：30°C
2.4 显色平板覆盖法分析
显色分析采用平板覆盖法进行。简要步骤为：将平板上生长的酵母菌落用2 mL CHCl3轻轻覆盖板面以裂解细胞，待其挥发后重复此步骤一次。随后在平板上覆盖10 mL含250 mg/L X-gal的1%琼脂糖（溶于100 mM Na2HPO4缓冲液，pH 7.0）。保持平板水平直至琼脂糖层凝固，然后于37°C孵育12或24小时，直至菌落或点样细胞出现蓝色。
【数据】裂解剂：CHCl3，2 mL/次×2次；覆盖层：10 mL 1%琼脂糖（100 mM Na2HPO4，pH 7.0）；X-gal浓度：250 mg/L；孵育温度：37°C；孵育时间：12或24 h
2.5 GFP荧光分析
将过夜培养的酵母菌液稀释至新鲜培养基中，初始OD600为0.1，于30°C、220 rpm振荡培养24或36小时。收集100 μL培养物，用双蒸水洗涤后重悬于100 μL双蒸水中。取40 μL细胞悬液与160 μL双蒸水混合于96孔板中。在激发波长485 nm、发射波长528 nm处测量荧光强度，并使用Synergy Neo2多功能酶标仪（BioTek）记录OD600。ncAA掺入效率以荧光强度与OD600的比值计算。
【数据】初始OD600：0.1；培养温度：30°C；转速：220 rpm；培养时间：24或36 h；取样量：100 μL；检测体系：40 μL细胞+160 μL水；激发波长：485 nm；发射波长：528 nm；仪器：Synergy Neo2（BioTek）
2.6 双荧光素酶分析
将过夜培养的酵母菌液稀释至新鲜培养基中，初始OD600为0.1，培养至对数中期（OD600 = 0.7–0.9）。收集相当于0.5 OD600单位的细胞，用双蒸水洗涤。细胞沉淀用100 μL Passive Lysis Buffer（Promega）裂解。使用Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega）按制造商说明书在Synergy Neo2多功能酶标仪（BioTek）上测量发光信号。多拷贝质粒携带的报告基因使用2 μL细胞裂解液；单拷贝质粒携带的报告基因使用8 μL细胞裂解液。报告基因活性以萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值计算。每次分析使用四个独立生物学重复。
【数据】初始OD600：0.1；对数中期：OD600 = 0.7–0.9；细胞量：0.5 OD600单位；裂解缓冲液：100 μL Passive Lysis Buffer；多拷贝报告基因用量：2 μL裂解液；单拷贝报告基因用量：8 μL裂解液；生物学重复：4次
2.7 梯度稀释分析
单菌落于30°C在液体YPD培养基中过夜培养。将细胞密度调整至OD600为1.0，然后用无菌水进行十倍梯度稀释。将稀释后的细胞悬液点样于指定平板上，30°C培养指定天数后进行成像。
【数据】起始OD600：1.0；稀释方式：十倍梯度；培养温度：30°C
2.8 嘌呤霉素掺入分析与Western blotting
嘌呤霉素掺入分析：将过夜培养物稀释至5 mL新鲜YPD培养基中，初始OD600为0.1。当细胞生长至对数中期（OD600 = 0.6–0.7）时，加入嘌呤霉素至终浓度2 mM，于30°C继续孵育1小时。收集相当于2 OD600单位的细胞，用400 μL冰预冷双蒸水洗涤。离心后，细胞沉淀重悬于100 μL 20 mM NaOH中，室温孵育5分钟。再次离心并弃去上清。沉淀用SDS上样缓冲液重悬，缓冲液含60 mM Tris-HCl（pH 6.8）、10%甘油、2% SDS、0.01%溴酚蓝、0.01 M DTT和5% β-巯基乙醇，随后100°C加热10分钟。离心后取上清即得蛋白质样品。取5 μL蛋白样品经10% SDS-PAGE分离后进行Western blotting。掺入嘌呤霉素的新生多肽使用抗嘌呤霉素单克隆抗体（Merck, MABE343）检测。GAPDH作为上样对照，使用抗GAPDH抗体（ABclonal, AC033）检测。
【数据】初始OD600：0.1；对数中期：OD600 = 0.6–0.7；嘌呤霉素浓度：2 mM；孵育时间：1 h；孵育温度：30°C；细胞量：2 OD600单位；NaOH浓度：20 mM，100 μL；SDS-PAGE：10%；上样量：5 μL
2.9 蛋白质纯化与质谱样品制备
