来源：Cell-free biocatalysis for co-production of nicotinamide mononucleotide and ethanol from Saccharomyces cerevisiae and recombinant Escherichia coli（Enzyme and Microbial Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
无细胞酶系统正逐步成为生物制造领域的重要工具。本研究将酿酒酵母与重组大肠杆菌的无细胞提取物联用，利用酵母乙醇发酵过程中产生的ATP驱动烟酰胺单核苷酸（NMN）的合成，实现了NMN与乙醇的同步生产。在优化条件下，NMN产量达到1.5 mM，较单独使用大肠杆菌无细胞酶提高2.7倍；乙醇产量达到0.45 g/L，较单独使用酵母酶提高1.6倍。该策略展示了在单一无细胞体系中整合多条代谢通路的可行性。
研究背景
无细胞酶系统已被用于制造药物和可再生化学燃料长达数百年，其相较体内技术的优势包括级联组装的简化、反应条件的灵活性、以及可直接监测和控制反应进程。此外，无细胞酶系统能避免生物合成过程中有害中间产物的生成。其模块化设计可实现高性能应用的高效原型构建，为全细胞生物合成提供了替代方案，并能促进设计-构建-测试循环，在无需改造生物体的情况下增强代谢工程策略。然而，无细胞酶系统在生物生产中的规模化实施仍是工业挑战。
酵母是能够从多种原料生产乙醇的重要微生物。传统乙醇生产技术虽经广泛研究，但常受高成本和环境问题困扰，利用葡萄糖等简单碳源也面临诸多限制。近年来，NMN作为重要生物代谢物受到广泛关注，其酶法合成路径依赖于ATP和磷酸核糖焦磷酸（PRPP）等辅因子。将酵母的乙醇发酵通路与NMN合成通路在无细胞层面整合，有望实现辅因子的高效利用与多种产物的联产。
研究方法
2.1 化学试剂与培养基
研究使用的试剂包括：酵母麦芽肉汤（YM broth，Kisan Bio，韩国）、葡萄糖（Samchun Company，韩国）、Luria-Bertani肉汤（LB broth，Kisan Bio，韩国）、HEPES（Sigma-Aldrich，韩国）、NaCl（Samchun Company，韩国）、HCl（Duksan General Science，韩国）、NAM（烟酰胺，Samchun Company，韩国）、D-核糖（Best naturals，美国）、95%乙醇（Emsure，德国）、乳糖（Junsei，日本）以及NMN标准品（Prohealth Longevity Company，美国）。
【数据】试剂来源：Kisan Bio/Samchun/Sigma-Aldrich/Duksan/Best naturals/Emsure/Junsei/Prohealth Longevity；纯度：原文未详述
2.2 微生物菌株、质粒与引物信息
本研究使用重组大肠杆菌BL21（DE3）菌株，该菌株经基因工程改造以表达NAMPT-PRPS1-PRPS2基因。携带NMN生物合成基因的pET21b质粒通过PCR扩增获得，所用引物为：NAMPT正向引物GCGGCTAGCATGAATCCTGCGG，PRPS1反向引物GCGGTCGACTAAAGGGACATGGC，PRPS2反向引物GCGCTCGAGTAGCGGGACATGG。质粒含有氨苄青霉素抗性基因及其启动子调控序列，具体构建方法参照先前文献[28]。
【数据】菌株：重组大肠杆菌BL21(DE3)；质粒：pET21b；抗性标记：氨苄青霉素；引物序列：已列出
2.3 无细胞酶的制备
酿酒酵母在含2%葡萄糖作为碳源的YM肉汤中，于30°C、200 rpm振荡培养24小时。过夜培养后，细胞在15,000 rpm、4°C条件下离心10分钟收集，分离上清液与细胞沉淀。细胞沉淀随后重悬于裂解缓冲液（50 mM HEPES、500 mM NaCl，pH 7.5）中，超声处理4分钟（50秒循环后间隔10秒），酶液通过15,000 rpm、4°C离心5分钟提取获得。
