来源：Microbial synthesis of polyhydroxyalkanoate blends with engineered Pseudomonas putida（New Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
塑料污染催生了生物可降解材料的研究热潮。聚羟基脂肪酸酯（PHA）作为微生物天然合成的生物聚酯，有望替代石油基塑料。传统PHA共混需在合成后通过物理熔融混合实现，工艺繁琐。本研究在恶臭假单胞菌中引入外源phaCAB操纵子，利用不同启动子调控表达，实现含3-羟基丁酸（3HB）单体摩尔比17.9%至99.6%的P(3HB)/mcl-PHA共混物一步发酵直接合成。通过优化碳源浓度，PHA产量最高达1.48 ± 0.15 g/L。这是首次通过启动子选择实现PHA共混物组成调控的研究。
研究背景
PHA是一类由细菌和古菌天然产生的生物基可降解聚酯，代表菌株包括真养产碱杆菌、恶臭假单胞菌、枯草芽孢杆菌等。根据单体碳链长度，PHA分为短链（scl-PHA，3-5碳）和中长链（mcl-PHA，6-14碳）两类。在scl-PHA合成中，PhaA、PhaB和PhaC三种关键酶参与催化：PhaA将两分子乙酰辅酶A缩合为乙酰乙酰辅酶A，PhaB将其还原为(R)-3-羟基丁酰辅酶A，最后由PhaC聚合为P(3HB)。mcl-PHA则通过β-氧化和脂肪酸合成途径产生前体。PHA合酶（PhaC）的底物特异性决定了聚合物的单体组成。为满足不同应用场景的性能需求，PHA通常在合成后进行物理共混。本研究探索了一条替代路径——在单一发酵过程中直接合成PHA共混物，以减少多次独立发酵和提取步骤。
研究方法
2.1 细菌培养与转化
大肠杆菌DH5α用于分子克隆、质粒繁殖与保存。恶臭假单胞菌mt-2（DSM 6125；DSMZ，德国不伦瑞克）用于PHA生产。大肠杆菌在Luria–Bertani（LB）培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中于37°C培养。恶臭假单胞菌于30°C在LB培养基或补充1%(w/v)至6%(w/v)葡萄糖作为唯一碳源的无机盐培养基（MSM）中培养。除非另有说明，葡萄糖浓度为1%(w/v)。MSM按前述方法配制，氮源浓度降低（0.5 g/L NH4Cl）。TYE琼脂（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、8 g/L NaCl、15 g/L琼脂）用于大肠杆菌和恶臭假单胞菌培养。需要时补充卡那霉素（50 μg/mL）和庆大霉素（20 μg/mL）。使用WPA CO 8000细胞密度计（Biochrom Ltd，英国）在600 nm处测量光密度（OD600）。标准氯化钙法用于将质粒转化至DH5α，恶臭假单胞菌采用改良电穿孔法。具体操作：挑取新鲜单菌落接种至5 mL LB中，30°C、250 rpm振荡过夜培养作为预培养。取400 μL预培养物转移至20 mL LB制备电转感受态细胞，培养至OD600约0.6，冰上放置10 min，离心收集（5000 g，10 min，4°C）。细胞沉淀用冰冷10%(v/v)甘油洗涤两次，重悬于1 mL 10%(v/v)甘油中。将1 μL质粒DNA加入100 μL感受态细胞，转移至预冷的2 mm电转杯，在2.3 kV下电穿孔（Eppendorf Eporator，德国）。随后加入900 μL LB重悬细胞，30°C振荡培养2 h，涂布于含适当抗生素的TYE琼脂平板。工作流程示意图见图S2。
【数据】菌株：E. coli DH5α、P. putida mt-2 (DSM 6125)；培养基：LB（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）、MSM（0.5 g/L NH4Cl）；葡萄糖：1%–6%(w/v)；温度：37°C（E. coli）、30°C（P. putida）；抗生素：卡那霉素50 μg/mL、庆大霉素20 μg/mL；转速：250 rpm；电转条件：2.3 kV，2 mm电转杯
