来源：Efficient production of 3,6-anhydro-l-galactose from red algal neoagarobiose by whole-cell biocatalysis of recombinant Corynebacterium glutamicum（Food Research International）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
红藻中的琼脂难以被直接降解为单糖，而其重复单元新琼脂二糖（NAB）可被α-新琼脂二糖水解酶（NABHase）分解为具有抗龋齿和美白活性的3,6-脱水-L-半乳糖（AHG）。本研究构建了表达来源于S. degradans的NABHase的重组谷氨酸棒状杆菌CG-H4-NABH，通过补料分批发酵获得71.8 g/L干细胞和58.9 U/mL酶活。甲苯通透化处理使全细胞活性提高37倍，固定化细胞经七轮重复反应后，NAB水解速率和累积AHG浓度分别达到游离细胞的3.6倍和1.6倍。
研究背景
海洋生物质在自然界中储量丰富，但由于其结构特性难以被分解为单糖。代表性红藻Gelidium amansii是亚洲常见的食物资源，由琼脂糖（直链型）和琼脂胶（支链型）组成，其重复单元为含有半乳糖和AHG的NAB二糖。AHG具有抗龋齿、皮肤保湿和美白等多种生理活性，被视为食品和化妆品领域的功能性生物材料。相比使用强酸的纯化学法，酶法与化学预处理结合的杂合法具有更高的产率和更易纯化的优势。在此类水解过程中，琼脂经化学预处理（酸碱缓冲液水热处理切割α-1,3-键）解聚为琼脂寡糖（AOSs），β-琼脂酶II进一步将AOSs分解为NAB和琼脂三糖。为实现从NAB高效生产AHG，本研究开发了基于重组谷氨酸棒状杆菌的全细胞催化体系，以替代传统酶法工艺。
研究方法
2.1 菌株与质粒
以谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032作为表达宿主菌，表达来源于S. degradans 2–40（ATCC 43961）的nabh基因。E. coli TOP10（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）用于基因操作。nabh基因的表达受谷氨酸棒状杆菌/大肠杆菌穿梭载体pCES208系列中多种组成型启动子的调控。本研究所用全部菌株和质粒列于表1。nabh基因（EMBL ID ABD81917）通过聚合酶链式反应（PCR）从S. degradans 2–40基因组DNA扩增获得，正向引物序列为CGGGATCCATGAGCGATTCAAAAGTAAATAAAAAATTGAG，反向引物序列为ATTTGCGGCCGCTTATACTGCTCCGGAATCGCCTG，其中下划线核苷酸分别表示BamHI和NotI限制性内切酶的识别位点。PCR产物经BamHI和NotI双酶切后，连接至经相同限制性内切酶处理的pCES208系列质粒，构建表达nabh的重组质粒。所有构建的质粒均经DNA测序验证（Sanigen Co., Anyang, Korea）。重组质粒通过电穿孔法转化至谷氨酸棒状杆菌，使用电穿孔仪（Genepulser Xcell, Bio-Rad, Hercules, CA, USA）。
【数据】宿主菌：C. glutamicum ATCC 13032；基因来源：S. degradans 2–40（ATCC 43961）；克隆宿主：E. coli TOP10；限制性位点：BamHI/NotI；转化方法：电穿孔
2.2 培养条件
大肠杆菌在Lysogeny broth（LB）培养基（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl）中培养，添加50 mg/L卡那霉素作为筛选标记。谷氨酸棒状杆菌的转化和种子培养使用含25 μg/mL卡那霉素的Brain-Heart Infusion（BHI, ref.237500, BD, Franklin Lakes, NJ, USA）培养基。重组谷氨酸棒状杆菌的批次培养在500 mL带挡板摇瓶（Nalgene, Rochester, NY, USA）中进行，装液量100 mL CGXII极限培养基，培养条件为30°C、250 rpm。CGXII培养基成分为：20 g/L (NH4)2SO4、5 g/L尿素、1 g/L KH2PO4、1 g/L K2HPO4、0.25 g/L MgSO4·7H2O、42 g/L 3-吗啉丙磺酸、0.01 g/L CaCl2、0.01 g/L FeSO4·7H2O、0.01 g/L MnSO4·H2O、1 mg/L ZnSO4·7H2O、20 mg/L CuSO4、200 mg/L NiCl4·6H2O、30 mg/L 3,4-二羟基苯甲酸和20 mg/L生物素，另添加40 g/L葡萄糖和25 μg/mL卡那霉素。