重组大肠杆菌BL21（DE3）在含75 µg/ml氨苄青霉素的LB肉汤中、37°C条件下培养。当600 nm处光密度达到0.4–0.6时，加入1%乳糖诱导，继续培养6小时。随后细胞在15,000 rpm、4°C条件下离心10分钟收获，分离上清液与细胞沉淀。细胞沉淀重悬于含50 mM HEPES和500 mM NaCl（pH 7.5）的裂解缓冲液中，超声处理后离心提取酶液。
【数据】酵母培养：YM肉汤+2%葡萄糖，30°C，200 rpm，24h；离心：15,000 rpm，4°C，10min；裂解缓冲液：50 mM HEPES+500 mM NaCl，pH 7.5；超声：4min（50s循环+10s间隔）；大肠杆菌培养：LB肉汤+75 µg/ml氨苄青霉素，37°C；诱导：1%乳糖，OD600 0.4–0.6，6h；离心：15,000 rpm，4°C，10min
2.4 SDS-PAGE分析
酵母和重组大肠杆菌细胞超声提取的酶液采用10%聚丙烯酰胺梯度凝胶进行SDS-PAGE分析。以Bio-Rad Precision Plus Protein™ Dual Color梯状标记（10–250 kDa范围）作为参照，蛋白条带经Bio-Safe™考马斯亮蓝G-250染色液（Bio-Rad）染色后可视化。
【数据】凝胶浓度：10%聚丙烯酰胺梯度胶；分子量标记范围：10–250 kDa；染色：Bio-Safe™ Coomassie G-250
2.5 乙醇与NMN的共生产
通过评估不同无细胞酶浓度和NAM浓度的影响，考察了无细胞酶生产NMN和乙醇的效果。各溶液在1.5 ml Eppendorf管中等量混合补充物（1 ml体积），于30°C、200 rpm振荡孵育8小时。每个反应混合物含不同浓度的无细胞酶（1、2.5、3.5和5 g/L），并添加葡萄糖（1%）、核糖（1%）、镁离子（1 mM）、磷酸根离子（1 mM）以及不同浓度的NAM（0.25%、0.5%、0.75%和1%），另有说明的除外。最终样品采用高效液相色谱（HPLC）分析。
【数据】反应体积：1 ml；温度：30°C；时间：8h；转速：200 rpm；酶浓度：1/2.5/3.5/5 g/L；葡萄糖：1%；核糖：1%；镁离子：1 mM；磷酸根离子：1 mM；NAM浓度：0.25/0.5/0.75/1%
2.6 分析方法
酵母和重组大肠杆菌细胞经超声提取的总蛋白量采用Bradford法测定，以牛血清白蛋白作为标准[26]。反应结束后，反应混合物经0.2 µm针头式过滤器过滤，转移至HPLC进样瓶进行分析。
NMN产量参照Marinescu等[29]的方法并略作修改进行定量。10 µl过滤样品注入配备Eclipse plus C18色谱柱（5 µm，4.6 × 250 mm）的HPLC系统（YL 9100，Younglin Inc.，韩国）。流动相为10%乙腈，以1 ml/min流速等度洗脱4分钟。紫外吸收光谱在260 nm处记录，柱温固定为35°C。制备1 mM外标NMN标准储备液，稀释至0.1至0.5 mM之间的五个不同浓度。利用260 nm色谱图中的NMN峰面积通过回归生成校准曲线，用于NMN定量。
发酵过程中乙醇产量采用配备Bio-Rad Aminex HPX-87H色谱柱（Hercules，CA，美国）和示差折光检测器的HPLC测定。流动相为含5 mM H2SO4的HPLC水，以0.6 ml/min流速等度洗脱25分钟，柱温维持在65°C[2]。乙醇峰面积参照乙醇标准品计算。
【数据】Bradford法：BSA为标准；HPLC系统：YL 9100；NMN色谱柱：Eclipse plus C18（5 µm，4.6 × 250 mm）；流动相：10%乙腈；流速：1 ml/min；洗脱时间：4min；检测波长：260 nm；柱温：35°C；进样量：10 µl；标准曲线范围：0.1–0.5 mM；乙醇色谱柱：Aminex HPX-87H；流动相：5 mM H2SO4；流速：0.6 ml/min；洗脱时间：25min；柱温：65°C
研究结果
3.1 酵母与重组大肠杆菌BL21（DE3）无细胞体系的开发
玻璃珠法和探头超声法等多种技术已被用于提取细胞蛋白。无细胞提取过程通过施加外力破坏细胞结构，有效崩解细胞膜并促进蛋白提取。常规发酵过程中，ATP和NADH（图1）发挥重要作用，它们的缺失会阻碍反应启动并扰乱整个发酵过程。定量评估显示，无细胞酶体系含有足量的这些辅因子，有利于体系构建。
