来源：Effect of aeration, agitation, and kinetic parameters on recombinant myrosinase production by Saccharomyces cerevisiae MGY70-myr（Process Biochemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
黑芥子酶是萝卜硫素形成的关键酶，但植物组织提取回收率低且不稳定，重组生产势在必行。本研究在受控生物反应器中系统考察了酿酒酵母MGY70-myr的培养动力学，结合动力学建模与敏感性分析，鉴定出Teissier模型为描述该双相系统的最适模型。研究发现通气与搅拌条件直接影响乳酸和乙酸的积累，进而调控生物量得率与产物形成系数，为过程强化提供了定量基础。
研究背景
重组蛋白生产已成为获取工业、制药和食品应用蛋白质的重要途径。大肠杆菌因生长快、营养要求低、遗传操作简便且重组产量高而被广泛使用，但其非GRAS宿主身份限制了在食品领域的直接应用，且存在蛋白错误折叠、聚集以及无法完成复杂翻译后修饰（如糖基化）等缺陷。糖基化对治疗性重组蛋白至关重要——N-聚糖的性质与结构可调节治疗蛋白的生物物理和药代动力学特性。因此，真核表达系统更适合需要翻译后修饰的蛋白生产。近年来，新商业化的生物制药活性成分大多为重组蛋白，主要产自哺乳动物细胞，但相当比例来自酿酒酵母等酵母表达系统。黑芥子酶负责催化硫代葡萄糖苷水解生成萝卜硫素等生物活性化合物，植物来源提取效率低下且批次间差异大，重组生产势在必行。然而，关于如何在酿酒酵母中优化重组黑芥子酶生产的认知仍然有限。
研究方法
2.1 酿酒酵母MGY70-myr的培养与重组黑芥子酶生产
培养在搅拌罐反应器（STR，Univessel Glass，Sartorius Stedim Biotech，德国）中进行，总体积1.6 L，工作体积0.8 L。反应器由硼硅酸盐玻璃制成，配备六叶分段式搅拌桨（直径45 mm）。温度维持在30°C，采用Pt−100探头监测。溶解氧（DO）用极谱传感器测量，维持在100%至65%空气饱和度之间。pH不控制，批式阶段为5.0 ± 0.7，诱导阶段介于5至6之间。通气通过无菌分布系统供给，范围为1187–4088 cm³/min。反应器还配备液位和泡沫传感器，消泡剂通过蠕动泵自动添加。所有实验均以独立重复三次进行。操作参数汇总于表1。
为在酿酒酵母中生产重组黑芥子酶（SMYR），携带多拷贝载体PMG1的重组酿酒酵母MGY70-myr克隆按Curiqueo等人所述方法培养。预培养在含蔗糖的YPS培养基（1% w/v酵母提取物、2% w/v蛋白胨、1% w/v蔗糖）中进行约6小时，至OD₆₀₀达1.8–2.0。随后通过一次性添加YPGal培养基（批式模式）（1% w/v酵母提取物、2% w/v蛋白胨、1.33% w/v半乳糖）启动诱导，维持16小时。培养基、反应器及辅助材料经高压灭菌（120°C，20 min），碳源用0.22 µm针头式过滤器（Sartorius，德国）过滤灭菌。培养液在7000 × g、4°C离心10 min，细胞沉淀与上清液于–20°C保存。反应器以10%（v/v）种子培养物接种，对应初始生物量浓度X₀ = 0.88 ± 0.31 gDCW/L，该值由光密度（OD₆₀₀）与细胞干重间的相关性估算。
【数据】反应器：Univessel Glass STR 1.6 L总容积/0.8 L工作体积；搅拌桨直径：45 mm；温度：30°C；溶解氧：100%–65%空气饱和度；pH：未控制（批式5.0 ± 0.7，诱导5–6）；通气：1187–4088 cm³/min；灭菌：120°C、20 min；接种量：10%（v/v）；X₀ = 0.88 ± 0.31 gDCW/L；预培养：YPS培养基、约6 h、OD₆₀₀ 1.8–2.0；诱导：YPGal培养基、16 h；离心：7000 × g、10 min、4°C
2.2 实验生物量、底物消耗与产物浓度测定
生物量干重采用前述浊度法测定。样品离心（7000 × g，10 min），上清液置冰上保存，沉淀在真空干燥箱（FCD−3000，Mundolab，智利）中于37°C、–0.06 MPa干燥24 h。干重使用分析天平（ABT 220–50DM，Kern，德国）称量，并由OD₆₀₀与细胞干重的校准曲线估算。600 nm吸光度用紫外–可见分光光度计（UV−1601，Rayleigh，中国）测量。
