来源：Efficient whole-cell biocatalytic production of 7α-hydroxy-4-cholesten-3-one via human CYP7A1 expressed in Escherichia coli（The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular ）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
胆汁酸合成途径中的限速酶——人源细胞色素P450酶CYP7A1——一直难以在微生物宿主中实现功能性表达。本研究通过N端截短、密码子优化、分子伴侣共表达及双表达策略的系统组合，成功构建了共表达CYP7A1与细胞色素P450还原酶(CPR)的大肠杆菌全细胞催化平台。优化后的Rosetta(DE3)-pET-tCYP7A1-tCPR菌株在羟丙基-β-环糊精和多黏菌素B的辅助下，实现了7α-羟基-4-胆甾烯-3-酮(7α-HCO)日产量118.3 mg·L⁻¹·d⁻¹、纯度>98%的合成效率，并首次建立了基于人源CYP7A1的微生物7α-HCO合成体系。
研究背景
细胞色素P450酶(CYPs)是一类含血红素、功能多样的超家族酶，能够催化化学惰性C–H键的区域及立体选择性氧化。在哺乳动物中，CYPs对类固醇生成、胆汁酸生物合成及外源物代谢至关重要。其中，CYP7A1催化经典胆汁酸合成途径中胆固醇的7α-羟化限速反应，在维持胆固醇稳态及调控脂质和葡萄糖代谢中发挥核心作用。CYP7A1活性异常与高胆固醇血症、2型糖尿病及非酒精性脂肪肝病等代谢疾病密切相关。CYP7A1催化的直接产物7α-HCO不仅是初级胆汁酸的关键前体，也是胆汁酸合成缺陷的诊断生物标志物。化学合成路线虽已建立，但通常涉及多步反应和苛刻条件，立体选择性和总收率有限。酶法和微生物策略作为替代方案受到关注，但人源CYP7A1的微生物异源表达面临诸多挑战——其疏水性N端跨膜区、对CPR电子传递的依赖及溶解性差等问题，长期制约着该酶的微生物应用。
研究方法
2.1 质粒构建
编码人源CYP7A1(NM_000780.4)和CPR(NM_001395413.1)的密码子优化基因由武汉淼灵生物科技有限公司合成。为提高在大肠杆菌中的表达和溶解性，去除CYP7A1的N端24个氨基酸，并替换为编码MAKKTSS的序列。同时，使用CPRΔ1−27或全长CPR作为最终电子供体。质粒构建采用两种共表达策略（图1）：第一种设计将CYP7A1和CPR组装在pET-17b载体的双顺反子转录单元中，两基因通过核糖体结合位点(RBS)连接，由单一T7启动子驱动表达；第二种设计使用pRSFDuet-1载体构建双启动子系统，CYP7A1和CPR分别插入MCS1和MCS2，各自由独立的T7lac启动子及其自身RBS驱动。质粒图谱和详细特征分别见Figure S1和Table S1。质粒通过标准热激转化法转入E. coli DH5α感受态细胞。重组菌落于含适当抗生素的LB琼脂上筛选，并通过菌落PCR验证(Table S2)。阳性克隆经DNA测序确认，质粒提取使用无内毒素质粒提取试剂盒(天根生化科技有限公司，中国)。
2.2 菌株转化
为构建共表达系统，先将编码groES-groEL的伴侣质粒pGro7(氯霉素抗性)或pGro12(卡那霉素抗性)通过热激转化法转入E. coli菌株C41(DE3)、C43(DE3)、Rosetta(DE3)、GSsetta(DE3)和BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL中(图2)。转化子于含氯霉素(34 µg/mL)或卡那霉素(50 µg/mL)的LB琼脂平板上筛选，具体取决于质粒类型。随后，将CYP7A1/CPR表达质粒(pET-17b或pRSFDuet-1衍生物)导入含伴侣质粒的菌株中，构建双转化子。共转化子于含适当抗生素（氨苄青霉素100 µg/mL、氯霉素34 µg/mL或卡那霉素50 µg/mL）的LB琼脂上筛选以维持两种质粒。感受态细胞采用标准CaCl₂方法制备或购自全式金生物(中国)。热激转化条件为42°C、60秒，随后于无抗生素LB培养基中37°C恢复1小时。阳性菌落使用CYP7A1和CPR特异性引物通过菌落PCR确认。验证后的克隆保存于20%(v/v)甘油中，−80°C冻存备用。
2.3 蛋白表达与SDS-PAGE分析