补料分批发酵在2.5-L生物反应器（KoBiotech Co., Incheon, Korea）中进行，工作体积1 L CGXII培养基，含45 g/L葡萄糖和25 μg/mL卡那霉素，温度30°C、pH 7.0。初始葡萄糖耗尽后，以5.7 g/L/h的速率连续流加含600 g/L葡萄糖和20 g/L MgSO4的补料溶液。整个培养过程维持搅拌转速1000 rpm、通气速率2 vvm。通过添加2 N HCl和氨水将酸度控制在pH 6.9–7.1。
【数据】LB培养基：5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl；卡那霉素：50 mg/L（E. coli）/25 μg/mL（C. glutamicum）；批次培养：30°C、250 rpm、100 mL/500 mL摇瓶；CGXII含40 g/L葡萄糖；补料分批：2.5-L反应器、1 L工作体积、45 g/L初始葡萄糖、补料600 g/L葡萄糖+20 g/L MgSO4、流速5.7 g/L/h、1000 rpm、2 vvm、pH 6.9–7.1、30°C
2.3 薄层色谱与凝胶电泳
酶促反应产物的薄层色谱（TLC）分析参照先前研究并进行部分修改。简言之，琼脂糖降解样品点在硅胶60（Merck, Darmstadt, Germany）板上，以正丁醇/乙醇/水（3:1:1，v/v/v）为展开剂分离45 min。干燥后的薄板喷洒含10%（v/v）H2SO4和0.2%（w/v）1,3-二羟基萘（Sigma-Aldrich）的乙醇溶液进行斑点显色，90°C加热1 min。含nabh基因的重组谷氨酸棒状杆菌表达的蛋白质通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离和可视化。制备粗蛋白溶液时，将摇瓶批次培养的谷氨酸棒状杆菌细胞收集并调整干重（DCW）至6 g/L。细胞沉淀悬浮于100 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.0），经超声波破碎仪（Cole-Parmer, IL, USA）破碎后收集上清液，用于12%聚丙烯酰胺SDS-PAGE分析。蛋白质用考马斯亮蓝染色。
【数据】TLC展开剂：正丁醇/乙醇/水=3:1:1（v/v/v）；展开时间：45 min；显色剂：10% H2SO4+0.2% 1,3-二羟基萘乙醇溶液；加热：90°C、1 min；SDS-PAGE：12%聚丙烯酰胺；细胞浓度：DCW 6 g/L；缓冲液：100 mM磷酸钠（pH 7.0）
2.4 细胞浓度、糖浓度及mRNA表达分析
细胞浓度通过分光光度计（Ultrospec 8000, GE Healthcare Co., USA）测定600 nm波长处的光密度（OD）确定。DCW通过OD乘以预定的换算系数0.42 g/L/OD获得。为获得OD与DCW之间的换算系数，将工程谷氨酸棒状杆菌在CGXII培养基中培养，细胞经10,000 rpm离心收集，随后用蒸馏水洗涤两次。洗涤后的细胞沉淀悬浮于蒸馏水中制备不同光密度的悬液。悬液经干燥的醋酸纤维素膜（Cat. No. 66191, GN-6 Metricel grid 0.45μm, Life Science Co. U.S.A.）过滤。过滤后含湿细胞的膜在80°C干燥2 h，称量干细胞重量。干燥和称重过程重复至重量恒定。绘制OD与对应DCW之间的线性曲线后，以线性曲线斜率作为换算系数用于DCW测定。