如图2所示，从携带NMN合成基因的重组大肠杆菌BL21（DE3）中分离的无细胞酶利用ATP作为辅因子合成NMN。该图说明磷酸戊糖途径通过磷酸核糖焦磷酸合成酶（PRPS）从核糖产生PRPP，随后限速酶NAMPT将NAM转化为NMN。本研究提出了基于单细胞的NMN生产方法，有效整合了所有必要的发酵组分。
【数据】辅因子：ATP、NADH；PRPP合成：PRPS酶催化；NMN合成：NAMPT催化NAM转化
3.2 无细胞溶液中糖酵解与NMN合成酶的评估
蛋白质（酶）在生物代谢物合成中的重要作用无需赘述。鉴定参与特定生物过程的蛋白质是关键步骤。在多肽分析方法中，凝胶电泳是最常用的基于电荷和质量分离肽段的技术。无细胞过程中，多种参与糖酵解和发酵的酶发挥重要作用，理解这些酶对整体认识该过程至关重要。
研究采用SDS-PAGE分析鉴定酵母糖酵解和发酵酶，以及重组大肠杆菌BL21（DE3）的NMN合成酶。首先，携带NAMPT-PRPS1-PRPS2的酵母和重组大肠杆菌BL21（DE3）无细胞溶液在探头超声提取后经SDS-PAGE分析，显示约105 kDa大小的条带，与重组基因NAMPT-PRPS1-PRPS2对应（图3）。酵母细胞利用糖酵解和发酵两条途径将葡萄糖转化为生物乙醇，正常条件下涉及10种糖酵解酶和2种发酵酶。此外，对于NMN合成，重组大肠杆菌BL21（DE3）的NAMPT-PRPS1-PRPS2通过补救途径利用NAM（如图2所示）。NAM向NMN的转化证明了NAMPT-PRPS1-PRPS2（分子量105 kDa）的存在（图3）。
【数据】目标蛋白分子量：约105 kDa（NAMPT-PRPS1-PRPS2）；酵母发酵酶：10种糖酵解酶+2种发酵酶
3.3 无细胞酶浓度对NMN生产的影响
本研究的主要目标是开发一种无需活细胞即可进行发酵的系统。为此，我们利用无细胞酶体系生产NMN。在提取无细胞酶后，等体积的无细胞酶、葡萄糖和NAM补充物被加入反应体系。无细胞酶的水平对NMN的生成至关重要。
当使用1 g/L的低蛋白浓度时，仅使用重组大肠杆菌无细胞酶在0.5% NAM条件下最大获得0.08 mM NMN（图4a），随着NAM浓度的增加，NMN产量随后下降（图4a）。相比之下，当酵母和重组大肠杆菌的无细胞酶联合使用时，6小时后NMN产量略高，达到0.09 mM（图4b）。当NAM浓度增加到0.75%时，获得0.06 mM NMN（图4b）。
值得注意的是，当蛋白含量增加到2.5 g/L时，单独使用大肠杆菌无细胞酶在0.5% NAM存在下NMN产量升至0.1 mM（图4c）。然而，当NAM浓度增加到0.75%时，NMN产量下降（图4c）。当两种无细胞酶联合使用时，在0.5%和0.75% NAM存在下，NMN产量分别显著增加至0.9 mM（图4d）和0.8 mM（图4d）。
此外，当施加3.5 g/L蛋白时，单独使用大肠杆菌无细胞酶在0.5% NAM条件下获得0.13 mM NMN，0.75% NAM条件下获得0.05 mM NMN（图4e）。相比之下，两种无细胞酶联合使用时，在0.5% NAM存在下达到1 mM NMN（图4f）。
类似地，当施加5 g/L蛋白浓度时，单独使用大肠杆菌无细胞酶在0.5% NAM条件下产生0.5 mM NMN，而在0.75% NAM条件下获得0.15 mM NMN（图4g）。两种无细胞酶联合使用时，达到1.5 mM NMN（图4h），在0.75% NAM存在下略降至1 mM（图4h）。
蛋白浓度的增加导致NMN产量增加，这归因于发酵过程中ATP快速水解为ADP。这一过程由无细胞裂解液中的ATPase活性驱动，最终导致NMN产量增加，因为NMN的合成依赖ATP。在两种裂解液同时存在时，酿酒酵母无细胞裂解液首先利用葡萄糖进行乙醇生产，释放细胞ATP，随后大肠杆菌无细胞裂解液通过补救途径利用该ATP进行NMN生产（如图2所示）。然而，当单独使用各无细胞裂解液时，NMN产量较低，因为糖酵解和补救途径相互独立，缺乏可供进一步转化为NMN的ATP。
值得注意的是，野生型酿酒酵母无细胞裂解液因含有NMN合成酶也能产生NMN。重要的辅因子PRPP在酿酒酵母中分为五种类型，这增强了NMN合成所必需的磷酸根离子的可用性。在发酵过程中，酿酒酵母代谢葡萄糖产生ATP。该ATP作为NMN合成的前体，对嘌呤、嘧啶和吡啶核苷酸（包括NAD+和NADP+）的从头合成和补救途径均至关重要。此外，酿酒酵母中由ado1基因编码的腺苷激酶（EC 2.7.1.20）能以ATP为能量来源催化腺苷磷酸化为AMP。