双转化子在含适当抗生素的LB琼脂平板上划线，37°C过夜培养。挑取单菌落接种于LB培养基，37°C、220 rpm过夜培养。种子培养物以1:100比例稀释于含抗生素的Terrific Broth中，37°C、220 rpm培养至OD₆₀₀达到0.5。此时加入1 mM 5-氨基乙酰丙酸(血红素前体)和4 mg/mL L-阿拉伯糖(诱导groES-groEL表达)。当OD₆₀₀达到约0.8时，加入1 mM IPTG诱导CYP7A1和CPR表达。培养物于27.5°C、180 rpm继续培养24小时。SDS-PAGE分析时，取50 μL培养物于5000 rpm、4°C离心10分钟，沉淀用50 μL PBS重悬。加入等体积2×上样缓冲液，沸水浴加热10分钟，随后13,000 rpm离心10分钟。取10 μL上清上样于8% SDS-PAGE凝胶，电泳条件为：10 V预跑30分钟，浓缩胶80 V，分离胶120 V。凝胶经考马斯亮蓝染色以观察目标蛋白表达。
2.4 全细胞生物催化测定
表达截短CYP7A1和CPR的重组大肠杆菌菌株按上述方法培养和诱导。细胞经离心收集(6000 rpm、4°C、10分钟)，用50 mM磷酸钾缓冲液(pH 7.4)洗涤两次，重悬于反应缓冲液(50 mM磷酸盐缓冲液、2%甘油、1 mM IPTG、1 mM 5-氨基乙酰丙酸、4 mg/mL L-阿拉伯糖)中。细胞密度调至25 g湿细胞重(WCW)/L。胆固醇储备液通过将胆固醇溶解于室温下的45%(w/v)羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)中制备。如指示，向反应缓冲液中加入多黏菌素B(32 μg/mL)以增强细胞膜通透性、促进底物摄取。生物转化反应在1.5 mL微量离心管中进行，含450 μL细胞悬液和25 μL胆固醇储备液。反应于27.5°C、180 rpm振荡培养24小时。为将中间产物7α-羟基胆固醇氧化为7α-HCO，向各反应中加入胆固醇氧化酶(终浓度1 U/mL)和胆酸钠(终浓度0.2%)，随后37°C孵育1小时。加入1 mL乙酸乙酯终止反应。样品充分涡旋振荡，室温下12,000 × g离心5分钟。收集有机相，减压蒸发至干，用50 μL HPLC流动相复溶后进行分析。
2.5 反相高效液相色谱(RP-HPLC)
类固醇底物和产物采用RP-HPLC分析。分离在Gensial C18色谱柱(4.6 × 150 mm，3 μm粒径)上进行，柱温37°C。流动相为乙腈:甲醇(70:30，v/v)等度洗脱，流速0.7 mL/min。使用二极管阵列检测器在240 nm波长下检测。通过与标准品的保留时间比较进行化合物鉴定。定量基于纯类固醇标准品制备的外标校准曲线。
2.6 7α-HCO生物合成条件优化
利用工程大肠杆菌生物催化生产7α-HCO的流程如图3所示。选择重组菌株Rosetta(DE3)-pET-tCYP7A1-tCPR进行生物转化参数的系统优化，以最大化7α-HCO产量。静息细胞按上述方法制备，离心收集(6000 × g、10分钟、4°C)，重悬于反应缓冲液(50 mM磷酸钾，pH 7.4)中，补充2%甘油、1 mM IPTG、1 mM 5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)和4 mg/mL L-阿拉伯糖。细胞密度分别调至15、25或35 g湿细胞重(WCW)/L，以评价静息细胞浓度对催化性能的影响。胆固醇储备液(5–17 mM)于室温下在45%(w/v)HP-β-CD中制备。通过加入胆固醇至终浓度250、350、450、750或850 μM启动生物转化反应。测定在1.5 mL微量离心管中进行，总反应体积0.5 mL，于27.5°C、180 rpm振荡孵育。在设定时间点(4、10、16、24和30小时)取样监测7α-HCO形成动力学。每组实验设三次重复。反应通过加入1 mL乙酸乙酯终止，随后充分涡旋振荡并离心(12,000 × g、5分钟、室温)。收集有机相，减压蒸发，用50 μL HPLC流动相复溶分析。转化率和7α-HCO浓度通过RP-HPLC测定，使用标准品构建校准曲线(R² > 0.99)。随后将最优反应条件应用于放大生物转化，制备足量7α-HCO用于纯化和结构表征。
2.7 产物纯化与结构表征
（原文该部分后续内容未在节选中完整呈现，具体操作细节原文未详述。）
研究结果
3.1 CYP7A1表达质粒的构建与验证