葡萄糖和乳酸浓度通过配备Rezex ROA-有机酸柱（Phenomenex Inc., Torrance, CA, USA）的高效液相色谱（HPLC；Agilent Technologies 1200 series, Santa Clara, CA, USA）测定。色谱柱加热至60°C，以5 mM H2SO4为流动相，流速0.6 mL/min。半乳糖、NAB和AHG通过同一HPLC系统配备RPM单糖柱（8 μm, 300 mm × 7.8 mm, Phenomenex Inc., USA）分析，柱温75°C，以双蒸水为流动相，流速0.6 mL/min。使用示差折光检测器进行检测。NAB标准品（Cat. No. ON29863）和AHG标准品（Cat. No. DBA25155）购自Biosynth Co.（United Kingdom）。
为定量nabh基因表达水平，使用CFX96 Touch Deep Well实时荧光定量PCR检测系统（Bio-Rad Co. U.S.A.）进行实时定量PCR（RT-PCR）。反应终体积20 μL，含10 μL SYBR Green 2×（Bio-Rad Co. U.S.A.）、2 μL cDNA和引物对。分别使用High Pure RNA Isolation Kit（Roche Co., U.S.A.）和RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific Co., U.S.A.）从C. glutamicum ATCC13032和CG-H4-NABH中提取mRNA和合成cDNA。nabh基因表达分析使用正向引物ATGAGCGATTCAAAAGTAAATAAAA和反向引物TTATACTGCTCCGGAATCGCCTG。内参基因（act1）分析使用正向引物AGTTAACCCCGGCAGTTTCT和反向引物GTTCGTCCCTTGTGGTCTGT。定量RT-PCR热循环条件如下：95°C 3 min；随后30个循环的95°C 10 s和55°C 1 min；随后进行65°C至95°C的熔解曲线分析。
【数据】OD-DCW换算系数：0.42 g/L/OD；离心：10,000 rpm；膜干燥：80°C、2 h；HPLC条件（有机酸柱）：60°C、5 mM H2SO4、0.6 mL/min；HPLC条件（单糖柱）：75°C、双蒸水、0.6 mL/min；RT-PCR体系：20 μL（10 μL SYBR Green 2×、2 μL cDNA）；热循环：95°C 3 min→30×（95°C 10 s + 55°C 1 min）→熔解曲线65–95°C
2.5 藻源NAB制备与NABHase活性测定
干燥红藻（Gelidium amansii）购自Pharmsville Co.（Korea），与10 mM Tris缓冲液按15%（w/v）比例混合，130°C孵育75 min。为制备水解预处理红藻的粗酶，将E. coli BL21(DE3)/pET21a-aga50D在LB培养基中于37°C、200 rpm培养。经终浓度1 mM的IPTG诱导12 h后收集细胞，悬浮于20 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.0）。超声破碎后，通过离心收集含Aga50D（来自S. degradans 2–40的外切型β-琼脂酶）的粗酶提取液。为酶解预处理红藻并生产NAB，将粗Aga50D酶液与终浓度1.5%（w/v）的预处理藻粉在20 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.0）中混合，于30°C、200 rpm反应24 h。TLC分析步骤同前。
【数据】藻粉浓度：15%（w/v）于10 mM Tris缓冲液；预处理：130°C、75 min；IPTG诱导：1 mM、12 h；Aga50D酶解：1.5%（w/v）底物、20 mM Tris-HCl（pH 7.0）、30°C、200 rpm、24 h
图1 NAB水解及AHG生产的示意图：（a）全细胞，（b）通透化全细胞，（c）通透化固定化全细胞催化体系。粗线和虚线分别表示细胞膜和固定化材料。
图2 NABHase在重组谷氨酸棒状杆菌中的表达。（a）粗酶的SDS-PAGE分析，箭头指示理论分子量43 kDa的NABHase蛋白条带；泳道编号：1，含pCES208L10质粒的谷氨酸棒状杆菌；2–7，含不同启动子质粒的重组菌株。（b）不同启动子下NABHase酶活比较。（c）CG-H4-NABH的补料分批发酵曲线。