挑取携带C端His6标签yeGFP（Y40TAG）及进化型EcOmeYRS编码质粒的单菌落，接种于20 mL液体SD培养基中过夜培养。将饱和培养物稀释至500 mL新鲜SD培养基中，初始OD600为0.1，并补充5 mM OmeY。细胞在30°C培养……
【数据】培养基：SD；体积：20 mL→500 mL；初始OD600：0.1；OmeY浓度：5 mM；培养温度：30°C
研究结果
3.1 显色平台实现ncAA掺入筛选
核糖体DNA随机突变结合高通量筛选是鉴定有益核糖体修饰、提升GCE效率的有力策略。然而，高效的筛选方法对于在大规模突变文库中区分不同活性的突变体至关重要。Schultz团队此前报道的系统将ncAA掺入与Gal4依赖的报告基因激活偶联。该系统中Gal4表达依赖于ncAA的成功掺入，因此仅当目标ncAA被掺入时报告基因才会被激活。为最大限度降低背景报告基因活性并确保筛选特异性，酿酒酵母内源半乳糖响应转录因子被删除。然而，由于报告基因激活提供的是ncAA掺入的间接读数，所得信号可能无法定量反映实际掺入效率——尤其在转录调控或蛋白质降解途径受到干扰的条件下。
为实现直接且可视化筛选，我们构建了一种即插即用型显色报告系统，将菌落颜色与ncAA依赖性酶的产生偶联，无需基因组操作。选择LacZ作为报告基因——β-半乳糖苷酶可将X-gal转化为蓝色产物，使固体培养基上不同ncAA掺入活性的菌落得以区分。将五个允许突变的LacZ残基分别替换为TAG密码子，并在单拷贝质粒上由TEF1启动子和终止子驱动表达。结构分析表明这些替换不太可能破坏LacZ折叠或催化活性（图S1）。使用进化型大肠杆菌TyrRS/tRNA^CUA系统（用于OmeY掺入）对这些报告基因进行评估。所有报告基因在添加1 mM OmeY后均产生可见的β-半乳糖苷酶活性，但在ncAA非依赖背景和OmeY诱导的显色信号方面存在差异（图1B）。其中LacZ(Y96TAG)在无OmeY条件下背景显色最低，同时保持强烈的OmeY依赖性信号，为大规模突变筛选提供了最优的信噪比。前期研究表明携带琥珀突变的GFP可作为ncAA掺入的定量报告基因。与此一致，酵母密码子优化的GFP报告基因在1 mM OmeY存在下荧光显著增强（图1C）。因此我们使用LacZ(Y96TAG)进行初步视觉筛选，使用GFP荧光进行定量验证（图1D）。
【数据】OmeY浓度：1 mM；报告基因：LacZ(Y96TAG)最优；验证系统：GFP荧光
3.2 18S rDNA筛选鉴定ncAA掺入增强子
酵母rDNA的直接工程改造在技术上具有难度——rDNA在XII号染色体上以100-200个串联重复形式存在。为实现对rDNA的可操作改造，我们使用了前期构建的酵母菌株HYY34——其内源rDNA阵列已被删除，完整rDNA单元由多拷贝URA3质粒提供。完整rDNA盒通过Golden Gate克隆逐步组装（图S2）。为构建18S rDNA突变文库，我们将rDNA质粒中的18S rDNA区域替换为RFP表达盒。该设计使文库构建过程可视化：成功插入突变18S rDNA产生白色大肠杆菌菌落，而空载体或组装错误的载体保持红色。突变18S rDNA片段通过易错PCR生成，克隆至rDNA质粒文库后转化酵母进行显色筛选。筛选流程如图1D所示。
在固体培养基上挑选显色强于携带野生型rDNA的菌落，然后在归一化细胞密度下重新评估。候选18S rDNA序列经扩增、测序，重建至新鲜rDNA质粒中并重新导入酵母进行显色和GFP验证。由于候选菌株仍保留野生型rDNA质粒，我们在含5-FOA的培养基上对该质粒进行反选择，以获得仅由突变型18S rDNA支持的菌株。
基于初步显色和GFP筛选，共选出13个相对野生型rDNA菌株ncAA依赖性报告输出增加的候选突变体（图2A和B）。其中mut1和mut2产生的GFP表达增幅最大。为进一步验证突变核糖体的贡献，我们在5-FOA培养基上反选择野生型rDNA质粒，获得仅由突变rDNA支持的菌株。在这些菌株中，homo-mut1表现出最强的OmeY依赖性显色反应，homo-mut2在补充1 mM OmeY后也表现出比野生型rDNA菌株更强的显色（图2C）。这些结果与同时携带突变和野生型rDNA质粒的菌株所得筛选结果一致。GFP定量进一步确认了ncAA掺入增强：相对野生型rDNA菌株，homo-mut1在OmeY掺入时GFP产量增加2.9倍，homo-mut2增加1.5倍（图2D和E）。质谱验证了OmeY在GFP的TAG密码子位点的定点掺入（图2F）。这些结果表明，本研究构建的显色筛选系统能有效筛选ncAA掺入增强子，且18S rRNA操作在改善酵母ncAA编码方面具有巨大潜力。