为构建基于大肠杆菌的人源CYP7A1及其氧化还原伴侣CPR共表达全细胞系统，采用两种表达策略构建共表达质粒：基于pET-17b的载体，携带含双顺反子转录单元的T7启动子；以及pRSFDuet-1衍生载体，在两个多克隆位点(MCS)中含双启动子。密码子优化的CYP7A1基因经N端截短(Δ24残基)以增强溶解性和表达，CPR则构建为全长和截短(Δ27残基)两种形式。重组质粒转化入E. coli DH5α，阳性克隆通过菌落PCR筛选。如图4所示，所有筛选菌落均观察到CYP7A1预期的213 bp扩增片段，确认靶基因成功插入。这些验证后的质粒被用于转化多种表达宿主进行后续研究。
3.2 重组大肠杆菌菌株的构建与表达
为获得tCYP7A1的高效表达菌株，对五种大肠杆菌宿主菌株(C41(DE3)、C43(DE3)、BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL、Rosetta(DE3)和GSsetta(DE3))进行工程改造，使其共表达大肠杆菌伴侣蛋白GroEL/ES以及tCYP7A1和全长或截短CPR。共构建12株重组菌株：10株基于pET-17b载体，2株基于pRSFDuet-1载体(Table S3)。SDS-PAGE分析(图5)显示与tCYP7A1(56.7 kDa)、CPR(70–78 kDa)和GroEL(57.3 kDa)对应的清晰蛋白条带。在pET-17b构建体(Lanes 1–1至1–5和2–1至2–5)中，Rosetta(DE3)、BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL和GSsetta(DE3)显示出显著的tCYP7A1表达，而C41(DE3)和C43(DE3)条带弱得多，部分情况下几乎不可检测。相比之下，CPR表达在大多数pET-17b菌株中相对较弱，但在pRSFDuet-1系统(Lanes 3–1和3–2)中更为可见，这与独立启动子调控的优势一致。值得注意的是，截短CPR变体(第2组)通常比全长CPR构建体(第1组)表现出更强的条带，支持CPR截短对表达的积极效应。有趣的是，GroEL表达与tCYP7A1水平呈反向变化。例如，在Rosetta(DE3)和BL21-CodonPlus(DE3)菌株(Lanes 1–3、1–4、2–3和2–4)中，强tCYP7A1条带与较弱的GroEL信号同时出现，提示伴侣蛋白与目标蛋白之间存在翻译资源竞争。综上，宿主背景和质粒设计均显著影响CYP7A1/CPR在大肠杆菌中的共表达。基于pET-17b的双顺反子构建体在Rosetta(DE3)、BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL和GSsetta(DE3)中产生最强的tCYP7A1表达，而双启动子系统改善了CPR表达但未同等程度增强CYP7A1。
3.3 RP-HPLC方法的建立
为建立监测CYP7A1介导生物转化的分析方法，对胆甾烯酮及其羟基化产物7α-HCO进行紫外光谱扫描。如图6所示，两种化合物在240 nm处均显示紫外吸收最大值。在等度洗脱条件(乙腈:甲醇=70:30)下，胆甾烯酮和7α-HCO的保留时间分别为25.699分钟和9.569分钟，分离度良好。基于以上结果并结合文献[14]，RP-HPLC条件确定如下：Gensial C18色谱柱(4.6 × 150 mm；3 μm)，流速0.7 mL/min，柱温37°C，进样量10 μL，紫外检测波长240 nm。
3.4 重组菌株的全细胞生物催化活性
以胆固醇为底物评价共表达tCYP7A1和CPR的重组大肠杆菌菌株的全细胞生物催化活性。为提高底物摄取，评估了膜通透剂和增溶剂的影响。如图7A所示，添加多黏菌素B(32 μg/mL)使胆固醇转化率从42.99 ± 2.65%(对照)显著提高至60.96 ± 1.83%(P < 0.01)，而EDTA(20 mM)将转化效率降低至37.32 ± 1.25%(P < 0.05)，可能归因于细胞膜完整性受损。接下来评估增溶剂对胆固醇可用性的影响(图7B)。HP-β-CD(45%)有效促进胆固醇增溶，转化率达61%(P < 0.01)。相比之下，HP-β-CD与Quillaja皂苷的组合使转化效率显著降低至28.6 ± 2.4%，单独使用乙醇几乎无转化(<1%)，表明仅HP-β-CD提供了与大肠杆菌系统兼容的合适增溶环境。在优化条件(32 μg/mL多黏菌素B和45% HP-β-CD)下，比较了12株重组菌株的全细胞生物催化活性(图7C)。Rosetta-pET-tCYP7A1-tCPR展现出最高的胆固醇转化效率(约86.8%，P < 0.01)。相反，基于C41(DE3)和C43(DE3)的菌株活性极低(<1%)，与SDS-PAGE分析中观察到的较低CYP7A1表达水平相关。此外，表达截短CPR(Δ27)的菌株转化率约为表达全长CPR菌株的两倍。综上，通过膜通透化、胆固醇增溶和合理的宿主/载体选择的联合应用，胆固醇转化效率可显著提高。Rosetta(DE3)与中拷贝质粒pET-17b-tCYP7A1-tCPR的组合被确定为在大肠杆菌中功能性表达CYP7A1及生物合成7α-HCO的最优全细胞催化系统。