为测定底物消耗，回收的上清液经0.2 µm过滤，蔗糖（主要底物）用35%（v/v）HCl水解为葡萄糖和果糖。总还原糖和半乳糖（诱导物）采用DNS法按Saqib和Whitney所述方案定量。吸光度在540 nm处测定，每种还原糖均构建校准曲线（校准曲线及R²值见补充材料图S1）。为确保蔗糖完全转化为还原糖，样品在DNS定量前经酸水解处理。底物浓度以总还原糖报告，因此数值反映蔗糖来源的葡萄糖/果糖与诱导期半乳糖的合并贡献。该局限在底物消耗结果解读中已作考虑。
产物浓度以总蛋白含量表示，采用二喹啉甲酸（BCA）法，使用商业试剂盒（Sigma-Aldrich，Schelldorf，德国）按制造商说明操作。冻存的酿酒酵母MGY70-myr培养细胞沉淀重悬于1 mL裂解缓冲液（20 mM Tris·HCl、0.15 mM NaCl，pH 7.0），补加1 mM PMSF。细胞破碎使用Bead Ruptor 4（Omni International，GA，美国），条件为7200 × g、10°C。每mL裂解缓冲液加入0.5 mL酿酒酵母MGY70-myr细胞悬液（约0.2 g干生物量）和0.5 mL玻璃珠（直径1 mm）。裂解液在7000 × g、4°C离心15 min，上清液收集并置冰上用于总蛋白定量。
【数据】干燥条件：37°C、–0.06 MPa、24 h；酸水解：35%（v/v）HCl；DNS法波长：540 nm；裂解缓冲液：20 mM Tris·HCl、0.15 mM NaCl、pH 7.0、1 mM PMSF；细胞破碎：Bead Ruptor 4、7200 × g、10°C；玻璃珠直径：1 mm；离心：7000 × g、15 min、4°C
2.3 动力学建模
生物量、底物和产物动力学通过将实验数据拟合至质量平衡方程进行建模（详见补充材料）。这些方程与多种动力学模型（式7–20）耦合，用于估算比生长速率（µ）等动力学参数。所用模型包括Monod、Blackman、Haldane、Teissier、Moser、Contois、Aiba和Edward模型，以及基于抑制的模型如Han–Levenspiel、Powell、Verhulst、Luong、Webb和Yano–Koga模型。Hinshelwood型动力学亦被评估。模型拟合采用Python 3.11.5中实现的差分进化算法。模型性能以均方根误差（RMSE）和决定系数（R²）评价。
【数据】建模软件：Python 3.11.5（差分进化算法）；评价指标：RMSE、R²；模型数量：≥14种
2.4 敏感性分析
分析以阶段特异性方式进行，分别考虑预培养期和诱导期，以鉴定各过程阶段中控制生长和产物形成动力学的参数。敏感性分析采用与实验数据拟合最佳的动力学模型进行。通过施加相对于拟合值±10%和±50%的变化，评估系统对估算参数（µmax、Ki、Yx/s、α和β）受控扰动的响应。每个参数的增加和减少均独立评估，以量化其对生物量、底物和产物轨迹的影响。
【数据】参数扰动：±10%和±50%；分析参数：µmax、Ki、Yx/s、α、β
2.5 酿酒酵母MGY70-myr培养的操作控制
为表征SMYR生产过程中培养物在受控操作变化下的响应，实验评估了不同的通气和搅拌条件。培养采用五个通气水平（1187、1968、2750、3420和4088 cm³/min）和五个搅拌水平（103、115、125、132和137 rpm），覆盖可进行生化与生理变化比较评估的操作范围。各操作变量的效应独立评估。通气变化时（1187–4088 cm³/min），搅拌恒定在125 rpm；搅拌变化时（103–137 rpm），通气维持在2750 cm³/min。培养期间测定乳酸和乙酸浓度，并计算底物生物量得率（Yx/s）和生物量对产物得率（α）。底物生物量得率（Yx/s）以每克总还原糖对应的gDCW表示（g/g）。所得数值用于各条件间的比较分析。还构建了考虑通气、搅拌、有机酸浓度及Yx/s和α得率的相关性矩阵，以颜色编码方案可视化变量关联。
乳酸和乙酸浓度通过高效液相色谱（HPLC）定量。过滤样品（0.22 µm；Sartorius，德国）使用Aminex HPX-87H色谱柱（Bio-Rad，美国）分析。流动相为0.005 M硫酸，流速0.6 mL/min，温度45°C。定量采用光电二极管阵列（PDA）检测器（Shimadzu，东京，日本），结果以g/L表示。各操作条件间的统计显著性通过单因素方差分析（one-way ANOVA）评估。