2.2 启动子测试与PHA生产质粒的分子构建
本研究使用的所有质粒列于表1。组成型启动子质粒基于已有报道的质粒构建。简言之，将PphaC1-RFP、PrrsC-RFP、Pj5-RFP和Pg25-RFP质粒上的氯霉素乙酰转移酶筛选标记替换为来自pBBR1MCS-2的氨基糖苷磷酸转移酶基因，以获得卡那霉素抗性。这四个质粒用引物PB-F和PB-R扩增，氨基糖苷磷酸转移酶基因用引物Km-F和Km-R扩增。扩增产物经Gel and PCR Clean-Up Kit（Macherey-Nagel，德国）纯化，片段使用NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix（New England Biolabs，英国）按制造商方案组装，构建PphaC1k-RFP、PrrsCk-RFP、Pj5k-RFP和Pg25k-RFP。用于恶臭假单胞菌诱导型蛋白表达的质粒pPS85（含ParaB启动子）和pPS87（含PrhaB启动子）获自pSEVA-sib文库。用于PCR扩增的所有寡核苷酸引物列于表S1（Eurofins，德国）。为在恶臭假单胞菌中生产P(3HB)，从质粒pBBR1c-phaCAB用引物phaCAB-F和phaCAB-R扩增真养产碱杆菌H16的phaCAB操纵子，通过NEBuilder HiFi DNA Assembly构建质粒ParaB-phaCAB、PrhaB-phaCAB和PphaC1k-phaCAB，随后转化至恶臭假单胞菌。
【数据】质粒骨架：pBBR1MCS-2来源；抗性标记：氨基糖苷磷酸转移酶基因（卡那霉素抗性）；组装方法：NEBuilder HiFi DNA Assembly；引物：PB-F/PB-R、Km-F/Km-R、phaCAB-F/phaCAB-R
2.3 启动子强度测定
挑取转化后的恶臭假单胞菌单菌落接种至5 mL LB培养基，30°C、250 rpm过夜培养。用此预培养物接种5 mL新鲜MSM培养基，初始OD600为0.2。细胞于30°C、250 rpm培养。对于含诱导型启动子的构建体，当OD600约0.6时加入0.4%(w/v)阿拉伯糖或10 mM鼠李糖诱导荧光蛋白产生。在固定时间点（4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、48 h、72 h），取100 μL细胞转移至96孔透明底板，使用SpectraMax M2e酶标仪（Molecular Devices，英国）测量RFP（激发584 nm，发射607 nm）或GFP（激发485 nm，发射528 nm）荧光。
【数据】诱导剂：0.4%(w/v)阿拉伯糖、10 mM鼠李糖；时间点：4/8/12/16/20/24/48/72 h；取样量：100 μL；检测波长：RFP Ex 584/Em 607 nm，GFP Ex 485/Em 528 nm
2.4 组成分析用PHA生产
挑取野生型或转化后的恶臭假单胞菌单菌落接种至20 mL LB培养基，30°C、250 rpm过夜培养。用此预培养物接种400 mL新鲜MSM培养基，初始OD600为0.2。细胞于30°C、250 rpm培养。当OD600约0.6时，用0.4%(w/v)阿拉伯糖或10 mM鼠李糖诱导phaCAB操纵子。用于组成分析时，在固定时间点（12 h、16 h、20 h、24 h、48 h）通过离心（8000 rpm，10 min）收集50 mL细胞。所有细胞沉淀用1×磷酸盐缓冲液（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na2HPO4和2 mM KH2PO4）洗涤两次，−80°C冷冻后冻干。称量冻干细胞获得细胞干重（CDW）。冻干细胞的胞内PHA含量使用气相色谱分析。
【数据】培养体积：20 mL LB预培养、400 mL MSM；诱导剂：0.4%(w/v)阿拉伯糖或10 mM鼠李糖；收获时间：12/16/20/24/48 h；离心：8000 rpm，10 min；PBS成分：137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na2HPO4、2 mM KH2PO4