研究结果
3.1 NABHase在重组谷氨酸棒状杆菌中的异源表达
L-赖氨酸生产菌谷氨酸棒状杆菌是公认安全（GRAS）的微生物，已被广泛用作多种生物化学品的生产宿主。为开发NAB水解和AHG生产的全细胞催化体系，构建了表达来源于S. degradans 2–40的NABHase酶的重组谷氨酸棒状杆菌菌株。为实现不同表达水平的S. degradans nabh基因组成型表达，设计了转录强度各异的合成组成型启动子L10、L26、I16、I29、H4和H36，置于nabh基因上游。重组谷氨酸棒状杆菌菌株在BHI培养基中培养12 h，各粗蛋白提取物进行SDS-PAGE分析。如图2a所示，在理论分子量43 kDa处鉴定到NABHase蛋白条带。综合考虑NABHase条带密度，H4启动子在重组谷氨酸棒状杆菌中给出了最高的NABHase蛋白表达水平。
为直接确认H4启动子控制下nabh基因的存在和表达，对C. glutamicum ATCC 13032及其含pCES208H4NABH质粒的重组菌株进行了定量RT-PCR分析。如图S1所示，野生型C. glutamicum ATCC 13032中未检测到nabh基因的mRNA，而含pCES208H4NABH质粒的重组谷氨酸棒状杆菌中观察到高强度的nabh基因表达。为进一步定量分析，六个重组菌株在含40 g/L葡萄糖的CGXII培养基中进行批次培养，所有菌株的细胞生长、葡萄糖消耗和乳酸生成均呈现相似模式（图S2）。NABHase的表达受组成型启动子控制，因此NABHase活性在整个批次培养过程中逐渐增加。最终，H4启动子表现出最高的酶活（16.3 ± 0.87 U/mL）和比酶活（0.76 ± 0.05 U/mg），分别比其他启动子相应值高2–7倍（图2b）。
合成H4启动子在绿色荧光蛋白于谷氨酸棒状杆菌中表达的研究中被认为是一种强启动子，与本研究中的NABHase表达情况相似。为获得大量NABHase，对含pCES208H4NABH质粒的重组谷氨酸棒状杆菌（命名为CG-H4-NABH）进行了补料分批培养（图2c）。批次阶段结束后流加浓缩葡萄糖溶液，细胞呈指数生长，DCW最终达到71.8 g/L。与批次培养（图S2）相比未产生乳酸，表明整个补料培养过程中有氧条件维持良好。由于H4启动子的组成型表达特性，NABHase表达随细胞生长而增加。最终在补料分批培养84 h时获得58.9 U/mL的酶活，是批次培养的3.6倍。通过补料分批策略培养的CG-H4-NABH重组细胞用于后续全细胞催化工艺的开发。
【数据】NABHase理论分子量：43 kDa；H4启动子批次培养酶活：16.3 ± 0.87 U/mL；比酶活：0.76 ± 0.05 U/mg；H4比其他启动子高2–7倍；补料分批DCW：71.8 g/L；补料分批酶活：58.9 U/mL（84 h）；补料分批/批次酶活比：3.6倍
3.2 NABHase及工程谷氨酸棒状杆菌全细胞生产AHG
在琼脂糖降解途径中，NABHase被认为是将琼脂糖完全解聚为AHG和半乳糖的关键酶。为确认NABHase酶和工程谷氨酸棒状杆菌CG-H4-NABH全细胞催化剂能否将琼脂水解液中的NAB解聚为AHG和半乳糖，对各反应混合物进行了TLC分析。为制备作为AHG生产底物的NAB，将预处理红藻（图3a中F1）与表达Aga50D的重组大肠杆菌产生的粗酶反应。产物（图3a中F2）与NAB标准品具有相同的保留时间，表明Aga50D酶有效水解了预处理红藻并主要产生NAB。为评估NABHase的作用，将NAB分别与不含或含NABHase的谷氨酸棒状杆菌粗酶和全细胞反应。作为对照，野生型谷氨酸棒状杆菌的粗酶（图3a中F3）和全细胞（图3a中F4）与NAB反应均未产生AHG。
图3 含或不含NABHase表达的谷氨酸棒状杆菌粗酶和全细胞催化琼脂糖降解产物的薄层色谱分析。（a）红藻水解液终产物比较：F1，预处理琼脂；F2，F1与Aga50D酶反应液；F3和F4，F2分别与野生型谷氨酸棒状杆菌粗酶和全细胞反应液；F5和F6，F2分别与CG-H4-NABH粗酶和全细胞反应液。（b）粗酶和（c）全细胞催化NAB水解和AHG生产的时间过程。