【数据】通气水平：1187、1968、2750、3420、4088 cm³/min；搅拌水平：103、115、125、132、137 rpm；固定搅拌：125 rpm；固定通气：2750 cm³/min；HPLC柱：Aminex HPX-87H；流动相：0.005 M硫酸；流速：0.6 mL/min；柱温：45°C
研究结果
酿酒酵母MGY70-myr在生物反应器中培养的生物量增长、底物消耗和产物形成的实验动力学，以及这些数据对多种动力学模型的拟合结果，示于图1。以此为基础，描述预培养和诱导阶段的动力学行为与实验趋势，并评估成熟动力学模型（补充材料式7–20）的预测能力，目标是支持旨在提高生物量和产物得率、控制抑制性代谢物形成以及识别增强SMYR生产操作条件的培养策略。
3.1 酿酒酵母MGY70-myr在生物反应器中的实验动力学
培养期间底物、诱导物、生物量和总蛋白浓度的实验动力学曲线见补充材料，其中垂直虚线标示预培养阶段与诱导阶段之间的转换（图S2）。预培养阶段（0–6 h；图1a–c），培养物呈加速生长，生物量从约1 g/L增至5 g/L。这一增长由蔗糖快速同化维持，底物浓度从约10 g/L降至2 g/L。总蛋白产量也逐步增加，至阶段末达约0.6 g/L。
诱导阶段（>6 h；图1d–f），生物量继续增加至约15 g/L，但速率较为温和，而总底物（剩余蔗糖加添加的半乳糖）从约17 g/L降至2 g/L。蛋白形成稳步上升至约6 g/L，反映半乳糖诱导的重组代谢被激活。早期时间点观察到的较高相对变异归因于接近检测范围的低蛋白浓度，不影响总体动力学趋势。
这些轨迹定义了清晰的双相动力学系统：（i）预培养阶段以快速生长和高能量需求为主，由高效蔗糖水解和分解代谢支持；（ii）诱导阶段酵母逐渐将碳通量转向蛋白质合成，在维持残余生长的同时不损害产物形成。酿酒酵母的生理特性使其能在蔗糖耗尽后利用半乳糖作为碳源，这解释了诱导条件下生长的延续，并支持与重组表达相容的代谢分配。
从预培养到诱导的过渡期（6–10 h），生物量和产物曲线均出现非单调行为。生物量在6–7 h的最初下降可部分归因于诱导培养基批式添加造成的稀释效应。然而随后的下降提示碳源转换后的短暂代谢适应。该阶段可能反映GAL调控系统的激活以及代谢通量向半乳糖同化的重新分配。因此，生长与蛋白生产之间出现暂时性解耦。诱导后立即出现的蛋白浓度急剧上升（6–7 h）与初始诱导爆发一致，而8–10 h的短暂下降可能与适应期间的蛋白周转或蛋白水解活性有关。适应完成后系统趋于稳定，生物量持续增长并积累重组蛋白，与诱导条件下新代谢稳态的建立一致。
预培养期间底物生物量得率（Yx/s）约为0.38 g/g，与酿酒酵母在葡萄糖或蔗糖上需氧培养的报道值一致。尽管蔗糖培养有更高值报道，本研究所获得率与早期指数生长期吻合——该阶段被认为是触发重组表达的最适时期，与6 h诱导一致。诱导期间Yx/s增至约0.48 g/g，超过其他菌株以葡萄糖或蔗糖培养的报道值。与此一致，蛋白产量达约6 g/L，Yp/x约为0.32 g/g，未出现产物抑制或生长限制的证据，证实操作条件为SMYR表达提供了代谢有利环境。
该实验行为表征了一种稳健、碳高效的培养系统，能够在其他系统（如大肠杆菌）常出现抑制或生长停滞的条件下维持同步生长与重组生产。生物反应器中这种受控的代谢动态为优化旨在提高SMYR生产率的操作策略奠定了坚实基础。
【数据】预培养生物量：约1→5 g/L；预培养底物：约10→2 g/L；预培养蛋白：约0.6 g/L；诱导生物量：约15 g/L；诱导底物：约17→2 g/L；诱导蛋白：约6 g/L；预培养Yx/s：约0.38 g/g；诱导Yx/s：约0.48 g/g；Yp/x：约0.32 g/g
3.2 动力学参数估计与预测模型选择
预培养与诱导之间的功能分化既反映在实验轨迹中，也反映在各模型估算的动力学参数中（表2和表3）。这些分析的结合使培养物的生理特征得以表征，并支持选择适用于旨在最大化SMYR产量的操作策略的预测模型。