2.5 PHA生产与索氏提取
细胞培养条件与组成分析用PHA生产相同，但所有细胞在培养24 h后收获并冻干。冻干细胞转移至提取套管进行索氏提取。样品先在90 mL甲醇中回流2 h，随后在100 mL二氯甲烷中回流至少12 h。二氯甲烷中的PHA经浓缩后在50–100 mL冷甲醇中沉淀。如有必要，将PHA重新溶于二氯甲烷并再次沉淀以进一步提高纯度。
【数据】索氏提取：90 mL甲醇回流2 h，100 mL二氯甲烷回流≥12 h；沉淀：50–100 mL冷甲醇
2.6 PHA气相色谱（GC）分析
取10 mg冻干细胞或PHA，在二氯甲烷、甲醇和硫酸体积比2.0:1.7:0.3的混合液中于100°C进行甲醇解3.5 h。加入苯甲酸（1 mg/mL）作为内标。2 mL反应液在冰上冷却后加入1 mL蒸馏水。混合物涡旋5 min后静置分层。有机相使用配备SH-Rtx-5MS色谱柱（30 m × 0.25 mm × 0.5 μm；Shimadzu）和火焰离子化检测器的Shimadzu GC2010 pro（京都，日本）气相色谱仪分析。每份样品进样1 μL，分流比100:1（排气口:色谱柱）。氢气为载气，流速40 mL/min。柱温箱80°C保持5 min，以8°C/min从80°C升温至180°C，180°C保持12 min。使用含4–12碳单体的3-羟基甲酯标准品（Cayman Chemical Company，美国）生成校准曲线进行定量。
【数据】样品量：10 mg；甲醇解：100°C，3.5 h；溶剂比：二氯甲烷:甲醇:硫酸 = 2.0:1.7:0.3；内标：苯甲酸1 mg/mL；进样量：1 μL；分流比：100:1；载气：H2，40 mL/min；程序：80°C 5 min，8°C/min升至180°C，保持12 min
2.7 凝胶渗透色谱（GPC）
索氏提取的PHA用于通过凝胶渗透色谱测定分子量。取100 μL样品（1–3 mg/mL）在配备示差折光和粘度检测器的Agilent 1260 Infinity LC系统（Agilent，美国）上分析。聚合物使用两根串联的PLgel MIXED-C（7.5 × 300 mm，5 μm；Agilent）色谱柱及PLgel保护柱（7.5 × 50 mm，5 μm；Agilent）分离。氯仿为流动相，流速1 mL/min，柱温40°C。使用峰分子量范围0.162 × 10³至1.014 × 10⁶ g/mol的低多分散性聚苯乙烯标准品（InfinityLab EasiVial Standards，Agilent）作为标样。所有分子量标准品和实验样品均含甲苯作为内标以归一化保留时间。系统校准和实验样品分析使用Agilent GPC数据分析软件包完成。测量每份样品的数均分子量（Mn）、重均分子量（Mw）和多分散性（PD）。
【数据】进样量：100 μL（1–3 mg/mL）；色谱柱：两根PLgel MIXED-C（7.5 × 300 mm，5 μm）+ 保护柱；流动相：氯仿，1 mL/min；柱温：40°C；标样：聚苯乙烯，0.162 × 10³–1.014 × 10⁶ g/mol
2.8 PHA热重分析
（原文节选至此，热重分析具体操作细节原文未详述。）
研究结果
3.1 恶臭假单胞菌中诱导型与组成型启动子的活性
为便于启动子选择，首先评估了两个诱导型启动子和四个组成型启动子。诱导型启动子ParaB和PrhaB因在恶臭假单胞菌KT2440中具有低基础表达和高诱导表达而被选中。四个在真养产碱杆菌H16中具有不同强度的组成型启动子也被纳入研究。结果显示，质粒的引入不影响细胞生长（图S3）。启动子活性通过恶臭假单胞菌中绿色荧光蛋白（GFP；用于诱导型启动子）和红色荧光蛋白（RFP；用于组成型启动子）的表达进行比较（图1）。两个诱导型启动子在72 h培养期间均表现出极低的基础表达（图1a）。诱导后，ParaB启动子的活性高于PrhaB，经双因素方差分析确认（α=0.05，P < 0.01）。有趣的是，荧光在8 h（ParaB）和12 h（PrhaB）达到最大值后下降，提示启动子活性丧失。Carelo等的研究表明ParaB和PrhaB启动子在诱导后迅速达到荧光蛋白的最大表达，与本研究观察一致。