相比之下，当NAB与CG-H4-NABH粗酶反应时，图3a中F5泳道出现了AHG斑点，表明NABHase在重组谷氨酸棒状杆菌中正确表达。此外，当CG-H4-NABH菌株的全细胞与NAB反应时（图3a中F6），也从NAB生产了AHG。为比较酶法与全细胞工艺之间的水解效率，使用CG-H4-NABH的粗酶和全细胞进行了NAB水解和AHG生产的时间过程反应。如图3b所示，粗NABHase酶反应30 min内，初始添加的大部分NAB即被水解为AHG。当使用CG-H4-NABH全细胞作为生物催化剂时（图3c），NAB在1 h后开始减少并在整个反应过程中逐渐被水解为AHG。NAB在约5 h的反应中被完全水解为AHG，比粗酶反应时间长6倍。
关于谷氨酸棒状杆菌中包括NAB在内的二糖特异性转运，由葡萄糖和果糖组成的蔗糖通过蔗糖特异性的磷酸烯醇式丙酮酸：糖磷酸转移酶系统（PTS）转运。尽管谷氨酸棒状杆菌通过固有的内源性β-半乳糖苷酶水解由葡萄糖和半乳糖组成的胞内乳糖，但由于缺乏乳糖特异性转运蛋白LacY，谷氨酸棒状杆菌无法在以乳糖为唯一碳源的培养基中生长。考虑到谷氨酸棒状杆菌的糖转运特性和NAB在自然界中的非典型二糖属性，推测细胞膜可能阻止NAB二糖进入细胞，从而限制了位于细胞内的NABHase对NAB的可及性。NAB进入细胞催化剂的转运障碍可能是从NAB二糖高效生产AHG的主要瓶颈，这一问题在后续研究中通过细胞膜通透化处理得到缓解。
【数据】粗酶完全水解NAB时间：30 min内；全细胞完全水解NAB时间：约5 h；全细胞/粗酶反应时间比：6倍
3.3 细胞通透化对NAB水解和AHG生产的影响
如图3所示，全细胞生产AHG比NABHase酶反应更为延迟，原因是谷氨酸棒状杆菌中不存在NAB二糖特异性转运系统，且疏水性细胞膜屏障阻断了亲水性碳水化合物NAB的转运。已有研究报道，化学或机械细胞通透化处理可促进小分子跨细胞壁转运。一些去污剂（Tween 20、Tween 80和Triton X-100）、溶剂（丙酮、氯仿和甲苯）、盐类（NaCl和MgCl2）以及化学试剂（EDTA、二巯基丁二酸和聚乙烯亚胺）的处理通过改善底物和产物跨细胞膜的转运提高了生物分子的产量。
为克服碳水化合物转运的固有难题从而提高CG-H4-NABH细胞的NAB水解能力，采用去污剂和溶剂处理进行细胞通透化。经Tween 80、Span 80、Span 20和甲苯处理的细胞分别与NAB反应。TLC分析（图S3）显示，Tween 80对通透化无效，Span 80和Span 20处理的细胞在7 h反应中逐渐将NAB解聚为AHG。而经20%甲苯处理的细胞在1 h内将NAB完全水解（图S3d）。
图4 重组谷氨酸棒状杆菌CG-H4-NABH全细胞催化剂的膜通透化（a、b）和细胞固定化（c、d、e）制备。（a）去污剂和溶剂处理后的相对NABHase活性。（b）甲苯浓度对NAB水解活性的影响。
【数据】20%甲苯处理：1 h内完全水解NAB；Span 80/Span 20处理：7 h内逐渐水解NAB；Tween 80处理：无效
图5 （a）反应温度和（b）pH对NAB水解活性的影响，以及（c）35°C下通透化（○）和通透化-固定化（●）重组谷氨酸棒状杆菌CG-H4-NABH全细胞的热失活曲线。各实验中的最大活性记为100%相对活性。
图6 通透化游离细胞（○，白柱）和通透化-固定化细胞（●，黑柱）七轮重复全细胞反应中NAB水解和红藻水解液AHG生产的过程。每轮NAB水解率和累积AHG浓度如图所示。
【数据】甲苯浓度效应：原文详述于图4b；温度/pH/热稳定性：详见原文图5；重复批次：详见原文图6
讨论与解读
本研究成功开发了表达NABHase的重组谷氨酸棒状杆菌全细胞催化体系，作为酶法工艺的替代方案用于高效NAB水解和AHG生产。通过基因工程、补料分批发酵以及细胞通透化和固定化策略的综合运用，该全细胞体系在长期重复批次NAB水解中表现出更高的累积AHG产量。此全细胞工艺可推广应用于其他二糖和寡糖的水解。
编译者解读：本研究以食品级安全菌株谷氨酸棒状杆菌为底盘，巧妙绕过了二糖转运障碍——既然NAB进不了细胞，就用甲苯把膜“打开”，让底物直接接触胞内酶。这种通透化策略与固定化技术联用，兼顾了活性提升与细胞重复使用性。值得注意的是，甲苯虽有效，但其有机溶剂残留问题在食品级AHG生产中仍需审慎评估。该策略对海洋多糖高值化利用具有参考价值，但距离产业化还需解决通透化试剂的食品安全性验证与放大工艺优化。
DOI: 10.1016/j.foodres.2025.116924