3.5 底物浓度、静息细胞密度和反应时间的优化
为提高7α-羟化效率并最大化7α-HCO产量，通过考察底物浓度、静息细胞密度和反应时间的影响对生物转化条件进行优化。首先，使用45% HP-β-CD作为增溶剂，测试不同胆固醇浓度(250、350、450、750和850 μM)。如图8A所示，7α-HCO产量随底物浓度增加至450 μM而提高，在24小时达到最大产量283.1 ± 1.3 μM。然而，更高胆固醇浓度(750和850 μM)导致产物形成急剧下降，提示过量底物存在底物抑制或毒性效应。这一趋势在图8B中得到清晰展示，450 μM胆固醇产生最高的最终产物积累。因此，确定450 μM为后续实验的最佳底物浓度。接下来，评估静息细胞密度对生物转化的影响(图8C)。将细胞密度从15 g/L提高至25 g/L使7α-HCO产量几乎翻倍。进一步将细胞密度提高至35 g/L仅带来17.5%的产量提升，可能无法抵消额外的培养成本。因此，选择25 g/L作为最佳静息细胞密度。时间进程分析显示，7α-HCO产量在最初16–24小时内稳步增加后趋于平稳，表明24小时反应时间足以实现最大转化。
3.6 7α-HCO的结构表征
为验证7α-HCO的同一性和纯度，进行了NMR和LC-MS分析。重组菌株Rosetta-pET-tCYP7A1-tCPR在优化条件下培养，使用25 g/L静息细胞进行胆固醇(450 μM)的全细胞生物催化。经24小时生物转化和额外1小时胆固醇氧化酶反应后，产物经提取、HPLC纯化并进行结构分析。纯化7α-HCO的产量达118.3 mg·L⁻¹·d⁻¹，纯度>98%。¹H-NMR谱(400 MHz, CDCl₃)显示特征信号，包括一个烯烃质子信号（化学位移和多重性与文献报道一致）。¹³C-NMR谱(101 MHz, CDCl₃)确认了7α-HCO的碳骨架结构。
讨论与解读
本研究建立了基于大肠杆菌的稳健全细胞生物催化系统，实现人源CYP7A1及其氧化还原伴侣CPR的功能性共表达，从而完成胆固醇的立体选择性7α-羟化及7α-HCO的高效生物合成。据作者所知，这是首次利用人源细胞色素P450单加氧酶系统实现7α-HCO微生物生产的报道。与传统化学或半合成路线相比——后者需要多步反应且立体选择性和收率较低——本研究的生物催化方法实现了简化的两步转化，凸显其作为类固醇修饰的成本效益高且环境友好替代方案的潜力。哺乳动物微粒体CYP在 prokaryotic 宿主中的异源表达因疏水性N端跨膜区、对CPR介导电子传递的依赖性及溶解性差而固有困难。本研究通过理性基因工程(N端截短)、密码子优化和双表达策略的组合应对这些瓶颈。值得注意的是，pET-17b中的双顺反子系统在E. coli Rosetta(DE3)中的CYP7A1/CPR共表达优于pRSFDuet-1双启动子系统，而GroES-GroEL伴侣辅助折叠对实现功能性酶生产至关重要。
编译者解读：从合成生物学应用视角看，该研究的核心价值在于系统性地拆解了"人源膜蛋白在微生物中功能表达"这一经典难题——通过N端截短解决膜锚定问题、伴侣共表达解决蛋白折叠瓶颈、双顺反子设计平衡两个基因的剂量关系，每一步都是可迁移的通用策略。值得注意的是，该工作选择了中拷贝pET载体而非高拷贝系统，避免了过量表达带来的代谢负担，这一细节体现了对宿主生理状态的精细考量。118.3 mg·L⁻¹·d⁻¹的产量虽在工业尺度上仍有提升空间，但作为首次概念验证已具说服力。未来可探索的方向包括：定向进化提高CYP7A1的催化效率、利用非天然辅因子再生系统降低对CPR的依赖、以及在连续流反应器中放大生产。该体系还可直接应用于CYP7A1抑制剂的高通量筛选和药物代谢研究，具有明确的转化潜力。
参考来源
Shang Q. Efficient whole-cell biocatalytic production of 7α-hydroxy-4-cholesten-3-one via human CYP7A1 expressed in Escherichia coli. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 2026. DOI: 10.1016/j.jsbmb.2025.106866
DOI: 10.1016/j.jsbmb.2025.106866