启动子活性随时间丧失可归因于多种因素，包括质粒不稳定及长时间培养中的丢失、毒力因子调节子的转录调控、缺乏特异性鼠李糖转运蛋白导致诱导剂摄取不足，或这些因素的组合。与诱导型启动子相比，组成型启动子在培养期间表现出稳定活性（图1b）。启动子Pg25活性最高，其次为Pj5，而PrrsC和PphaC1的活性很低。与诱导型启动子相比，组成型启动子在重复之间表现出更大的变异性。这可能是因为其蛋白表达对细胞生长状态具有固有敏感性，且缺乏外部调节机制。它们的相对启动子活性与此前在真养产碱杆菌中观察到的趋势相似——在真养产碱杆菌H16中活性顺序为Pg25 > Pj5 > PrrsC > PphaC1。这也是这些组成型启动子首次在恶臭假单胞菌中得到验证，为该微生物的分子工具箱增添了新启动子元件。ParaB和PrhaB启动子具有精确控制表达时间和水平、基础表达极低的优势，可按需激活。组成型启动子则在一系列培养条件下提供稳定的表达水平。为研究两类启动子的影响，后续实验选用ParaB、PrhaB和PphaC1。
【数据】培养时间：72 h；荧光峰时间：ParaB 8 h、PrhaB 12 h；统计：双因素方差分析 α=0.05，P < 0.01；启动子活性排序：Pg25 > Pj5 > PrrsC > PphaC1
3.2 PHA共混物组成可通过启动子选择调控
通过引入真养产碱杆菌H16的phaCAB操纵子（图S1），在恶臭假单胞菌中加入了PhaA、PhaB和PhaC三种酶，构建了P(3HB)合成途径。携带ParaB、PrhaB和PphaC1启动子驱动phaCAB操纵子异源表达的质粒，经气相色谱分析确认，可产生P(3HB)和mcl-PHA共混物（图2）。野生型恶臭假单胞菌产生的mcl-PHA以3-羟基癸酸为主要单体（图2a），与先前报道一致。引入异源phaCAB操纵子后，根据所用启动子的不同，PHA共混物中3HB单体含量为17.9 mol%至99.6 mol%（图2b-f）。令人意外的是，未诱导的ParaB和PrhaB启动子尽管基础活性很低，却产生了含17.9–41.5 mol% 3HB单体的PHA共混物（图2c和2e）。活性较低的PphaC1启动子也产生了含89.7–93.0 mol% 3HB单体的PHA（图2b）。这些高P(3HB)组成似乎与图1中表征的最低启动子活性不一致。但需要注意的是，蛋白表达受转录和翻译两个过程的影响。不同靶标（即荧光蛋白和PhaCAB）即使转录水平相同，其蛋白表达水平也可能因mRNA结构、稳定性和细胞tRNA库的不同而不同。蛋白质降解速率也因蛋白而异，进一步影响其胞内浓度。此外，PHB生产与荧光蛋白表达有本质区别。对于PhaCAB，渗漏表达可能足以产生一定水平的生物合成酶，这些酶能持续催化底物转化并驱动PHB合成。因此观察到的PHB积累可能是累积性、多轮催化的结果，而非仅转录和翻译的效应。当诱导ParaB和PrhaB后，产生的PHA几乎完全由3HB单体组成（图2d和2f）。
【数据】3HB含量范围：17.9–99.6 mol%；未诱导ParaB/PrhaB：17.9–41.5 mol% 3HB；PphaC1：89.7–93.0 mol% 3HB；诱导后：几乎纯3HB
3.3 启动子选择与碳源影响PHA产量
野生型恶臭假单胞菌（图2a）的PHA产量在培养24 h后达到峰值0.193 g/L mcl-PHA。与所有工程菌株相比，这是最高的mcl-PHA产量。值得注意的是，随着培养时间从24 h延长至48 h，其PHA含量下降（图2g），这可能是由于恶臭假单胞菌细胞内的天然PHA解聚酶（PhaZ）调动了储存的mcl-PHA。该phaZ基因位于phaC1和phaC2基因之间的基因簇中，特异性水解mcl-PHA。与野生型恶臭假单胞菌相比，除含PphaC1构建体的菌株在48 h时mcl-PHA产量相当外（图2g），所有工程菌株的mcl-PHA产量均较低。使用未诱导的ParaB和PrhaB时，由于mcl-PHA产量降低，总PHA产量下降。对于诱导的ParaB、诱导的PrhaB和组成型PphaC1，总PHA产量比野生型恶臭假单胞菌高至7.7倍。