【数据】候选突变体：13个；homo-mut1 GFP增幅：2.9倍；homo-mut2 GFP增幅：1.5倍；OmeY浓度：1 mM
3.3 18S rRNA协同突变增强ncAA掺入
DNA测序显示mut1和mut2变体的18S rDNA均含有多个突变（表S1）。为精确定位调控ncAA掺入效率的特异性位点，我们构建了分别携带mut1或mut2中单个位点突变的纯合菌株。重点关注那些破坏rRNA碱基配对并可能改变核糖体小亚基结构的位点。值得注意的是，源自mut1的T1129C突变使ncAA掺入增加1.2倍，而mut1来源的其他单一突变均未显示效应（图2D和E）。同样，在mut2来源的突变中，仅T582C产生约1.3倍的增加。由于任何单一突变均无法重现完整mut1或mut2变体的活性，增强表型很可能依赖于多个rRNA变化之间的协同作用。
为确定homo-mut1菌株中观察到的ncAA掺入增强能否推广至不同的正交翻译系统，我们在homo-mut1背景下评估了额外的ncAA掺入平台。具体测试了CysKRS/tRNA^CUA、源自巴氏甲烷八叠球菌MbPylRS/tRNA^CUA的N^ε-boc-L-赖氨酸（BocK）掺入变体，以及PLRS/tRNA^CUA——一种用于N^ε-乙酰赖氨酸（AcK）掺入的工程化大肠杆菌LeuRS/tRNA对。两个系统在mut1菌株中的ncAA掺入均相对野生型rDNA菌株增强，CysKRS的GFP产量增加约1.5倍，PLRS增加约1.4倍（图2G和H）。这些结果表明，增强的ncAA掺入表型主要由核糖体工程驱动，且在很大程度上不依赖于正交aaRS/tRNA系统或所供给的特定ncAA。鉴于其在不同系统中的可重复活性，我们将homo-mut1菌株命名为"ribo-hyper"，并用于后续表征。
【数据】T1129C增幅：1.2倍；T582C增幅：约1.3倍；CysKRS GFP增幅：约1.5倍；PLRS GFP增幅：约1.4倍
3.4 ribo-hyper菌株表现出独特的翻译特性
对ribo-hyper菌株的表征显示其细胞生长受到适度损伤（图3A）。与梯度稀释表型一致，液体培养生长分析表明ribo-hyper相对野生型rDNA菌株生长略有减缓……
【数据】生长：适度降低；液体培养：相对野生型略有减缓
3.5 翻译质量控制途径对ncAA掺入的影响
……
【数据】Dom34/Hbs1扰动：降低ncAA蛋白产量；Ski6扰动：降低ncAA蛋白产量；Rqc2扰动：影响微弱
讨论与解读
本研究建立了以ncAA依赖性LacZ报告基因偶联菌落视觉筛选、GFP荧光定量验证为核心的酵母核糖体工程策略，鉴定出可增强ncAA蛋白生产的18S rRNA变体。最强变体ribo-hyper使OmeY依赖性GFP产量提高2.9倍，并能增强多种正交aaRS/tRNA系统介导的掺入效率。这些结果支持"真核核糖体本身可通过工程化改造提升体内GCE效率"的结论。
该筛选策略的核心特征在于报告输出直接与ncAA含有的酶产量偶联。这种设计避免了对宿主转录回路的大规模基因组重排，且与常规实验室筛选兼容。LacZ读出的优势在于允许跨大文库目视识别活性差异，GFP报告基因则提供定量二级验证。这种两步设计降低了仅凭菌落大小或背景报告基因激活筛选出候选株的概率。除18S rRNA工程化外，LacZ(TAG)显色平台还可推广至翻译机器其他组件的筛选。
编译者解读
该研究将细菌中成熟的核糖体工程策略成功移植至真核模式生物酿酒酵母，其方法论价值在于构建了"表型直接偶联"的筛选通路——无需破坏宿主转录网络即可实现高通量目视筛选。ribo-hyper菌株的跨系统适用性提示核糖体小亚基rRNA的远程构象变化可能具有普遍性翻译调控效应。值得注意的是，该策略以适度降低细胞生长为代价换取ncAA掺入效率——在工业化蛋白质生产场景中，这种生长-产量权衡是否可接受仍需评估。未来若能将有益突变叠加至更多rRNA结构域或与其他翻译因子工程策略联用，或可进一步突破真核GCE的效率天花板。
参考来源
Chen X. Ribosome engineering enhances genetic code expansion in Saccharomyces cerevisiae. Synthetic and Systems Biotechnology, 2027. DOI: 10.1016/j.synbio.2026.08.009
DOI: 10.1016/j.synbio.2026.08.009