这些结果表明，无细胞体系的NMN产量效率随无细胞酶浓度的增加而提高（表1）。
【数据】1 g/L酶：单酶0.08 mM NMN（0.5% NAM），联合0.09 mM NMN（6h）；2.5 g/L酶：单酶0.1 mM，联合0.9 mM（0.5% NAM）/0.8 mM（0.75% NAM）；3.5 g/L酶：单酶0.13 mM（0.5% NAM）/0.05 mM（0.75% NAM），联合1 mM（0.5% NAM）；5 g/L酶：单酶0.5 mM（0.5% NAM）/0.15 mM（0.75% NAM），联合1.5 mM（0.5% NAM）/1 mM（0.75% NAM）
3.4 底物浓度对NMN生产的影响
NMN的产量水平随底物浓度的不同而变化。值得注意的是，底物浓度的增加会导致产量下降。如图4a所示，使用0.5% NAM时最大获得0.08 mM NMN。类似地，当联合使用无细胞酶并在0.5% NAM存在下，产生0.1 mM NMN（图4b）。相比之下，当使用1% NAM时，单独使用和联合使用两种无细胞酶分别仅产生0.05 mM和0.06 mM NMN（图4a和图4b）。此外，使用0.5%和1% NAM时分别达到1.5 mM和0.6 mM NMN（图4h）。
无论蛋白浓度如何，NAM浓度的增加始终导致NMN产量下降。值得注意的是，高浓度NAM表现出毒性行为。这不仅影响酶促水解的初始速率和产率，显著降低水解速率，还降低了产物得率。此外，随着NAM浓度的增加，NAM消耗量减少，这可归因于生化反应中酶和底物的相对浓度。
【数据】0.5% NAM：最大产量（各酶浓度下均最优）；1% NAM：单酶0.05 mM，联合0.06 mM（1 g/L酶），联合0.6 mM（5 g/L酶）；高NAM浓度：表现毒性，降低水解速率和产物得率
3.5 无细胞酶生产乙醇
在NMN生产过程中，乙醇作为酵母无细胞酶利用的副产物同时产生。在发酵过程中，葡萄糖首先被转化为……
【数据】乙醇：酵母无细胞酶代谢葡萄糖的副产物
讨论与解读
本研究提出了一种利用无细胞体系生产NMN和乙醇的有效策略，有潜力克服传统发酵方法的局限性。该策略的核心原理是利用酿酒酵母在乙醇发酵过程中产生的ATP，在NAM作为底物、葡萄糖和核糖共存条件下驱动NMN的合成。两种无细胞酶同时存在时，NMN产率随无细胞酶浓度的增加而提高。使用重组大肠杆菌和酵母的联合无细胞酶时，NMN最大产量为1.5 mM，较单独使用重组大肠杆菌无细胞酶的0.55 mM提高了2.7倍。乙醇产量也从仅使用酵母无细胞酶时的0.285 g/L增加至联合使用时的0.45 g/L。该研究证明了在单一无细胞体系中整合多条代谢通路的可行性，为开发更高效、更可持续的生物生产过程提供了参考。
编译者解读
该研究的亮点在于巧妙利用酵母乙醇发酵通路内源产生的ATP驱动NMN合成，实现"一碳两用"——葡萄糖同时作为乙醇合成的底物和ATP再生的能源。这种跨物种无细胞酶联用策略避免了外源ATP补加的成本负担，在合成生物学应用层面具有实际价值。方法上的关键创新是省去了通路重构的菌株工程步骤，直接用野生型酵母裂解液承担辅因子再生功能。不过，1.5 mM的NMN产量距工业化水平仍有距离，且高浓度NAM的底物抑制问题尚未充分解决。后续若能在反应器层面实现ATP的持续再生或引入辅因子循环系统，该平台向规模化迈进的潜力值得期待。
参考来源
Maharjan A. Cell-free biocatalysis for co-production of nicotinamide mononucleotide and ethanol from Saccharomyces cerevisiae and recombinant Escherichia coli. Enzyme and Microbial Technology, 2025. DOI: 10.1016/j.enzmictec.2025.110585
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2025.110585