这一增加归因于培养期间P(3HB)的持续积累，在48 h时达到最大PHA产量1.04–1.48 g/L（表S3、S5和S7）。在这三种构建体之间，诱导的ParaB在P(3HB)产量上增加最多，而mcl-PHA产量降幅最大（图2g和2h）。这可能是因为天然mcl-PHA途径和工程化P(3HB)途径竞争同一代谢物——乙酰辅酶A（图S1）。在测试的三种启动子和五种条件中（图2a-2h），携带未诱导ParaB和PrhaB的工程恶臭假单胞菌产生了最均衡的PHA共混物，P(3HB)含量分别为41.5 mol%和20.5 mol%。为探究能否在维持共混物组成的同时提高PHA产量，将培养基中葡萄糖浓度从1%(w/v)提高至6%(w/v)。选择具有PrhaB基础活性的工程菌株进行此测试，因为其组成在所有时间点相对稳定（图2e）。当葡萄糖从1%(w/v)提高至2%(w/v)时PHA产量增加最为显著，这归因于细胞质量和PHA含量的共同提高。在48 h培养中将葡萄糖浓度从1%(w/v)提高至6%(w/v)，PHA产量增加超过10倍，达0.91 ± 0.07 g/L，PHA含量为细胞干重的42.2 wt%（图3）。这种高产PHA有利于P(3HB)组分——在6%(w/v)葡萄糖条件下产生的PHA共混物含90.4 ± 0.9 mol% 3HB，而在1%(w/v)葡萄糖培养基中仅为20.6 ± 1.2 mol%。共混物组成的变化凸显了同时调控mcl-PHA和P(3HB)两条合成途径的挑战与重要性。P(3HB)合成仅依赖于乙酰辅酶A的可利用性（图S1），而在此系统中……
【数据】野生型最高mcl-PHA产量：0.193 g/L（24 h）；最高总PHA产量：1.04–1.48 g/L（48 h）；最高提升倍数：7.7倍；未诱导ParaB：41.5 mol% P(3HB)；未诱导PrhaB：20.5 mol% P(3HB)；6%(w/v)葡萄糖：PHA产量0.91 ± 0.07 g/L，含量42.2 wt% CDW，3HB含量90.4 ± 0.9 mol%；1%(w/v)葡萄糖：3HB含量20.6 ± 1.2 mol%
讨论与解读
本研究证实了利用恶臭假单胞菌直接微生物合成PHA共混物，并首次展示了通过不同启动子控制共混物组成。研究产生了3HB含量从17.9 mol%到99.6 mol%的P(3HB)/mcl-PHA共混物。当phaCAB操纵子由诱导的ParaB启动子控制并在48 h培养时，获得最高PHA产量1.48 ± 0.15 g/L，PHA含量为细胞干重的52.2 ± 4.3 wt%。研究还鉴定了四个可用于恶臭假单胞菌的新型组成型启动子，丰富了该微生物的分子工具箱。影响直接微生物合成中共混物组成的关键因素包括：（1）恶臭假单胞菌中严格调控的天然mcl-PHA途径和PhaZ解聚酶限制了mcl-PHA的产生；（2）启动子可调控引入的P(3HB)合成途径，从而改变PHA共混物组成；（3）提高培养基中葡萄糖浓度可使PHA产量增加10倍以上，并有利于共混物中P(3HB)的合成；（4）本研究产生的PHA共混物热性能与通过熔融共混、双菌共培养和发酵中前体饲喂制备的类似共混物相当。该研究验证了通过启动子选择实现微生物共混物合成与控制，为可定制PHA共混物的一步生物制造铺平了道路。
编译者解读
本研究巧妙利用启动子的"渗漏表达"特性——这一在蛋白质表达中通常被视为缺点的属性——将其转化为调控PHA共混物组成的工具。未诱导条件下弱启动子驱动的PhaCAB持续催化，竟能产生高比例P(3HB)，揭示了多轮酶催化对信号放大的独特贡献，这是荧光报告基因无法反映的。从应用角度看，利用廉价农业废弃物（如马铃薯皮水解液）作为碳源进一步提升了该工艺的经济性。但本研究也暴露了代谢通量竞争的难题：提高葡萄糖浓度虽使总产量提升10倍，却使共混物从均衡型（20.6 mol% 3HB）偏向P(3HB)主导（90.4 mol%），说明同时独立调控两条合成通量仍具挑战。未来可探索动态调控策略或利用PhaZ突变株维持mcl-PHA积累。
参考来源
期刊：New Biotechnology, 2025. DOI: 10.1016/j.nbt.2025.05.004
DOI: 10.1016/j.nbt.2025.05.004