预培养期间（图1a–c），Monod、Blackman、Contois和Powell模型一致描述了由快速蔗糖同化支持的加速生长，R² > 0.9，估算得率接近实验值。其中Contois整体表现最佳（RMSE = 0.56），参数具有生理合理性（μmax = 0.29 h⁻¹；Ks = 1.0 g/L；Yx/s = 0.33 g/g；α = 0），表明培养物不受底物限制且蛋白生产未显著激活。Verhulst模型的R²低于前述模型，Moser产生生理不一致的参数（Yx/s = 1.64 g/g；Ks = 50 g/L），故被排除。底物抑制模型（Luong、Han–Levenspiel和Webb）证实培养物远离抑制条件运行：Luong估算Sm > 94 g/L，Han–Levenspiel得Ki = 20 g/L，Webb产生零Ki，均表明操作范围内（<10.14 ± 0.24 g/L）完全不存在底物抑制。Haldane显示高RMSE（= 1.22）且生长被高估，为最不适用的模型。Teissier和Aiba–Edwards也产生令人满意的整体拟合（R² > 0.9），但Teissier取得最佳调整（R² = 0.92；RMSE = 0.46），其较高的μmax（= 0.67 h⁻¹）指示代谢活跃状态，与诱导前阶段一致。产物抑制模型（Yano–Koga和Hinshelwood）一致性较差，但提示抑制效应可能在约10 g/L以上出现，该水平实验未达到，确认蛋白积累在此阶段不构成限制。总体而言，预培养在能量有利、无限制的状态下运行，是在6 h触发重组表达的理想条件。
诱导阶段（图1d–f），Monod、Blackman、Moser、Contois、Powell和Verhulst充分再现了半乳糖诱导的中等生长（R² > 0.9；RMSE < 0.68）。μmax较预培养降低（介于0.10–0.26 h⁻¹），反映了预期的代谢转变：半乳糖作为转录诱导物，降低生长速率并将碳通量转向蛋白质合成，尤其是SMYR。估算得率（Yx/s = 0.70 g/g；α = 0.32（w/w））与实验数据一致。第二组模型（Haldane、Webb、Aiba–Edwards、Luong、Teissier）有助于解释代谢敏感性。Haldane估算Ki = 17.58 g/L，提示与半乳糖诱导物相关的适度抑制。
【数据】预培养Contois模型：RMSE = 0.56、μmax = 0.29 h⁻¹、Ks = 1.0 g/L、Yx/s = 0.33 g/g、α = 0；Teissier：R² = 0.92、RMSE = 0.46、μmax = 0.67 h⁻¹；Luong：Sm > 94 g/L；Han–Levenspiel：Ki = 20 g/L；Haldane：RMSE = 1.22；操作范围：<10.14 ± 0.24 g/L；诱导R² > 0.9、RMSE < 0.68；诱导μmax：0.10–0.26 h⁻¹；诱导Yx/s = 0.70 g/g；α = 0.32（w/w）；Haldane诱导Ki = 17.58 g/L
讨论与解读
本研究整合实验动力学、数学建模、敏感性分析和操作评价，系统表征了酿酒酵母MGY70-myr在搅拌生物反应器中生产重组黑芥子酶（SMYR）的过程。结果表明，系统性能由明确的双相动力学控制，不同阶段由不同动力学参数决定其稳健性与生产率。预培养阶段在高代谢活性下运行，主要受μmax和Yx/s控制；诱导阶段则是过程的关键阶段，由α和β主导，二者分别调控生物合成能力与非生长关联组分。在评估的模型中，Teissier公式成为描述所观察培养行为的最一致框架，以生理合理性捕捉代谢转变，并提供生物量、底物和产物动态的最佳整体表征。
动力学敏感性分析显示，系统在中等参数变化（±10%）下保持稳定，而放大的扰动（±50%）产生高度非线性响应，从而能够识别必须严格控制以防止过程效率损失的关键参数。操作评价证实，通气和搅拌直接调节与β相关的酸性代谢物——主要是乳酸和乙酸，这些代谢物积累时损害Yx/s和α，而充分氧合的条件则缓解这些负面影响。
编译者解读
该研究将经典动力学建模与操作参数评估相结合，为酵母重组蛋白生产的过程优化提供了系统方法论。亮点在于分阶段敏感性分析——精确锁定预培养与诱导期各自的控制参数，避免了笼统优化的盲目性。从合成生物学应用看，将代谢副产物（有机酸）纳入操作条件与产量关联的分析框架，对工业放大具有直接参考价值。局限在于以总蛋白表征产物浓度，未能区分目标蛋白与宿主蛋白背景；后续若引入特异性定量方法，将进一步提升模型对目标产物的预测精度。
参考来源
期刊：Process Biochemistry, 2026
DOI: 10.1016/j.procbio.2026.06.014
DOI: 10.1016/j.procbio.2026.06.014